صبغة الفلورسنت وصفها من كرات الدم الحمراء والكريات البيض لدراسة ديناميات التدفق في الماوس دوران الشبكية
Summary
التصوير الخلية الحية من خلايا الدم المسمى في الدورة الدموية العين يمكن أن توفر معلومات عن التهاب ونقص التروية في اعتلال الشبكية السكري والانحطاط البقعي المرتبط بالعمر. ويرد وصف بروتوكول لتسمية خلايا الدم وصورة الخلايا المسمى في الدورة الدموية في شبكية العين.
Abstract
قد توفر ديناميات تدفق الدم الشبكية والمشيمية نظرة ثاقبة على الفيزيولوجيا المرضية وعقابيل أمراض العين المختلفة، مثل الزرق، اعتلال الشبكية السكري، الضمور البقعي المرتبط بالعمر (أمد) وغيرها من الظروف الالتهابية العين. وقد يساعد أيضا على رصد الاستجابات العلاجية في العين. وضع العلامات المناسبة لخلايا الدم، إلى جانب التصوير خلية حية من الخلايا المسمى، ويسمح للتحقيق في ديناميات تدفق في شبكية العين و الدورة الدموية المشيمية. هنا، نحن تصف بروتوكولات موحدة من 1.5٪ الإندوسيانين الأخضر (إيسغ) و 1٪ الصوديوم فلوريسئين وصفها من الكريات الحمراء الفئران والكريات البيض، على التوالي. تم تطبيق المسح الضوئي منظار العين الليزر (سلو) لتصور الخلايا المسمى في الدورة الدموية في شبكية العين من الفئران C57BL / 6J (نوع البرية). أظهر كلا الأسلوبين الخلايا فلورزنتلي المسمى متميزة في الدورة الدموية في شبكية العين الماوس. هذه الطرق وضع العلامات يمكن أن يكون تطبيقات أوسع في مختلف أمراض العينعارضات ازياء.
Introduction
دراسة ديناميات تدفق خلايا الدم في الدورة الدموية في شبكية العين والمشيمية أمر حتمي لفهم التسبب في الأمراض التي يحتمل أن تكون مهددة الرؤية الرؤية وغيرها من الظروف الالتهابية العين. ومع ذلك، فإن تقنيات تصوير الأوعية التقليدية، والتي تنطوي على ملزمة الأصباغ الفلورية للبروتينات البلازما، لا توفر أي معلومات بشأن ديناميات كرات الدم الحمراء أو الكريات البيض 1 . ديناميات تدفق الشبكية كرات الدم الحمراء مهمة لدراسة الدورة الدموية كفاءة الأيض في شبكية العين، وديناميات تدفق الكريات البيض، لفهم الهجرة الخلية، والاعتراف، والتصاق والدمار في مختلف الظروف الالتهابية 2 . هناك العديد من جزيئات الفلورسنت المستخدمة في تحديد وتوصيف أنواع الخلايا المختلفة 3 . يمكن قياس ديناميكا الدم من خلايا الدم عن طريق تلطيخها مع فلوريس المناسبةسنت الأصباغ وتطبيق تقنيات التصوير المناسبة 4 .
