JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Médecine

Fluorescent Dye Etikettering van Erythrocyten en Leukocyten voor het bestuderen van de Flow Dynamics in de retinale circulatie van de muis

Published: July 03, 2017
doi:
10.3791/55495
, , , , ,
1National Healthcare Group Eye Institute,Tan Tock Seng Hospital, 2Singapore Eye Research Institute (SERI),Singapore National Eye Center, 3School of Material Science and Engineering,Nanyang Technological University, 4Department of Ophthalmology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University Health Systems,National University of Singapore, 5Ophthalmology Academic Clinical Research Program,DUKE-NUS Graduate Medical School

Summary

Live-imaging van de gelabelde bloedcellen in de oculaire circulatie kan informatie verschaffen over ontsteking en ischemie bij diabetische retinopathie en leeftijdgerelateerde macular degeneratie. Een protocol om bloedcellen te labelen en de gemarkeerde cellen in de retinale circulatie af te beelden is beschreven.

Abstract

De retinale en choroidale bloedstroomdynamiek kan inzicht verschaffen in de pathofysiologie en vervolg van diverse oogziekten, zoals glaucoom, diabetische retinopathie, leeftijdgerelateerde macular degeneratie (AMD) en andere oculaire inflammatoire aandoeningen. Het kan ook helpen om de therapeutische reacties in het oog te volgen. De juiste etikettering van de bloedcellen, in combinatie met live-celbeelden van de gelabelde cellen, maakt het mogelijk om de stromingsdynamiek in de retinale en choroidale circulatie te onderzoeken. Hier beschrijven we de gestandaardiseerde protocollen van respectievelijk 1,5% indocyaninegroen (ICG) en 1% natriumfluoresceïne-etikettering van muizen erythrocyten en leukocyten. Scanning laser-oftalmocopie (SLO) werd toegepast om de gelabelde cellen te visualiseren in de retinale circulatie van C57BL / 6J muizen (wildtype). Beide methoden demonstreerden onderscheiden fluorescent gelabelde cellen in de retinale circulatie van de muis. Deze etiketteringsmethoden kunnen bredere toepassingen hebben in verschillende oogziektenmodellen.

Introduction

Het bestuderen van de stromingsdynamiek van de bloedcellen in de retinale en choroidale circulatie is essentieel voor het begrijpen van de pathogenese van potentieel visiebedreigende oogziekten en andere oculaire inflammatoire aandoeningen. De conventionele angiografietechnieken, die de binding van fluorescerende kleurstoffen aan plasma-eiwitten omvatten, verschaffen echter geen informatie over de dynamiek van de erythrocyten of leukocyten 1 . De erytrocytische retinale stromingsdynamiek is belangrijk voor het bestuderen van metabolisch efficiënte circulatie in het retina, en de leukocytestroomdynamiek, om de celmigratie, herkenning, adhesie en vernietiging in verschillende ontstekingsomstandigheden te begrijpen 2 . Er zijn verschillende fluorescerende moleculen gebruikt bij de identificatie en karakterisering van verschillende celtypen 3 . De hemodynamica van de bloedcellen kan worden gemeten door ze te kleuren met de juiste fluorenCent kleurstoffen en het toepassen van de juiste beeldvormingstechnieken 4 .

De aanwezigheid van ontstekingsreacties bij intraoculaire ziekten zoals leeftijdgerelateerde macular degeneratie (AMD) en diabetische retinopathie (DR) behelst de accumulatie van lymfocyten in het zieke gebied 5 , 6 . Het bijhouden van de immuuncellen in de weefsels kan helpen bij het begrijpen van de complexe gebeurtenissen die betrokken zijn bij het mechanisme van ziektepatogenese. Radioactieve isotopen zoals 51 Cr en 125 I werden in vroege studies gebruikt als cellracers. Deze kleurstoffen zijn giftig en beïnvloeden de levensvatbaarheid van de cellen. Hoewel de radioactieve markers 3 H en 14 C minder giftig zijn voor de cellen, is het moeilijk om hun signalen in het systeem 7 , 8 te detecteren door hun lagere emissie-energieën. Er werden een aantal fluorochroom-kleurstoffen ingevoerd om de mogelijke problemen die verband houden met w te overwinnenMet radioactieve markers en tracklymfocytemigratie in vitro met behulp van fluorescerende microscopie en flowcytometrie 9 , 10 . Hoechst 33342 en thiazoloranje zijn DNA-bindende fluorescerende kleurstoffen, die worden gebruikt om lymfocyten in vivo te volgen. Hoechst 33342 bindt aan AT-rijke gebieden in het DNA, is membraan doorlaatbaar, houdt fluorescentiesignalen gedurende 2 – 4 dagen en is bestand tegen slokkend 9 , 10 . De nadelen van Hoechst 33342 en thiazoloranje zijn de remming van lymfocyt proliferatie 11 en de korte halveringstijd respectievelijk 9 .

