En Face Preparazione delle navi sanguigne del mouse
Summary
Viene descritta una procedura per preparare preparazioni in faccia della arteria e dell'arto carotide del topo. Tali preparati, quando vengono colorati immunofluorescenti con anticorpi specifici, ci permettono di studiare la localizzazione delle proteine e l'identificazione dei tipi di cellule nell'intera parete vascolare tramite la microscopia confocale.
Abstract
Sezioni di tessuti embedded di paraffina vengono utilizzati abitualmente per lo studio dell'istologia del tessuto e dell'istopatologia. Tuttavia, è difficile determinare ciò che la morfologia tissutale tridimensionale deriva da tali sezioni. Inoltre, le sezioni dei tessuti esaminati non possono contenere la regione all'interno del tessuto necessaria ai fini dello studio in corso. Questa ultima limitazione ostacola gli studi istopatologici dei vasi sanguigni poiché le lesioni vascolari si sviluppano in modo focalizzato. Ciò richiede un metodo che ci permette di rilevare un'ampia area della parete del vaso sanguigno, dalla sua superficie fino alle regioni più profonde. Una preparazione completa dei vasi sanguigni è in grado di soddisfare questo requisito. In questo articolo dimostreremo come fare preparazioni in faccia dell'arte del topo e dell'arteria carotide e di immunofluorescenziarle per la microscopia confocale e altri tipi di immagini a base di fluorescenza.
Introduction
Per gli studi istopatologici mediante microscopia leggera, i pezzi tridimensionali di tessuti biologici sono trattati in modo ordinario per l'embedment di paraffina seguito da sezionamento e colorazione. Un campione di tessuto che è stato incorporato in paraffina può essere di parecchi millimetri in tutte e tre le dimensioni. Tuttavia, ai fini della microscopia leggera, deve essere prima sezionato in modo che la luce possa passare e poi venire macchiata in modo che la sezione sottile abbia abbastanza contrasto per l'imaging. Poiché gli esemplari tagliati sono di solito 5-10 μm di spessore, si vede solo una frazione molto piccola dell'intero campione in due dimensioni alla volta. È possibile raccogliere sezioni sequenziali e, dopo l'imaging di ogni sezione singolarmente, eseguire la ricostruzione assistita da computer delle immagini 3D, ma in realtà è un lavoro noioso. L'istopatologia dei vasi sanguigni, specialmente per studiare la patogenesi dell'aterosclerosi, presenta problemi unici. L'aterosclerosi è una malattia focalizzata che si sviluppaLocalmente in aree dove si verifica un flusso sanguigno disturbato. Inoltre, la malattia è iniziata nell'intima, un tessuto sottile costituito da un monostrato di cellule endoteliali e matrice extracellulare, di grandi arterie. Per queste ragioni, è una sfida per individuare e studiare le lesioni precoci utilizzando vasi sanguigni sezionati perché si può facilmente perdere la sezione della lesione. Anche se una sezione comprende un'area malata, si vedrà solo una porzione di 5-10 μm contenente cellule endoteliali e altre cellule della parete vascolare nei media e nell'adventitia.
Il tutto in faccia (pronunciato än fäs) i preparativi ci permettono di esaminare un'ampia area della superficie del vaso sanguigno come l'intero aorta dalla radice aortica fino alla comune arteria iliaca. Utilizzando un simile campione colorato con anticorpi specifici e altre sonde specifiche, si può individuare la localizzazione delle lesioni e anche dove si verificano vari eventi molecolari nelle cellule endoteliali congiuntamente wiAterogenesi come i cambiamenti nell'espressione, localizzazione e modificazioni posttranslazionali delle proteine. Oltre a studiare l'aterogenesi, la forma delle cellule endoteliali osservate nelle preparazioni en faccia viene utilizzata come indicatore del pattern di flusso sanguigno regionale. Tali dati sono importanti per studiare la meccanosignazione delle cellule endoteliali in situ. A questo scopo, non sono utili i vasi sanguigni a sezione trasversale istologica. Pertanto, per la medicina vascolare e la biologia, è particolarmente importante acquisire una tecnica per preparare preparazioni en vena dei vasi sanguigni che consente di osservare un'ampia area della superficie del vascello così come le aree più profonde del sottosuolo.
Come rivisto da Jelev e Surchev 1 , i biologi vascolari hanno sviluppato diversi metodi per osservare la fodera dei vasi sanguigni in faccia. Alcuni metodi ingegnosi furono sviluppati negli anni '40 e '50. Usando questi metodi, sono stati In grado di studiare l'organizzazione fondamentale delle cellule endoteliali che fanno riferimento alla superficie interna dei vasi sanguigni. Tuttavia, a causa del modo in cui queste preparazioni sono preparate (il cosiddetto metodo Hautchen 2 , 3 , 4 o il peeling off della superficie del vaso 5 ) e il modo in cui il campione è stato macchiato, non è stato sempre possibile ottenere morfologie ininterrotte Informazioni dalla superficie del vaso nelle zone più profonde della parete del vaso sanguigno. La preparazione completa del vaso di faccia combinata con la colorazione dell'immunofluorescenza ci ha consentito non solo di studiare la morfologia delle cellule endoteliali e l'espressione e la localizzazione delle proteine in queste cellule, ma anche estendere tali studi alla regione subendoteliale della parete del vaso. Studi iniziali che utilizzano vasi sanguigni in faccia preparati macchiati immunoflurezzi cominciarono a apparire negli anni '80 ,F "> 7. Con l'avvento della microscopia confocale a scansione laser e della microscopia multifotonica di recente, è ora possibile ottenere immagini chiare in focus della struttura della parete dei vasi sanguigni in campioni vascolari immunofluorescenti e vascolari in animali vivi 8 , 9 , 10 , 11. Queste tecniche di imaging basate su computer creano immagini a sezione ottica in focus e, impilando tali immagini, è possibile ottenere immagini ricostruite 3D della parete del vascello e della rete vascolare nei tessuti. Può generare immagini di una sezione realizzata lungo l'asse Z dell'immagine ricostruita 12 , 13 .
