Préparation du visage à la souris
Summary
Une procédure pour fabriquer des préparations en face de l'artère carotide et de l'aorte de la souris est décrite. De telles préparations, lorsqu'elles sont colorées par immunofluorescence avec des anticorps spécifiques, nous permettent d'étudier la localisation des protéines et l'identification des types de cellules dans toute la paroi vasculaire par microscopie confocale.
Abstract
Les sections de tissus intégrés à la paraffine sont habituellement utilisées pour étudier l'histologie tissulaire et l'histopathologie. Cependant, il est difficile de déterminer quelles sont les morphologies tissulaires tridimensionnelles issues de ces sections. En outre, les sections de tissus examinés peuvent ne pas contenir la région dans le tissu qui est nécessaire aux fins de l'étude en cours. Cette dernière limitation entrave les études histopathologiques des vaisseaux sanguins, car les lésions vasculaires se développent de manière focalisée. Cela nécessite une méthode qui nous permet d'examiner une large zone de la paroi des vaisseaux sanguins, de sa surface à des régions plus profondes. Une préparation complète des vaisseaux sanguins répond à cette exigence. Dans cet article, nous allons démontrer comment faire des préparations en face de l'aorte de la souris et de l'artère carotide et les tacher immunofluorescents pour la microscopie confocale et d'autres types d'imagerie à base de fluorescence.
Introduction
Pour les études histopathologiques par microscopie optique, des morceaux tridimensionnels de tissus biologiques sont systématiquement traités pour l'emboîtement de la paraffine, suivis d'une coupe et d'une coloration. Un échantillon de tissu qui a été encastré en paraffine peut être plusieurs millimètres dans les trois dimensions. Cependant, dans le but de la microscopie optique, il faut d'abord sectionner afin que la lumière puisse passer et ensuite tachée afin que la section mince donne suffisamment de contraste pour l'imagerie. Parce que les spécimens sectionnés ont généralement une épaisseur de 5 à 10 μm, on ne voit qu'une très petite fraction de l'échantillon entier en deux dimensions à la fois. Il est possible de collecter des sections séquentielles et, après l'imagerie de chaque section individuellement, effectuer une reconstruction assistée par ordinateur des images 3D, mais il s'agit d'un travail fastidieux en effet. L'histopathologie des vaisseaux sanguins, en particulier pour l'étude de la pathogenèse de l'athérosclérose, présente des problèmes uniques. L'athérosclérose est une maladie focalisée qui se développeLocalement dans les zones où survient le flux sanguin perturbé. En outre, la maladie est initiée dans l'intima, un tissu mince consistant en une monocouche de cellules endothéliales et une matrice extracellulaire, de grandes artères. Pour ces raisons, il est difficile de localiser et d'étudier les lésions précoces en utilisant des vaisseaux sanguins sectionnés car on peut facilement manquer de sectionner la lésion. Même si une section comprend une zone malade, on ne verra qu'une portion de 5 à 10 μm contenant des cellules endothéliales et d'autres cellules de la paroi vasculaire dans les médias et l'adventice.
Les préparations en montage intégral (prononcé än fäs) nous permettent d'examiner une vaste zone de la surface des vaisseaux sanguins, telle que l'aorte entière de la racine aortique jusqu'à l'artère iliaque commune. En utilisant un tel échantillon coloré avec des anticorps spécifiques et d'autres sondes spécifiques, on peut cerner l'emplacement des lésions et aussi où divers événements moléculaires se produisent dans les cellules endothéliales en conjonction avecThétéogenèse telle que les changements dans l'expression, la localisation et les modifications postraductionnelles des protéines. En plus d'étudier l'athérogenèse, la forme de la cellule endothéliale observée dans les préparations en visage est utilisée comme indicateur du taux de flux sanguin dans la moyenne régionale. De telles données sont importantes pour l'étude de la mechanosignaling des cellules endothéliales in situ. À cette fin, les vaisseaux sanguins histologiques systématiques ne sont pas utiles. Ainsi, pour la médecine vasculaire et la biologie, il est particulièrement important d'acquérir une technique pour fabriquer des préparations en face des vaisseaux sanguins qui permet d'observer une grande surface de la surface du vaisseau ainsi que les zones souterraines profondes du vaisseau.
