En ansiktsbehandling av museblodfartøy

Summary

En fremgangsmåte for fremstilling av ansiktspreparater av muskelkarotidarterien og aorta er beskrevet. Slike preparater, når immunofluorescensfarget med spesifikke antistoffer, gjør det mulig for oss å studere lokalisering av proteiner og identifikasjon av celletyper i hele vaskulærveggen ved konfokal mikroskopi.

Abstract

Seksjoner av parafininkonstruert vev blir rutinemessig brukt til å studere vevshistologi og histopatologi. Det er imidlertid vanskelig å avgjøre hva den tredimensjonale vevsmorfologien er fra slike seksjoner. I tillegg kan de undersøkte delene av vev ikke inneholde regionen i vevet som er nødvendig for den pågående studien. Denne sistnevnte begrensningen hindrer histopatologiske studier av blodkar siden vaskulære lesjoner utvikles på en fokalisert måte. Dette krever en metode som gjør at vi kan undersøke et bredt område av blodkarveggen, fra overflaten til dypere områder. En helmontering og ansiktspreparasjon av blodkar oppfyller dette kravet. I denne artikkelen vil vi demonstrere hvordan man gjør ansiktspreparasjoner av musa aorta og karotisarterie og å immunofluorescently flekke dem for konfokal mikroskopi og andre typer fluorescensbasert bildebehandling.

Introduction

For histopatologiske studier ved lysmikroskopi behandles tredimensjonale biter av biologiske vev rutinemessig for paraffininduksjon etterfulgt av snitting og farging. En vevsprøve som har blitt paraffin-innebygd, kan være flere millimeter i alle tre dimensjoner. For lysmikroskopi må det imidlertid først snittes slik at lyset kan passere gjennom og deretter farget slik at den tynne delen gir nok kontrast til bildebehandling. Fordi snittprøver vanligvis er 5-10 μm tykkelse, ser man bare en liten del av hele prøven i to dimensjoner av gangen. Det er mulig å samle sekvensielle seksjoner og, etter å ha avbildet hvert enkelt avsnitt, utfører datamaskinassistert rekonstruksjon av 3D-bildene, men dette er en kjedelig jobb. Histopatologi av blodkar, spesielt for å studere patogenesen av aterosklerose, presenterer unike problemer. Aterosklerose er en fokalisert sykdom som utvikler segLokalt i områder hvor forstyrret blodstrøm forekommer. Dessuten initieres sykdommen i intima, et tynt vev bestående av et monolag av endotelceller og ekstracellulær matrise, av store arterier. Av disse årsakene er det en utfordring å lokalisere og studere tidlige lesjoner ved hjelp av seksjonerte blodårer, fordi man lett kan savne snittet av lesjonen. Selv om en seksjon inkluderer et sykt område, vil man kun se en 5-10 μm porsjon som inneholder endotelceller og andre vaskulære veggceller i media og adventitia.

Preparasjoner for hele fjellet og ansiktet (uttalte än fäs) gjør at vi kan undersøke et bredt område av blodkarets overflate som hele aorta fra aorta rotten helt ned til de vanlige iliac arteriene. Ved å bruke et slikt preparat som er farget med spesifikke antistoffer og andre spesifikke prober, kan man finne plasseringen av lesjoner og også hvor forskjellige molekylære hendelser forekommer i endotelceller i forbindelse medAtherogenesen som forandringer i ekspresjon, lokalisering og posttranslasjonelle modifikasjoner av proteiner. I tillegg til å studere atherogenese blir endotelcelleformen observert i en ansiktspreparat brukt som en indikator på det regionale tidsmessige blodstrømningsmønster. Slike data er viktige for å studere mekanosignalering av endotelceller in situ. For dette formål er rutinemessige histologiske tverrsnittede blodkar ikke nyttige. For vaskulær medisin og biologi er det derfor spesielt viktig å skaffe seg en teknikk for å lage ansiktspreparater av blodkar som gjør det mulig å observere et bredt område av fartøyets overflate samt dypere undergrunnsflater av fartøyet.

Som gjennomgått av Jelev og Surchev ¹ , har vaskulære biologer utviklet ulike metoder for å observere foringen av blodårene i ansiktet. Noen geniale metoder ble utviklet i 1940- og 1950-tallet. Ved hjelp av disse metodene var de Kunne studere den grunnleggende organisasjonen av endotelceller som linje den indre overflaten av blodårene. Imidlertid var det ikke alltid mulig å oppnå uforstyrret morfologisk grunnlag på grunn av måten disse preparatene fremstilles på (den såkalte Hautchen-metoden ^{2 , 3 , 4} eller avskalling av fartøyets overflate ⁵ ) og måten prøven ble farget på. Informasjon fra fartøyets overflate til de dypere områdene av blodkarveggen. Hele montering av ansiktsbeholderpreparat kombinert med immunfluorescensfarging tillot oss ikke bare å studere endotelcellemorfologi og proteinuttrykk og lokalisering i disse cellene, men også for å utvide slike studier til den subendoteliale regionen av karvegveggen. Tidlige studier ved bruk av blodkar og ansiktspreparater ble farget immunoflurescently begynte å dukke opp i 1980-tallet ^{6 ,}F "> 7. Med fremkomsten av laserskanning av konfokal mikroskopi og nyere mikrofonmikroskopi, kan man nå skaffe klare in-fokusbilder av blodkarets veggstruktur i immunfluorescently-stained en ansiktsbeholderprøver samt det vaskulære nettverket i levende dyr ^{8 , 9 , 10 , 11.} Disse datamaskinbaserte billedteknikkene skaper optiske snittbilder i fokus og ved å stable slike bilder kan man få rekonstruert 3D-bilder av fartøyets vegg og det vaskulære nettverket i vev. I tillegg er en Kan generere bilder av en seksjon laget langs Z-aksen til det rekonstruerte bildet ^{12 , 13} .