Calcein-AM, fluoresceendiacetaat (FDA), 2 ', 7'-bis- (2-carboxyethyl) -5- (en-6) -carboxyfluoresceïne, acetoxymethylester (BCECF-AM), 5- (en-6) Carboxyfluoresceendiacetaat (CFDA) en 5- (en-6) -carboxyfluoresceendiacetaatacetoxymethylester (CFDA-AM)Zijn de cytoplasmatische fluorescerende kleurstoffen gebruikt voor lymfocytemigratie studies. FDA, CFDA en CFDA-AM hebben echter lagere retentie in de cellen 9 . BCECF-AM vermindert de proliferatieve respons en beïnvloedt de chemotaxis en superoxideproductie 9 , 12 . Calcein-AM is een fluorescerende kleurstof en bruikbaar voor korte termijn in vivo lymfocytemigratie studies. Het emitert sterke fluorescerende signalen, verstoort de meeste cellulaire functies niet en houdt fluorescente signalen gedurende maximaal 3 dagen 12 , 13 . Fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) en carboxyfluoresceendiacetaatsuccinimidylester (CFDA-SE) zijn covalente koppeling fluorescerende kleurstoffen die worden gebruikt voor lymfocytemigratie studies. FITC vertoont geen effect op de cellevendigheid en heeft een sterkere affiniteit met B-lymfocyten dan T-lymfocyten 14 , 15 </sup>. De CFDA-SE gelabelde lymfocyten kunnen meer dan 8 weken en tot 8 celafdelingen 9 , 16 in vivo worden gevolgd. C18 DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanineperchloraat), DiO (3,3'-dioctadecyloxacarbocyanineperchloraat), Paul Karl Horan (PKH) 2, PKH3 en PKH26 zijn membraan- Het inbrengen van fluorescerende lipofiele carbocyanine kleurstoffen die gebruikt worden om leukocyten en erythrocyten te labelen. C18 Dil en DiO tonen hogere signalen wanneer ze in het celmembraan worden opgenomen en zijn relatief niet giftig 12 , 17 . PKH2-, PKH3- en PKH26-gemerkte cellen tonen een goede retentie van de fluorescerende signalen met minder toxiciteit 18 , 19 , 20 , 21 , 22 . Echter, PKH2 regelt de CD62L expressie en vermindert de ly Mphocyt levensvatbaarheid 23 .

De meeste bovengenoemde studies zijn uitgevoerd voor het bijhouden van de lymfocytemigratie en proliferatie in de lymfatica en het bestuderen van de geëtiketteerde erythrocyten in de niet-oculaire circulatie. Er zijn zeer weinig studies die de etiketteringstechnieken toepassen om de bloedcellen in de oculaire circulatie te bestuderen. Toepassing van scan-laser-oftalmoprofie (SLO) heeft een groot voordeel bij het bestuderen van de gelabelde cellen in de retinale en choroidale circulatie in vivo door fundus angiography 24 . Er zijn verschillende fluorescerende kleurstoffen, zoals ICG, acridine oranje, FITC, natriumfluoresceïne en CFDA die gebruikt worden om de leukocyten in de retinale circulatie door SLO 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 ,Class = "xref"> 31 , 32 , 33 , 34 . De fototoxiciteit en carcinogeniciteit van acridine oranje 26 , 27 , de interferentie van FITC met de cellulaire activiteit en de eis van een intravascular contrastmiddel voor de oplossing van de retinale en choroidale bloedvaten beperkt hun toepassing in in vivo dierproeven 29 . Natriumfluoresceïne en ICG zijn niet-toxisch, goedgekeurd door de Food and Drug Administration, en veilig voor het testen op mensen 32 , 35 . De meeste dynamische studies zijn gerelateerd aan de etikettering van de leukocyten of erythrocyten en zijn visualisatie in de retinale en choroidale bloedvaten 36 , 37 , 38 , 39 </sup>. Hier beschrijven we een gestandaardiseerd protocol van ICG-etikettering van de erythrocyten, natriumfluoresceïne-etikettering van de leukocyten, en het bijhouden van de gevisualiseerde gelabelde cellen in de retinale circulatie van de muis met behulp van SLO.

