En ansiktsberedning av musblodfartyg
Summary
Ett förfarande för framställning av ansiktspreparat av muskelkarotidartären och aorta beskrivs. Sådana preparat, när immunofluorescens färgas med specifika antikroppar, möjliggör oss att studera lokalisering av proteiner och identifiering av celltyper inom hela vaskväggen genom konfokal mikroskopi.
Abstract
Sektioner av paraffininbäddade vävnader används rutinmässigt för att studera vävnadshistologi och histopatologi. Det är emellertid svårt att bestämma vad den tredimensionella vävnadsmorfologin är från sådana sektioner. Dessutom kan de undersökta vävnaderna inte innehålla regionen inom vävnaden som är nödvändig för den pågående studien. Denna senare begränsning hindrar histopatologiska studier av blodkärl eftersom kärlskador utvecklas på ett fokaliserat sätt. Detta kräver en metod som gör det möjligt för oss att undersöka ett brett område av blodkärlets vägg, från dess yta till djupare områden. En fullständig montering av ansiktsbehandling av blodkärl uppfyller detta krav. I denna artikel kommer vi att visa hur man gör ansiktspreparationer av musa aorta och halspulsådern och att immunofluorescensa dem för konfokal mikroskopi och andra typer av fluorescensbaserad bildbehandling.
Introduction
För histopatologiska studier genom ljusmikroskopi bearbetas tredimensionella bitar biologiska vävnader rutinmässigt för paraffininkonstruktion följt av snittning och färgning. Ett vävnadsprov som har blivit paraffinerat kan vara flera millimeter i alla tre dimensionerna. För ljusmikroskopiens syfte måste det emellertid först snittas så att ljuset kan passera och färgas så att den tunna sektionen ger tillräckligt med kontrast för bildbehandling. Eftersom snittprover normalt är 5-10 μm i tjocklek ser man endast en mycket liten del av hela provet i två dimensioner åt gången. Det är möjligt att samla sekventiella sektioner och, efter bildbehandling av varje sektion individuellt, utföra datorstödd rekonstruktion av 3D-bilderna, men detta är ett tråkigt jobb faktiskt. Histopatologi av blodkärl, speciellt för att studera patogenes av ateroskleros, presenterar unika problem. Ateroskleros är en fokaliserad sjukdom som utvecklasLokalt i områden där stört blodflöde uppstår. Vidare initieras sjukdomen inom intima, en tunn vävnad bestående av ett monoskikt av endotelceller och extracellulär matris, av stora artärer. Av dessa skäl är det en utmaning att lokalisera och studera tidiga lesioner med hjälp av sektionerade blodkärl, eftersom man lätt kan missa att skära av lesionen. Även om en sektion inkluderar ett sjukt område kommer man endast att se en 5-10 pm del innehållande endotelceller och andra vaskulära väggceller i media och adventitier.
Förberedelser för fullständigt monterad ansikte (uttalad än fäs) gör det möjligt för oss att undersöka ett stort område av blodkärlsytan, såsom hela aortan från aorta-roten hela vägen ner till de gemensamma iliacartärerna. Genom att använda ett sådant prov färgat med specifika antikroppar och andra specifika sonder kan man bestämma läget av lesioner och även där olika molekylära händelser förekommer i endotelceller i samband med wiAtherogenesen, såsom förändringar i uttrycket, lokalisering och posttranslationella modifieringar av proteiner. Förutom att studera atherogenes användes endotelcellsformen observerad i en ansiktsberedningar som en indikator på det regionala medeltalet blodflödesmönster. Sådan data är viktiga för att studera mekanosignalering av endotelceller in situ. För detta ändamål är rutinhistologiska tvärsnittsblodkärl inte användbara. Således är det för kärlsmedicin och biologi särskilt viktigt att förvärva en teknik för framställning av ansiktspreparat av blodkärl som gör att man kan observera ett brett område av kärlytan såväl som de djupare underytorna hos kärlet.