I denne artikkelen vil vi illustrere en metode for å forberede en ansiktspreparat av musaorta og halspulsåren for immunfluorescerende farging. En ansikts forberedelserKan gjøres selv etter at disse fartøyene har blitt manipulert eksperimentelt. For eksempel kan en halspulsårer være delvis ligert og deretter et ansiktspreparat fremstilt etter en slik operasjon. Av denne grunn vil vi også beskrive i denne artikkelen hvordan vi gjør en delvis ligering på halspulsåren. Sammenlignet med å lage lignende preparater fra større dyr som rotter, kaniner og mennesker, er musekar små i størrelse og mer skjøre, hvilket krever ekstra omsorg for håndtering under kirurgisk isolering av kar og forbereder dem for antistofffarging og mikroskopi. Fordi den mest brukte dyremodellen for genetisk modifikasjon er musen, blir det kritisk for mange etterforskere å håndtere muskasser uten å skade dem. I dette manuskriptet vil vi beskrive hvordan du skal håndtere museblodkar når du lager ansiktspreparater av musa aorta og karotisarterie. For demonstrasjonsformål vil vi bruke wild type C57 / b6 mus.

Protocol

Protokollene for mus-partiell carotidarterie-ligering og isolering av musaorta og karotisarterien for immunfarging i ansiktet er godkjent av Institutt for dyrepleie og bruk (IBT 2014-9231). 1. Venstre Partiell Carotid Artery Ligation Klargjør kirurgisk plass ved å plassere en 12 tommer x 14 tommers varmepute på bordet og dekke pute og bordplaten med en stor, ren kirurgisk drap. Juster armen på bommestativet slik at stereomikroskopets synsfelt ligger i midten av varmeputen. </l…

Representative Results

Et typisk en-ansikt immunofluorescensbilde av endotelet er vist i figur 3 . Dette bildet viser en enkelt optisk del av en musaorta tatt nær åpningen av en intercostal arterie (det store mørke eggformede området). Aorta ble dobbeltfarget med anti-VE-kadherin (grønt) og anti-VCAM-1 (vaskulær celleadhesjonsmolekyl-1) (rødt). Hver endotelcelle er skissert med en grønn lineær farging ved adherensforbindelsen. På grunn av mindre ujevnhet i prøven, er noen adherensfo…

Discussion

Når du håndterer museblodkar, er det viktig å huske at endotelet er skjøre, og at enhver overdreven mekanisk kraft vil skade endotelceller. Endotelcellene bryter for eksempel av eller løsner fra karveggen hvis karet blir perfusert for kraftig, noe som lett kan skje når karet blir perfusjonert ved hjelp av en hånddrevet sprøyte.

For å oppnå konstant perfusjonstrykk bruker vi et tyngdekraftsperfusjonssystem med 120 cm vannkolonne trykk. Det er blitt rapportert at det gjennomsnittlige…

Materials

0.9% Sodium Chloride injection solution USP 500ml bag	Fisher Scientific	NC9788429
12-well plates	Fisher Scientific	12556005
6-0 coated vicryl suture	Ethicon	J833G
AF488 goat anti-rat IgG	Life Technologies	A11006
AF546 goat anti-rabbit IgG	Life Technologies	A11035
Anti-CD144 (Ve-Cad)	BD Biosciences	BD555289
Anti-VCAM-1 (H-276) Rabbit polyclonal IgG	Santa Cruze Biotechnology	Sc-8304
Aoto Flow System	Braintree Scientific	EZ-AF9000
Autoclave Wrap. 24x24in	Cardinal Health	4024
Blunt retractors, 2.5mm wide	Fine Science Tools	18200-10
Caprofen (Rimadyl)	zoetis	NADA#141-199
Chlorhexidine Scrub, 2%	Med-Vet International	RXCHLOR2-PC
Curity gauze sponges 2×2	Cardinal Health	KC2146
Electric heating pad, 12X14	Fisher Scientific	NC0667724
Extra Fine Graefe Forceps	Fine Science Tools	11152-10
Iris Scissors	Fine Science Tools	14090-11
Micro cover glass 22x50mm	VWR	48393059
Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-18
normal goat serum	Equitech-Bio	GS05
Paraformaldehyde Solution 4% in PBS	Santa Cruze Biotechnology	SC-281692
Petri Dishes 100x15mm	Fisher Scientific	FB0875713
Prolong Gold Antifade mountant with DAPI	Life Technologies	P-36935
Puritan cortton swabs	VWR	10806-005
Puritan Mini cotton tipped aplicators	VWR	82004-050
Round handled Needle Holder	Fine Science Tools	12076-12
Silk Suture 6/0	Fine Science Tools	18020-60
Spring scissors	ROBOZ	RS-5601
Strabismus Scissors	Fine Science Tools	14075-09
Super Grip Forceps	Fine Science Tools	00649-11
Transparent Dressing	Cardinal Health	TD-26C
Triton X-1000	Fisher Scientific	AC327371000