وجود الاستجابات الالتهابية في أمراض العين مثل الضمور البقعي المرتبط بالعمر (أمد) واعتلال الشبكية السكري (در) تنطوي على تراكم الخلايا الليمفاوية في المنطقة المريضة 5 ، 6 . تتبع الخلايا المناعية في الأنسجة يمكن أن تساعد على فهم الأحداث المعقدة المشاركة في آلية المرضية المرضية. استخدمت النظائر المشعة مثل 51 كر و 125 أنا كما تتبع الخلايا في الدراسات المبكرة. هذه الأصباغ هي سامة وتؤثر على بقاء الخلية. على الرغم من أن العلامات المشعة 3 H و 14 C هي أقل سمية للخلايا، نظرا لطاقات انبعاثها أقل، فمن الصعب للكشف عن إشاراتها في النظام 7 ، 8 . تم إدخال عدد من الأصباغ اللامعة للتغلب على المشاكل المحتملة المرتبطة ثإيث علامات المشعة وتتبع هجرة الخلايا الليمفاوية في المختبر باستخدام المجهر الفلورسنت وتدفق الخلوي 9 ، 10 . هوشست 33342 وثيازول البرتقال هي الحمض النووي ملزمة الأصباغ الفلورية، والتي تستخدم لتعقب الخلايا الليمفاوية في الجسم الحي. هويشت 33342 يربط إلى المناطق الغنية في أت في الحمض النووي، هو غشاء نفاذية، يحتفظ إشارات الفلورسنت لمدة 2-4 أيام ومقاومة لتبريد 9 ، 10 . عيوب هويشت 33342 وثيازول البرتقال هي تثبيط انتشار الخلايا الليمفاوية 11 ونصف عمر قصير، على التوالي 9 .
كالسين-آم، فلوريسئين دياسيتات (فدا)، 2 '، 7'- مكرر (2-كاربوكسيثيل) -5- (و -6) -carboxy فلورسين، استر أسيتوكسيميثيل (بسكف-آم)، 5- (و -6) كاربوكسيفلورسين دياسيتات (كفدا)، و 5- (و -6) -carboxyfluorcein ديسيتات أسيتوكسيميثيل استر (كفدا-آم)هي الأصباغ الفلورية السيتوبلازمية المستخدمة للدراسات الهجرة اللمفاوية. ومع ذلك، فدا، كفدا و كفدا-آم ديك الاحتفاظ أقل في الخلايا 9 . بسيف-آم يقلل من الاستجابة التكاثري ويؤثر على الكيميائي وإنتاج الفائق 6 ، 12 . كالسين-آم هو صبغة الفلورسنت ومفيدة على المدى القصير في دراسات الهجرة اللمفاويات الجسم الحي . تنبعث منها إشارات فلورية قوية، لا تتداخل مع معظم الوظائف الخلوية وتحتفظ بإشارات الفلورسنت لمدة تصل إلى 3 أيام 12 ، 13 . فلوريسئين إيسوثيوسيانات (فيتس) و كاربوكسيفلورسين دياسيتات سوتسينيميديل استر (كفدا-سي) هي التساهمية اقتران الأصباغ الفلورية، والتي تستخدم للدراسات الهجرة اللمفاوية. فيتس المعارض أي تأثير على بقاء الخلية ولها تقارب أقوى مع الخلايا الليمفاوية B من الخلايا الليمفاوية T 14 ، 15 </suص>. ويمكن تعقب الخلايا الليمفاوية المسمى كفدا-سي في الجسم الحي لأكثر من 8 أسابيع وتصل إلى 8 الانقسامات الخلية 9 ، 16 . C1 دي (1،1'-ديوكتاديسيل-3،3،3 '، 3'-تيتراميثيليندوكاربوسيانين بيركلورات)، ديو (3،3'- ديوكتاديسيلوكساكاربوسيانين بيركلورات)، بول كارل هوران (يخ) 2، PKH3، و PKH26 هي غشاء- إدراج الأصباغ الكاربوسيانين الفلورسنت محبة للدهون المستخدمة لتسمية الكريات البيض والكريات الحمراء. C18 ديل و ديو المعرض إشارات أعلى عند دمجها في غشاء الخلية وغير نسبيا غير سامة 12 ، 17 . PKH2، PKH3 و PKH26 الخلايا المسمى تحمل الاحتفاظ الجيد للإشارات الفلورسنت مع أقل سمية 18 ، 19 ، 20 ، 21 ، 22 . ومع ذلك، PKH2 أسفل ينظم التعبير CD62L ويقلل من لي بقاء خلية مبوية 23 .