Protocol

De dierprotocollen die in deze studie werden gebruikt, werden goedgekeurd door het Institutionele Diervoeder- en Gebruikskomitee van SingHealth, Singapore en zijn in overeenstemming met de richtlijnen van de Vereniging voor Onderzoek in Visie en Oogheelkunde (ARVO) Verklaring voor het gebruik van dieren in oogheelkunde en visie Onderzoek. 1. Etikettering van erytrocyten en leukocyten met fluorescerende kleurstoffen Bereiding van reagentia Bereid ICG (1,5 mg / ml) door 3 mg IC…

Representative Results

Erythrocyten gemarkeerd met 1,5% ICG werden gevisualiseerd in de retinale circulatie van C57BL / 6J muizen (wild type). Beide 1% en 5% hematocriet van 1,5% ICG gelabelde erythrocyten waren onderscheiden in de retinale circulatie. De afzonderlijke gemerkte cellen werden echter duidelijker met 1% hematocriet van 1,5% ICG gelabelde erythrocyten ( Figuur 1 ). In 5% hematocrit, door het grote aantal gelabelde cellen in de retinale vaten, was het niet mogelijk om …

Discussion

Het bestuderen van de hemodynamica in de retinale en choroidale circulatie is essentieel voor het begrijpen van de pathofysiologie van veel oogziekten. De bloedstroomdynamiek in de retinale circulatie kan worden bestudeerd door Fourier-domeine optische coherentie-tomografie (FD-OCT), laserspotflowgrafie (LSFG) en retinale oximetrie. Hoewel deze methoden verschillende benaderingen gebruiken om de totale bloedstroom in de retinale circulatie 40 , 41 , <…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Het onderzoeksproject werd gefinancierd uit New Investigator grant van de National Medical Research Council (NMRC), Singapore. Het team wil graag de onderzoeksopleiding ontvangen die aan Dr Agrawal bij het Institute of Ophthalmology (IoO), University College London (UCL) is verstrekt aan de National Medical Research Council (NMRC) overzeese onderzoeksopleiding van november 2012 tot oktober 2014 onder mentorschap van prof. David Shima. Dr. Agrawal verwierf het concept en de vaardigheden om de cellen te labelen en live imaging te produceren in het lab van Dr. Shima. Het team zal bijgevolg het toezicht en de begeleiding tijdens de training van prof. David Shima, Pro.f Kenith Meissner, Dr. Peter Lundh en Dr. Daiju Iwata erkennen.