Som granskat av Jelev och Surchev 1 har vaskulära biologer utvecklat olika metoder för att observera framkallningen av blodkärl. Några geniala metoder utvecklades på 1940-talet och 1950-talet. Med hjälp av dessa metoder var de Kunna studera den grundläggande organisationen av endotelceller som leder blodkärlens inre yta. På grund av det sätt på vilket dessa ansiktsberedningar förbereds (den så kallade Hautchen-metoden 2 , 3 , 4 eller avskalning av kärlytan 5 ) och hur provet färgades var det inte alltid möjligt att erhålla oavbruten morfologisk Information från kärlytan till de djupare områdena av blodkärlets vägg. Helmontering och ansiktsbehållarberedning kombinerat med immunofluorescensfärgning tillät oss att inte bara studera endotelcellmorfologi och proteinuttryck och lokalisering i dessa celler utan också att utvidga sådana studier till kärlväggens subendoteliala region. Tidiga studier med blodkärl och ansiktsberedningar började färgas immunoflurescently i 1980-talet 6 ,F "> 7. Med framkomsten av laserskanning av konfokal mikroskopi och mer nyligen multiphotonmikroskopi kan man nu få tydliga in-fokusbilder av blodkärlets väggstruktur i immunofluorescensfärgade prov i ansiktsbehållare såväl som det vaskulära nätverket i levande djur 8 , 9 , 10 , 11. Dessa datorbaserade bildtekniker skapar optiska sektionsbilder i fokus och genom att stapla upp sådana bilder kan man få rekonstruerade 3D-bilder av kärlväggen och det vaskulära nätverket i vävnader. Dessutom är en Kan generera bilder av en sektion gjord längs Z-axeln hos den rekonstruerade bilden 12 , 13 .
I denna artikel kommer vi att illustrera en metod för att förbereda ansiktsberedningar av musaorta och halspulsådern för immunofluorescerande färgning. En ansiktsberedningarKan göras även efter att dessa kärl har manipulerats experimentellt. Till exempel kan en carotidartär ligeras delvis och därefter en ansiktsberedning gjord efter en sådan operation. Av denna anledning kommer vi också att beskriva i denna artikel hur vi gör en partiell ligation på halspulsådern. Jämfört med att göra liknande preparat från större djur, såsom råttor, kaniner och människor, är muskärl små i storlek och mer bräckliga, vilket kräver ytterligare omsorg för hantering under kirurgisk isolering av kärl och förberedande för antikroppsfärgning och mikroskopi. Eftersom den vanligaste djurmodellen för genetisk modifiering är musen, blir det viktigt för många utredare att hantera muskärl utan att skada dem. I det här manuskriptet kommer vi att beskriva hur man hanterar muskärl när man gör ansiktspreparat av musa aorta och halspulsådern. I demonstrationens syfte kommer vi att använda vildtyp C57 / b6-möss.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vid hantering av muskärl är det viktigt att komma ihåg att endotelet är ömtåligt och att alltför kraftig mekanisk kraft kommer att skada endotelceller. Till exempel bryts eller sönder endotelceller från kärlväggen om kärlet perfusioneras för kraftigt, vilket lätt kan hända när kärlet perfuseras med en handdriven spruta.
För att erhålla konstant perfusionstryck använder vi ett gravitetsperspirationssystem med ett tryck på 120 cm vattenkolonn. Det har rapporterats att det …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarnas forskningsaktiviteter stöds av bidrag från National Institute of Health till Dr. Abe (HL-130193, HL-123346, HL-118462, HL-108551).