وقد أجريت معظم الدراسات المذكورة أعلاه لتتبع هجرة الخلايا الليمفاوية وانتشار في اللمفاويات ودراسة الكريات الحمراء المسمى في الدورة الدموية غير العين. هناك عدد قليل جدا من الدراسات تطبيق تقنيات وضع العلامات لدراسة خلايا الدم في الدورة الدموية العين. تطبيق المسح الضوئي منظار العين ليزر (سلو) لديه ميزة كبيرة في دراسة الخلايا المسمى في شبكية العين والدورة الدموية المشيمية في الجسم الحي بواسطة قاع الأوعية تصوير 24 . هناك عدة أصباغ الفلورسنت، مثل إيسغ، أكريدين البرتقال، فيتس، فلوريسئين الصوديوم، و كفدا التي تستخدم لدراسة الكريات البيض في الدورة الدموية في شبكية العين من قبل سلو 25 ، 26 ، 27 ، 28 ، 29 ، 30 ،كلاس = "كريف"> 31 ، 32 ، 33 ، 34 . السمية الضوئية والسرطانية من أكريدين البرتقال 26 ، 27 ، تدخل فيتس مع النشاط الخلوي، ومتطلبات عامل تباين داخل الأوعية لحل الأوعية الدموية في شبكية العين والأوعية الدموية المشيمية يحد من تطبيقها في التجارب الحيوانية في الجسم الحي 29 . فلوريسئين الصوديوم و إيسغ هي غير سامة، التي وافقت عليها إدارة الغذاء والدواء، وآمنة لاختبار على البشر 32 ، 35 . ترتبط معظم الدراسات الديناميكية تدفق إلى وضع العلامات من الكريات البيض أو كرات الدم الحمراء والتصور لها في شبكية العين والأوعية الدموية المشيمية 36 ، 37 ، 38 ، 39 </sتصل>. هنا، نحن تصف بروتوكول موحد من إيسغ وضع العلامات من كرات الدم الحمراء، ووصف فلوريسئين الصوديوم من الكريات البيض، وتتبع الخلايا المسمى تصور في دوران الشبكية الماوس باستخدام سلو.
Protocol
Representative Results
Discussion
دراسة ديناميكا الدم في دوران الشبكية والمشيمية أمر حيوي لفهم الفيزيولوجيا المرضية للعديد من أمراض العين. ويمكن دراسة ديناميات تدفق الدم في الدورة الدموية في شبكية العين من قبل التصوير الفوتوغرافي التماسك البصري فورييه المجال (فد-أوكت)، فلوغرافي الليزر الرقطة (لسفغ)…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم تمويل المشروع البحثي بموجب منحة المحقق الجديد من المجلس الوطني للبحوث الطبية (نمرك)، سنغافورة. ويود الفريق أن يعترف بالتدريب البحثي المقدم إلى الدكتور أغروال في معهد طب العيون (إيو)، كلية لندن الجامعية (أوكل) في إطار المجلس الوطني للبحوث الطبية (نمرك) زمالة التدريب في الخارج من نوفمبر 2012 حتى أكتوبر 2014 تحت إشراف البروفيسور. ديفيد شيما. اكتسب الدكتور أغروال مفهوم ومهارات لوضع العلامات على الخلايا والتصوير الحي في مختبر الدكتور شيما. وبالتالي فإن الفريق يود أن يعترف الإشراف والتوجيه خلال الزمالة التدريب من البروفسور ديفيد شيما، Pro.f كينيث ميسنر، الدكتور بيتر لونده والدكتور دايجو إيواتا.
