마우스 혈관의 얼굴 준비
Summary
마우스 경동맥 및 대동맥의 얼굴 준비를위한 절차가 설명된다. 특정 항체로 면역 형광으로 염색 될 때 그러한 조제 물은 우리가 공 촛점 현미경으로 전체 혈관 벽 내에서 단백질의 위치 및 세포 유형을 확인하는 것을 가능하게한다.
Abstract
파라핀 내장 조직 섹션은 조직 조직학 및 조직 병리학을 연구하는 데 일상적으로 사용됩니다. 그러나, 3 차원 조직 형태가 그런 절에서 무엇인지 결정하는 것은 어렵습니다. 또한 검사 된 조직의 섹션에는 진행중인 연구의 목적에 필요한 조직 내의 영역이 포함되지 않을 수 있습니다. 이러한 후자의 제한은 혈관 병변이 집중된 방식으로 발달하기 때문에 혈관의 조직 병리학 적 연구를 방해한다. 이것은 우리가 혈관 벽의 넓은 영역을 표면에서 더 깊은 영역까지 조사 할 수있게하는 방법을 필요로합니다. 혈관의 전면적 인 준비가이 요구 사항을 충족시킵니다. 이 기사에서는 마우스 대동맥과 경동맥의 안면 조영 및 공 촛점 현미경 및 형광 기반 이미징의 다른 유형을 면역 형광으로 조제하는 방법을 보여줍니다.
Introduction
광학 현미경에 의한 조직 병리학 적 연구를 위해, 파라핀 매입 (paraffin embedment) 및 절편 화 및 염색을 위해 생물학적 조직의 3 차원 조각을 통상적으로 처리한다. 파라핀이 묻혀있는 조직 샘플은 3 차원 모두 수 밀리미터가 될 수 있습니다. 그러나, 광학 현미경 검사의 목적을 위해, 빛이 통과 할 수 있도록 먼저 절단되어야하며, 따라서 얇은 부분이 이미징을 위해 충분한 대비를 생성하도록 염색되어야합니다. 절편 된 시편은 일반적으로 두께가 5-10 μm이기 때문에 한 번에 2 차원으로 전체 시편의 매우 작은 부분 만 볼 수 있습니다. 순차적 섹션을 수집하고 각 섹션을 개별적으로 이미징 한 후에 3D 이미지의 컴퓨터를 이용한 재구성을 수행 할 수는 있지만 실제로 지루한 작업입니다. 혈관의 조직 병리학, 특히 죽상 동맥 경화증의 병인 생리를 연구하는 데는 독특한 문제가 있습니다. 죽상 동맥 경화증은 발병하는 집중 질환입니다.혈류가 방해받는 곳에서 국부적으로 또한, 질병은 내막, 큰 동맥의 내피 세포와 세포 외 매트릭스의 단일 층으로 구성된 얇은 조직 내에서 시작됩니다. 이러한 이유 때문에 절개 된 혈관을 사용하여 초기 병변을 찾고 연구하는 것이 쉽지 않기 때문에 병변을 절개하지 못할 수 있습니다. 절에 병이있는 부분이 포함되어 있어도 배지 및 외막에 내피 세포와 기타 혈관벽 세포가 포함 된 5-10 μm 부분 만 보입니다.
전체 마운트 엉 얼굴 (발음 än fäs) 준비는 대동맥 뿌리부터 일반적인 장골 동맥까지 전체 대동맥과 같은 혈관 표면의 넓은 영역을 조사 할 수있게 해줍니다. 특정 항체 및 기타 특정 프로브로 염색 된 그러한 표본을 사용하여, 병변의 위치를 정확하게 지적 할 수 있으며, 또한 다양한 분자 이벤트가 내피 세포에서 발생하는 경우단백질의 발현, 국소화 및 번역 후 변형의 변화와 같은 아테롬 발생 (atherogenesis). atherogenesis를 연구하는 것 외에도 en face preparation에서 관찰 된 내피 세포 모양은 지역 시간 평균 혈류 패턴의 지표로 사용됩니다. 이러한 데이터는 원위치에서 내피 세포의 기계 신호를 연구하는 데 중요합니다. 이러한 목적으로, 일상적인 조직 학적 단면 혈관은 유용하지 않습니다. 따라서 혈관 약과 생물학에있어서 혈관의 표면을 넓게 관찰 할 수있는 혈관 조영 기술을 습득하는 것이 중요합니다.