Materials
| 0.9% Sodium Chloride injection solution USP 500ml bag | Fisher Scientific | NC9788429 |
| 12-well plates | Fisher Scientific | 12556005 |
| 6-0 coated vicryl suture | Ethicon | J833G |
| AF488 goat anti-rat IgG | Life Technologies | A11006 |
| AF546 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies | A11035 |
| Anti-CD144 (Ve-Cad) | BD Biosciences | BD555289 |
| Anti-VCAM-1 (H-276) Rabbit polyclonal IgG | Santa Cruze Biotechnology | Sc-8304 |
| Aoto Flow System | Braintree Scientific | EZ-AF9000 |
| Autoclave Wrap. 24x24in | Cardinal Health | 4024 |
| Blunt retractors, 2.5mm wide | Fine Science Tools | 18200-10 |
| Caprofen (Rimadyl) | zoetis | NADA#141-199 |
| Chlorhexidine Scrub, 2% | Med-Vet International | RXCHLOR2-PC |
| Curity gauze sponges 2×2 | Cardinal Health | KC2146 |
| Electric heating pad, 12X14 | Fisher Scientific | NC0667724 |
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11152-10 |
| Iris Scissors | Fine Science Tools | 14090-11 |
| Micro cover glass 22x50mm | VWR | 48393059 |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-18 |
| normal goat serum | Equitech-Bio | GS05 |
| Paraformaldehyde Solution 4% in PBS | Santa Cruze Biotechnology | SC-281692 |
| Petri Dishes 100x15mm | Fisher Scientific | FB0875713 |
| Prolong Gold Antifade mountant with DAPI | Life Technologies | P-36935 |
| Puritan cortton swabs | VWR | 10806-005 |
| Puritan Mini cotton tipped aplicators | VWR | 82004-050 |
| Round handled Needle Holder | Fine Science Tools | 12076-12 |
| Silk Suture 6/0 | Fine Science Tools | 18020-60 |
| Spring scissors | ROBOZ | RS-5601 |
| Strabismus Scissors | Fine Science Tools | 14075-09 |
| Super Grip Forceps | Fine Science Tools | 00649-11 |
| Transparent Dressing | Cardinal Health | TD-26C |
| Triton X-1000 | Fisher Scientific | AC327371000 |
References
- Jelev, L., Surchev, L. A novel simple technique for en face endothelial observations using water-soluble media -‘thinned-wall’ preparations. J Anat. 212 (2), 192-197 (2008).
- Neill, J. F. The effect on venous endothelium of alterations in blood flow through the vessels in vein walls, and the possible relation to thrombosis. Ann Surg. 126 (3), 270-288 (1947).
- Rogers, K. A., Kalnins, V. I. A method for examining the endothelial cytoskeleton in situ using immunofluorescence. J Histochem Cytochem. 11 (11), 1317-1320 (1983).
- Poole, J. C. F., Sanders, A. G., Florey, H. W. The regeneration of aortic endothelium. J Pathol Bacteriol. 75, 133-143 (1958).
- Sade, R. M., Folkman, J. En face stripping of vascular endothelium. Microvasc Res. 4, 77-80 (1972).
- White, G. E., Gimbrone, M. A., Fujiwara, K. Factors influencing the expression of stress fibers in vascular endothelial cells in situ. J Cell Biol. 97 (2), 416-424 (1983).
- Kim, D. W., Gotlieb, A. I., Langille, B. L. In vivo modulation of endothelial F-actin microfilaments by experimental alterations in shear stress. Arteriosclero. 9, 439-445 (1989).
- Haka, A., Potteaux, S., Fraser, H., Randolph, G., Maxfield, F. Quantitative analysis of monocyte subpopulations in murine atherosclerotic plaques by multiphoton microscopy. Plos ONE. 7 (9), 244823e (2012).
- Chèvre, R., et al. High-Resolution imaging of intravascular atherogenic inflammation in live mice. Circ Res. 114, 770-779 (2014).
- Heo, K. -. S., et al. Disturbed flow-activated p90RSK kinase accelerates atherosclerosis by inhibiting SENP2 function. J Clin Invest. 125 (3), 1299-1310 (2015).
- Le, N. -. T., et al. A crucial role for p90RSK-mediated reduction of ERK5 transcriptional activity in endothelial dysfunction and atherosclerosis. Circ. 127, 486-499 (2013).
- Kano, Y., Katoh, K., Masuda, M., Fujiwara, K. Macromolecular composition of stress fiber-plasma membrane attachment sites in endothelial cells in situ. Circ Res. 79, 1000-1006 (1996).
- Nigro, P., et al. Cyclophilin A is an inflammatory mediator that promotes atherosclerosis in apolipoprotein E-dependent mice. J Exp Med. 208 (1), 53-66 (2011).
- Mattson, D. L. Comparison of arterial blood pressure in different strains of mice. Am J Hypertens. 14 (5), 405-408 (2001).
- Jinguji, Y., Fujiwara, K. Stress fiber dependent axial organization of fibronectin fibrils in the basal lamina of the chick and mesenteric artery. Endothelium. 2, 35-47 (1994).
- Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Lust, L., Mack, A. F. Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluations and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure. Sci Rep. 6, 34331 (2016).