Materials
| Cardiogreen polymethine dye (Indocyanine green) | Sigma Aldrich | 12633-50MG | |
| Fluorescein 100 mg/mL | Novartis | U1705A/H-1330292 | |
| 10X Phosphate-buffered saline (PBS) Ultra Pure Grade | 1st BASE | BUF-2040-10X1L | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A7906-100G | |
| Microtainer tubes with K2E (K2EDTA) – EDTA concentration – 1.8 mg/mL of blood | BD, USA | REF 365974 | |
| Histopaque 1077 solution | Sigma Aldrich | 10771 | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 05-413-401 | |
| Microcentrifuge tubes 2mL | Axygen | MCT-200-C-S | |
| Vortex mixer | Insta BioAnalytik pte. ltd | FINE VORTEX | |
| Shaker incubator | Lab Tech | ||
| Ceva Ketamine injection (Ketamine hydrochloride 100mg/mL) | Ceva | KETALAB03 | |
| ILIUM XYLAZIL-20 (Xylazine hydrochloride 20mg/Ml) | Troy Laboratories PTY. Limited | LI0605 | |
| 1% Mydriacyl 15 mL (Tropicamide 1%) | Alcon Laboratories, Inc. USA | NDC 0998-0355-15 | |
| 2.5% Mydfrin 5 mL (Phenylephrine hydrochloride 2.5%) | Alcon Laboratories, Inc. USA | NDC 0998-0342-05 | |
| Terumo syringe with needle 1cc/mL Tuberculin | Terumo (Philippenes) Corporation, Philippines | SS-01T2613 | |
| Vidisic Gel 10G | Dr. Gerhard Mann, Chem.-Pharm, Fabrik Gmbh, Berlin, Germany | ||
| Alcohol swabs | Assure medical disposables | 7M-004-L-01 | |
| Confocal laser scanning angiography system (Heidelberg Retina Angiograph 2) | Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Germany | ||
| Hiedelberg Spectralis Viewing Module software, v4.0 | Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Germany | ||
| Fluorescent microscope | ZEISS | Model: axio imager z1 |
References
- Khoobehi, B., Peyman, G. A. Fluorescent vesicle system. A new technique for measuring blood flow in the retina. Ophthalmology. 101 (10), 1716-1726 (1994).
- Beem, E., Segal, M. S. Evaluation of stability and sensitivity of cell fluorescent labels when used for cell migration. J Fluoresc. 23 (5), 975-987 (2013).
- Parish, C. R. Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies. Immunol Cell Biol. 77 (6), 499-508 (1999).
- Khoobehi, B., Peyman, G. A. Fluorescent labeling of blood cells for evaluation of retinal and choroidal circulation. Ophthalmic Surg Lasers. 30 (2), 140-145 (1999).
- Nowak, J. Z. Age-related macular degeneration (AMD): pathogenesis and therapy. Pharmacol Rep. 58 (3), 353-363 (2006).
- Antonetti, D. A., Klein, R., Gardner, T. W. Diabetic retinopathy. N Engl J Med. 366 (13), 1227-1239 (2012).
- Rannie, G. H., Thakur, M. L., Ford, W. L. An experimental comparison of radioactive labels with potential application to lymphocyte migration studies in patients. Clin Exp Immunol. 29, 509-514 (1977).
- Ford, W. L. The preparation and labeling of lymphocytes. Handbook of Experimental Immunology. 3, (1978).
- Weston, S. A., Parish, C. R. New fluorescent dyes for lymphocyte migration studies: Analysis by flow cytometry and fluorescence microscopy. J Immunol Meth. 133, 87-97 (1990).
- Brenan, M., Parish, C. R. Intracellular fluorescent labeling of cells for analysis of lymphocyte migration. J Immunol Meth. 74, 31-38 (1984).
- Samlowski, W. E., Robertson, B. A., Draper, B. K., Prystas, E., McGregor, J. R. Effects of supravital fluorochromes used to analyze the in vivo homing of murine lymphocytes on cellular function. J Immunol Meth. 144, 101-115 (1991).
- DeClerck, L. S., Bridts, C. H., Mertens, A. M., Moens, M. M., Stevens, W. J. Use of fluorescent dyes in the determination of adherence of human leukocytes to endothelial cells and the effect of fluorochromes on cellular function. J Immunol Meth. 172, 115-124 (1994).
- Chiba, K., et al. FTY720, a novel immunosuppressant, induced sequestration of circulating mature lymphocytes by acceleration of lymphocyte homing in rats. I. FTY720 selectively decreases the number of circulating mature lymphocytes by acceleration of lymphocyte homing. J Immunol. 160, 5037-5044 (1998).