Jelev와 Surchev 1 에 의해 검토 된 바와 같이 혈관 생물 학자들은 혈관의 안면을 관찰하기위한 다양한 방법을 개발했다. 일부 독창적 인 방법은 1940 년대와 1950 년대에 개발되었습니다. 이 방법을 사용하여 혈관의 내부 표면을 줄 지어주는 내피 세포의 기본 구성을 연구 할 수 있습니다. 그러나, 이러한 표면 준비가 준비되는 방법 (Hautchen 방법 2 , 3 , 4 또는 용기 표면 5 의 벗겨짐)과 표본이 염색되는 방식 때문에, 방해받지 않는 형태학을 얻는 것이 항상 가능하지는 않습니다 혈관 벽의 더 깊은 영역으로 혈관 표면의 정보. immunofluorescence 얼룩이 결합 된 전체 마운트 엉 얼굴 선박 준비는 우리뿐만 아니라 혈관 벽의 subendotial 지역에 이러한 연구를 확장 이러한 세포의 내피 세포 형태와 단백질 발현 및 지방화를 연구 할 수있었습니다. immunoflucently 스테인드 혈관 얼굴 준비를 사용하여 초기 연구 1980 년 6 월 에 나타나기 시작 ,f "> 7. 레이저 스캐닝 공 촛점 현미경 검사와 최근 다 광자 현미경 검사의 출현으로 면역 형광 염색 된 안면 혈관 샘플 및 살아있는 동물의 혈관 네트워크에서 혈관 벽 구조의 명확한 초점을 맞출 수 있습니다 이러한 컴퓨터 기반 영상 기법은 인 – 포커스 광학 단면 영상을 생성하고, 이러한 영상을 적층함으로써 조직 내에서 혈관 벽 및 혈관 네트워크의 재구성 된 3D 영상을 얻을 수있다. 또한, 재구성 된 이미지 (12 , 13) 의 Z- 축을 따라 만들어진 섹션의 이미지를 생성 할 수 있습니다.
이 기사에서는 면역 형광 염색을위한 마우스 대동맥과 경동맥의 대면 준비를위한 방법을 설명 할 것입니다. 얼굴 준비이 용기를 실험적으로 조작 한 후에도 만들 수 있습니다. 예를 들어, 경동맥을 부분적으로 결찰 한 다음 수술을 한 후 얼굴을 준비 할 수 있습니다. 이런 이유로 우리는이 기사에서 우리가 경동맥에 부분 연결을 어떻게하는지 설명 할 것입니다. 쥐, 토끼 및 인간과 같은 더 큰 동물에게서 유사한 준비를 만들기와 비교해, 쥐 배는 크기가 작아서 더 부서지기 쉽고, 따라서 혈관의 외과 단절 동안 핸들링과 항체 염색법과 현미경 검사를 위해 그들을 준비 할 필요가있다. 유전자 변형을 위해 가장 일반적으로 사용되는 동물 모델은 마우스이기 때문에 많은 연구자가 마우스 혈관을 손상시키지 않으면 서이를 처리하는 것이 중요합니다. 이 원고에서는 마우스 대동맥과 경동맥의 얼굴을 만들 때 마우스 혈관을 다루는 방법을 설명 할 것입니다. 데모 목적으로 야생형 C57 / b6 마우스를 사용합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
마우스 혈관을 취급 할 때, 내피가 부서지기 쉽고 과도한 기계적 힘이 내피 세포를 손상 시킨다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 예를 들어, 혈관이 수동으로 주사기를 사용하여 관류 될 때 쉽게 발생할 수있는 혈관이 너무 강하게 관류되는 경우 혈관벽에서 내피 세포가 깨지거나 분리됩니다.
일정한 관류 압력을 얻기 위해 우리는 120 cm의 수증기압을 갖는 중력 관류 시스?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자의 연구 활동은 국립 보건원 (National Institute of Health)의 Dr. Abe (HL-130193, HL-123346, HL-118462, HL-108551)의 보조금으로 지원됩니다.
Materials
| 0.9% Sodium Chloride injection solution USP 500ml bag | Fisher Scientific | NC9788429 |
| 12-well plates | Fisher Scientific | 12556005 |
| 6-0 coated vicryl suture | Ethicon | J833G |
| AF488 goat anti-rat IgG | Life Technologies | A11006 |
| AF546 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies | A11035 |
| Anti-CD144 (Ve-Cad) | BD Biosciences | BD555289 |
| Anti-VCAM-1 (H-276) Rabbit polyclonal IgG | Santa Cruze Biotechnology | Sc-8304 |
| Aoto Flow System | Braintree Scientific | EZ-AF9000 |
| Autoclave Wrap. 24x24in | Cardinal Health | 4024 |
| Blunt retractors, 2.5mm wide | Fine Science Tools | 18200-10 |
| Caprofen (Rimadyl) | zoetis | NADA#141-199 |
| Chlorhexidine Scrub, 2% | Med-Vet International | RXCHLOR2-PC |
| Curity gauze sponges 2×2 | Cardinal Health | KC2146 |
| Electric heating pad, 12X14 | Fisher Scientific | NC0667724 |
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11152-10 |
| Iris Scissors | Fine Science Tools | 14090-11 |
| Micro cover glass 22x50mm | VWR | 48393059 |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-18 |
| normal goat serum | Equitech-Bio | GS05 |
| Paraformaldehyde Solution 4% in PBS | Santa Cruze Biotechnology | SC-281692 |
| Petri Dishes 100x15mm | Fisher Scientific | FB0875713 |
| Prolong Gold Antifade mountant with DAPI | Life Technologies | P-36935 |
| Puritan cortton swabs | VWR | 10806-005 |
| Puritan Mini cotton tipped aplicators | VWR | 82004-050 |
| Round handled Needle Holder | Fine Science Tools | 12076-12 |
| Silk Suture 6/0 | Fine Science Tools | 18020-60 |
| Spring scissors | ROBOZ | RS-5601 |
| Strabismus Scissors | Fine Science Tools | 14075-09 |
| Super Grip Forceps | Fine Science Tools | 00649-11 |
| Transparent Dressing | Cardinal Health | TD-26C |
| Triton X-1000 | Fisher Scientific | AC327371000 |
References
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