In questo articolo, illustreremo un metodo per la preparazione delle preparazioni in faccia del aorta del topo e dell'arteria carotide per la colorazione immunofluorescenti. I preparativi per il visoPuò essere fatto anche dopo che queste navi sono state manipolate in modo sperimentale. Ad esempio, un'arteria carotide può essere legata parzialmente e quindi una preparazione in faccia eseguita dopo una tale operazione. Per questo motivo, descriveremo anche in questo articolo come facciamo una legatura parziale sull'arteria carotidea. Rispetto alla fabbricazione di preparati simili da animali di grandi dimensioni, come ratti, conigli e umani, i recipienti del mouse sono di taglia piccola e più fragili, richiedendo così una maggiore cura per la manipolazione durante l'isolamento chirurgico dei vasi e preparandoli per la colorazione degli anticorpi e la microscopia. Poiché il modello animale più comunemente utilizzato per la modifica genetica è il topo, diventa critico per molti investigatori di gestire i vasi del mouse senza danneggiarli. In questo manoscritto descriveremo come gestire i vasi sanguigni del mouse quando facciamo preparazioni in faccia dell'arte del topo e dell'arteria carotidea. Ai fini della dimostrazione, utilizzeremo i topi selvatici tipo C57 / b6.
Protocol
Representative Results
Discussion
Quando si manipolano con i vasi sanguigni del mouse, è importante ricordare che l'endotelio è fragile e che qualsiasi eccessiva forza meccanica danneggerà le cellule endoteliali. Ad esempio, le cellule endoteliali si rompono o si staccano dalla parete del vaso se la vasca viene perfusa troppo forte, cosa che può accadere facilmente quando la vasculatura viene perfusa usando una siringa a mano.
Per ottenere una pressione costante di perfusione, usiamo un sistema di perfusione gravitaz…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le attività di ricerca degli autori sono sostenute da sovvenzioni dell'Istituto Nazionale di Salute al Dr. Abe (HL-130193, HL-123346, HL-118462, HL-108551).
Materials
| 0.9% Sodium Chloride injection solution USP 500ml bag | Fisher Scientific | NC9788429 |
| 12-well plates | Fisher Scientific | 12556005 |
| 6-0 coated vicryl suture | Ethicon | J833G |
| AF488 goat anti-rat IgG | Life Technologies | A11006 |
| AF546 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies | A11035 |
| Anti-CD144 (Ve-Cad) | BD Biosciences | BD555289 |
| Anti-VCAM-1 (H-276) Rabbit polyclonal IgG | Santa Cruze Biotechnology | Sc-8304 |
| Aoto Flow System | Braintree Scientific | EZ-AF9000 |
| Autoclave Wrap. 24x24in | Cardinal Health | 4024 |
| Blunt retractors, 2.5mm wide | Fine Science Tools | 18200-10 |
| Caprofen (Rimadyl) | zoetis | NADA#141-199 |
| Chlorhexidine Scrub, 2% | Med-Vet International | RXCHLOR2-PC |
| Curity gauze sponges 2×2 | Cardinal Health | KC2146 |
| Electric heating pad, 12X14 | Fisher Scientific | NC0667724 |
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11152-10 |
| Iris Scissors | Fine Science Tools | 14090-11 |
| Micro cover glass 22x50mm | VWR | 48393059 |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-18 |
| normal goat serum | Equitech-Bio | GS05 |
| Paraformaldehyde Solution 4% in PBS | Santa Cruze Biotechnology | SC-281692 |
| Petri Dishes 100x15mm | Fisher Scientific | FB0875713 |
| Prolong Gold Antifade mountant with DAPI | Life Technologies | P-36935 |
| Puritan cortton swabs | VWR | 10806-005 |
| Puritan Mini cotton tipped aplicators | VWR | 82004-050 |
| Round handled Needle Holder | Fine Science Tools | 12076-12 |
| Silk Suture 6/0 | Fine Science Tools | 18020-60 |
| Spring scissors | ROBOZ | RS-5601 |
| Strabismus Scissors | Fine Science Tools | 14075-09 |
| Super Grip Forceps | Fine Science Tools | 00649-11 |
| Transparent Dressing | Cardinal Health | TD-26C |
| Triton X-1000 | Fisher Scientific | AC327371000 |
References
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