- Butcher, E. C., Weissman, I. L. Direct fluorescent labeling of cells with fluorescein or rhodamine isothiocyanate. I. Technical aspects. J Immunol Meth. 37, 97-108 (1980).
- Butcher, E. C., Scollay, R. G., Weissman, I. Direct fluorescent labeling of cells with fluorescein or rhodamine isothiocyanate. II. Potential application to studies of lymphocyte migration and maturation. J Immunol Meth. 37, 109-121 (1980).
- Lyons, A. B., Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. J Immunol Meth. 171, 131-137 (1994).
- Unthank, J. L., Lash, J. M., Nixon, J. C., Sidner, R. A., Bohlen, H. G. Evaluation of carbocyanine-labeled erythrocytes for microvascular measurements. Microvasc Res. 45, 193-210 (1993).
- Slezak, S. E., Horan, P. K. Fluorescent in vivo tracking of hematopoietic cells. Part I. Technical considerations. Blood. 74, 2172-2177 (1989).
- Teare, G. F., Horan, P. K., Slezak, S. E., Smith, C., Hay, J. B. Long-term tracking of lymphocytes in vivo: The migration of PKH-labeled lymphocytes. Cell Immunol. 134, 157-170 (1991).
- Johnsson, C., Festin, R., Tufveson, G. T., Tötterman, T. H. Ex vivo PKH26-labeling of lymphocytes for studies of cell migration in vivo. Scand. J Immunol. 45, 511-514 (1997).
- Khalaf, A. N., Wolff-Vorbeck, G., Bross, K., Kerp, L., Petersen, K. G. In vivo labeling of the spleen with a red-fluorescent cell dye. J Immunol Meth. 165, 121-125 (1993).
- Albertine, K. H., Gee, M. H. In vivo labeling of neutrophils using a fluorescent cell linker. J Leukoc Biol. 59, 631-638 (1996).
- Samlowski, W. E., Robertson, B. A., Draper, B. K., Prystas, E., McGregor, J. R. Effects of supravital fluorochromes used to analyze the in vivo homing of murine lymphocytes on cellular function. J Immunol Meth. 144, 101-115 (1991).
- Manivannan, A., et al. Digital fundus imaging using a scanning laser ophthalmoscope. Physiol Meas. 14, 43-56 (1993).
- Okanouchi, T., Shiraga, F., Takasu, I., Tsuchida, Y., Ohtsuki, H. Evaluation of the dynamics of choroidal circulation in experimental acute hypertension using indocyanine green-stained leukocytes. Jpn J Ophthalmol. 47 (6), 572-577 (2003).
- Zdolsek, J. M., Olsson, G. M., Brunk, U. T. Photooxidative damage to lysosomes of cultured macrophages by acridine orange. Photochem Photobiol. 51, 67-76 (1990).
- Molnar, J., et al. Antiplasmid and carcinogenic molecular orbitals of benz[c]acridine and related compounds. Anticancer Res. 13, 263-266 (1993).
- Fillacier, K., Peyman, G. A., Luo, Q., Khoobehi, B. Study of lymphocyte dynamics in the ocular circulation: technique of labeling cells. Curr Eye Res. 14 (7), 579-584 (1995).
- Horan, P. K., et al. Fluorescent cell labeling for in vivo and in vitro cell tracking. Methods Cell Biol. 33, 469-490 (1990).
- Hossain, P., et al. In vivo cell tracking by scanning laser ophthalmoscopy: quantification of leukocyte kinetics. Invest Ophthalmol Vis Sci. 39 (10), 1879-1887 (1998).
- Yang, Y., Kim, S., Kim, J. Visualization of retinal and choroidal blood flow with fluorescein leukocyte angiography in rabbits. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 235 (1), 27-31 (1997).
- Kim, J., Yang, Y., Shin, B., Cho, C. Visualization and flow of platelets and leukocytes in vivo in rat retinal and choroidal vessels. Ophthalmic Res. 29 (6), 374-380 (1997).