Comme l'ont décrit Jelev et Surchev 1 , les biologistes vasculaires ont développé diverses méthodes pour observer le revêtement des vaisseaux sanguins en face. Des méthodes ingénieuses ont été développées dans les années 1940 et 1950. En utilisant ces méthodes, ils étaient Capable d'étudier l'organisation fondamentale des cellules endothéliales qui bordent la surface interne des vaisseaux sanguins. Cependant, en raison de la façon dont ces préparations en face sont préparées (la soi-disant méthode Hautchen 2 , 3 , 4 ou décollage de la surface du vaisseau 5 ) et la façon dont l'échantillon a été coloré, il n'a pas toujours été possible d'obtenir une morphologie ininterrompue Des informations provenant de la surface du vaisseau dans les zones plus profondes de la paroi des vaisseaux sanguins. La préparation complète des vaisseaux de montage en face combinée à la coloration par immunofluorescence nous a permis non seulement d'étudier la morphologie des cellules endothéliales et l'expression et la localisation des protéines dans ces cellules, mais aussi d'étendre ces études à la région sous-endothéliale de la paroi vasculaire. Les premières études utilisant des préparations de vaisseaux sanguins en visage, des immunodilures colorés ont commencé à apparaître dans les années 1980 6 ,F "> 7. Avec l'avènement de la microscopie confocale à balayage laser et plus récemment la microscopie multiphotonique, on peut maintenant obtenir des images claires et claires de la structure de la paroi des vaisseaux sanguins dans des échantillons de vaisseaux endurcis à l'immunofluorescence ainsi que dans le réseau vasculaire des animaux vivants 8 , 9 , 10 , 11. Ces techniques d'imagerie par ordinateur créent des images en coupe optique focalisées et, en empilant ces images, on peut obtenir des images 3D reconstruites de la paroi du vaisseau et du réseau vasculaire dans les tissus. Peut générer des images d'une section réalisée le long de l'axe Z de l'image reconstruite 12 , 13 .
Dans cet article, nous allons illustrer un procédé pour préparer des préparations en face de l'aorte de la souris et de l'artère carotide pour la coloration immunofluorescente. Préparations de visagePeuvent être réalisés même après que ces navires aient été expérimentalement manipulés. Par exemple, une artère carotide peut être partiellement ligaturée, puis une préparation en face faite après une telle intervention chirurgicale. Pour cette raison, nous décrirons également dans cet article comment on fait une ligature partielle sur l'artère carotide. Par rapport à la fabrication de préparations similaires à partir d'animaux plus grands tels que les rats, les lapins et les humains, les vaisseaux de souris sont de petite taille et plus fragiles, ce qui nécessite des soins supplémentaires pour la manipulation lors de l'isolement chirurgical des vaisseaux et leur préparation pour la coloration et la microscopie des anticorps. Étant donné que le modèle animal le plus couramment utilisé pour la modification génétique est la souris, il devient essentiel pour de nombreux chercheurs de manipuler les vaisseaux de souris sans les endommager. Dans ce manuscrit, nous décrirons comment traiter les vaisseaux sanguins de souris lors de préparations en face de l'aorte de la souris et de l'artère carotide. Aux fins de la démonstration, nous utiliserons des souris de type sauvage C57 / b6.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lors de la manipulation des vaisseaux sanguins de la souris, il est important de se rappeler que l'endothélium est fragile et que toute force mécanique excessive endommage les cellules endothéliales. Par exemple, les cellules endothéliales se cassent ou se détachent de la paroi du vaisseau si le vaisseau est perfusé avec trop de force, ce qui peut se produire facilement lorsque la vascularisation est perfusée à l'aide d'une seringue à main.
Pour obtenir une pression de p…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les activités de recherche des auteurs sont soutenues par des subventions de l'Institut national de la santé au Dr Abe (HL-130193, HL-123346, HL-118462, HL-108551).
Materials
| 0.9% Sodium Chloride injection solution USP 500ml bag | Fisher Scientific | NC9788429 |
| 12-well plates | Fisher Scientific | 12556005 |
| 6-0 coated vicryl suture | Ethicon | J833G |
| AF488 goat anti-rat IgG | Life Technologies | A11006 |
| AF546 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies | A11035 |
| Anti-CD144 (Ve-Cad) | BD Biosciences | BD555289 |
| Anti-VCAM-1 (H-276) Rabbit polyclonal IgG | Santa Cruze Biotechnology | Sc-8304 |
| Aoto Flow System | Braintree Scientific | EZ-AF9000 |
| Autoclave Wrap. 24x24in | Cardinal Health | 4024 |
| Blunt retractors, 2.5mm wide | Fine Science Tools | 18200-10 |
| Caprofen (Rimadyl) | zoetis | NADA#141-199 |
| Chlorhexidine Scrub, 2% | Med-Vet International | RXCHLOR2-PC |
| Curity gauze sponges 2×2 | Cardinal Health | KC2146 |
| Electric heating pad, 12X14 | Fisher Scientific | NC0667724 |
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11152-10 |
| Iris Scissors | Fine Science Tools | 14090-11 |
| Micro cover glass 22x50mm | VWR | 48393059 |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-18 |
| normal goat serum | Equitech-Bio | GS05 |
| Paraformaldehyde Solution 4% in PBS | Santa Cruze Biotechnology | SC-281692 |
| Petri Dishes 100x15mm | Fisher Scientific | FB0875713 |
| Prolong Gold Antifade mountant with DAPI | Life Technologies | P-36935 |
| Puritan cortton swabs | VWR | 10806-005 |
| Puritan Mini cotton tipped aplicators | VWR | 82004-050 |
| Round handled Needle Holder | Fine Science Tools | 12076-12 |
| Silk Suture 6/0 | Fine Science Tools | 18020-60 |
| Spring scissors | ROBOZ | RS-5601 |
| Strabismus Scissors | Fine Science Tools | 14075-09 |
| Super Grip Forceps | Fine Science Tools | 00649-11 |
| Transparent Dressing | Cardinal Health | TD-26C |
| Triton X-1000 | Fisher Scientific | AC327371000 |
References
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