- Le Gargasson, J. F., et al. Scanning laser ophthalmoscope imaging of fluorescein-labeled blood cells. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 235, 56-58 (1997).
- Yang, Y., Kim, S., Kim, J. Fluorescent dots in fluorescein angiography and fluorescein leukocyte angiography using a scanning laser ophthalmoscope in humans. Ophthalmology. 104 (10), 1670-1676 (1997).
- Yannuzzi, L. A. Indocyanine green angiography: a perspective on use in the clinical setting. Am J Ophthalmol. 151 (5), 745-751 (2011).
- Khoobehi, B., Peyman, G. A. Fluorescent labeling of blood cells for evaluation of retinal and choroidal circulation. Ophthalmic Surg Lasers. 30 (2), 140-145 (1999).
- Kornfield, T. E., Newman, E. A. Regulation of blood flow in the retinal trilaminar vascular network. J Neurosci. 34 (34), 11504-11513 (2014).
- Kornfield, T. E., Newman, E. A. Measurement of Retinal Blood Flow Using Fluorescently Labeled Red Blood Cells. eNeuro. 2 (2), (2015).
- Matsuda, N., et al. Visualization of leukocyte dynamics in the choroid with indocyanine green. Invest Ophthalmol Vis Sci. 37 (11), 2228-2233 (1996).
- Wang, Y., Lu, A., Gil-Flamer, J., Tan, O., Izatt, J. A., Huang, D. Measurement of total blood flow in the normal human retina using Doppler Fourier-domain optical coherence tomography. Br J Ophthalmol. 93 (5), 634-637 (2009).
- Wang, Y., Fawzim, A., Tan, O., Gil-Flamer, J., Huang, D. Retinal blood flow detection in diabetic patients by Doppler Fourier domain optical coherence tomography. Opt Express. 17 (5), 4061-4073 (2009).
- Srinivas, S., Tan, O., Wu, S., Nittala, M. G., Huang, D., Varma, R., Sadda, S. R. Measurement of retinal blood flow in normal Chinese-American subjects by Doppler Fourier-domain optical coherence tomography. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (3), 1569-1574 (2015).
- Sugiyama, T., Araie, M., Riva, C. E., Schmetterer, L., Orgul, S. Use of laser speckle flowgraphy in ocular blood flow research. Acta Ophthalmol. 88 (7), 723-729 (2010).
- Nakano, Y., Shimazaki, T., Kobayashi, N., Miyoshi, Y., Ono, A., Kobayashi, M., Shiragami, C., Hirooka, K., Tsujikawa, A. Retinal Oximetry in a Healthy Japanese Population. PLoS One. 11 (7), 0159650 (2016).
- Turksever, C., Orgul, S., Todorova, M. G. Reproducibility of retinal oximetry measurements in healthy and diseased retinas. Acta Ophthalmol. 93 (6), 439-445 (2015).
- Sharp, P. F., Manivannan, A., Xu, H., Forrester, J. V. The scanning laser ophthalmoscope-a review of its role in bioscience and medicine. Phys Med Biol. 49 (7), 1085-1096 (2004).
- Clermont, A. C., Aiello, L. P., Mori, F., Aiello, L. M., Bursell, S. E. Vascular endothelial growth factor and severity of nonproliferative diabetic retinopathy mediate retinal hemodynamics in vivo: a potential role for vascular endothelial growth factor in the progression of nonproliferative diabetic retinopathy. Am J Ophthalmol. 124 (4), 433-446 (1997).
- Nguyen, H. T., et al. Retinal blood flow is increased in type 1 diabetes mellitus patients with advanced stages of retinopathy. BMC Endocr Disord. 16 (1), 25 (2016).
- Schumann, J., Orgül, S., Gugleta, K., Dubler, B., Flammer, J. Interocular difference in progression of glaucoma correlates with interocular differences in retrobulbar circulation. Am J Ophthalmol. 129 (6), 728-733 (2000).