Materials

Cardiogreen polymethine dye (Indocyanine green) Sigma Aldrich 12633-50MG
Fluorescein 100 mg/mL Novartis U1705A/H-1330292
10X Phosphate-buffered saline (PBS) Ultra Pure Grade 1st BASE BUF-2040-10X1L
Bovine serum albumin Sigma Aldrich A7906-100G
Microtainer tubes with K2E (K2EDTA) – EDTA concentration – 1.8 mg/mL of blood BD, USA REF 365974
Histopaque 1077 solution Sigma Aldrich 10771
Centrifuge 5810 R Eppendorf 05-413-401
Microcentrifuge tubes 2mL Axygen MCT-200-C-S
Vortex mixer Insta BioAnalytik pte. ltd FINE VORTEX
Shaker incubator Lab Tech
Ceva Ketamine injection (Ketamine hydrochloride 100mg/mL) Ceva KETALAB03
ILIUM XYLAZIL-20 (Xylazine hydrochloride 20mg/Ml) Troy Laboratories PTY. Limited LI0605
1% Mydriacyl 15 mL (Tropicamide 1%) Alcon Laboratories, Inc. USA NDC 0998-0355-15
2.5% Mydfrin 5 mL (Phenylephrine hydrochloride 2.5%) Alcon Laboratories, Inc. USA NDC 0998-0342-05
Terumo syringe with needle 1cc/mL Tuberculin Terumo (Philippenes) Corporation, Philippines SS-01T2613
Vidisic Gel 10G Dr. Gerhard Mann, Chem.-Pharm, Fabrik Gmbh, Berlin, Germany
Alcohol swabs Assure medical disposables 7M-004-L-01
Confocal laser scanning angiography system (Heidelberg Retina Angiograph 2) Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Germany
Hiedelberg Spectralis Viewing Module software, v4.0 Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Germany
Fluorescent microscope ZEISS Model: axio imager z1
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Khoobehi, B., Peyman, G. A. Fluorescent vesicle system. A new technique for measuring blood flow in the retina. Ophthalmology. 101 (10), 1716-1726 (1994).
  2. Beem, E., Segal, M. S. Evaluation of stability and sensitivity of cell fluorescent labels when used for cell migration. J Fluoresc. 23 (5), 975-987 (2013).
  3. Parish, C. R. Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies. Immunol Cell Biol. 77 (6), 499-508 (1999).
  4. Khoobehi, B., Peyman, G. A. Fluorescent labeling of blood cells for evaluation of retinal and choroidal circulation. Ophthalmic Surg Lasers. 30 (2), 140-145 (1999).
  5. Nowak, J. Z. Age-related macular degeneration (AMD): pathogenesis and therapy. Pharmacol Rep. 58 (3), 353-363 (2006).
  6. Antonetti, D. A., Klein, R., Gardner, T. W. Diabetic retinopathy. N Engl J Med. 366 (13), 1227-1239 (2012).
  7. Rannie, G. H., Thakur, M. L., Ford, W. L. An experimental comparison of radioactive labels with potential application to lymphocyte migration studies in patients. Clin Exp Immunol. 29, 509-514 (1977).
  8. Ford, W. L. The preparation and labeling of lymphocytes. Handbook of Experimental Immunology. 3, (1978).
  9. Weston, S. A., Parish, C. R. New fluorescent dyes for lymphocyte migration studies: Analysis by flow cytometry and fluorescence microscopy. J Immunol Meth. 133, 87-97 (1990).
  10. Brenan, M., Parish, C. R. Intracellular fluorescent labeling of cells for analysis of lymphocyte migration. J Immunol Meth. 74, 31-38 (1984).
  11. Samlowski, W. E., Robertson, B. A., Draper, B. K., Prystas, E., McGregor, J. R. Effects of supravital fluorochromes used to analyze the in vivo homing of murine lymphocytes on cellular function. J Immunol Meth. 144, 101-115 (1991).
  12. DeClerck, L. S., Bridts, C. H., Mertens, A. M., Moens, M. M., Stevens, W. J. Use of fluorescent dyes in the determination of adherence of human leukocytes to endothelial cells and the effect of fluorochromes on cellular function. J Immunol Meth. 172, 115-124 (1994).
  13. Chiba, K., et al. FTY720, a novel immunosuppressant, induced sequestration of circulating mature lymphocytes by acceleration of lymphocyte homing in rats. I. FTY720 selectively decreases the number of circulating mature lymphocytes by acceleration of lymphocyte homing. J Immunol. 160, 5037-5044 (1998).
  14. Butcher, E. C., Weissman, I. L. Direct fluorescent labeling of cells with fluorescein or rhodamine isothiocyanate. I. Technical aspects. J Immunol Meth. 37, 97-108 (1980).
  15. Butcher, E. C., Scollay, R. G., Weissman, I. Direct fluorescent labeling of cells with fluorescein or rhodamine isothiocyanate. II. Potential application to studies of lymphocyte migration and maturation. J Immunol Meth. 37, 109-121 (1980).
  16. Lyons, A. B., Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. J Immunol Meth. 171, 131-137 (1994).
  17. Unthank, J. L., Lash, J. M., Nixon, J. C., Sidner, R. A., Bohlen, H. G. Evaluation of carbocyanine-labeled erythrocytes for microvascular measurements. Microvasc Res. 45, 193-210 (1993).
  18. Slezak, S. E., Horan, P. K. Fluorescent in vivo tracking of hematopoietic cells. Part I. Technical considerations. Blood. 74, 2172-2177 (1989).
  19. Teare, G. F., Horan, P. K., Slezak, S. E., Smith, C., Hay, J. B. Long-term tracking of lymphocytes in vivo: The migration of PKH-labeled lymphocytes. Cell Immunol. 134, 157-170 (1991).
  20. Johnsson, C., Festin, R., Tufveson, G. T., Tötterman, T. H. Ex vivo PKH26-labeling of lymphocytes for studies of cell migration in vivo. Scand. J Immunol. 45, 511-514 (1997).
  21. Khalaf, A. N., Wolff-Vorbeck, G., Bross, K., Kerp, L., Petersen, K. G. In vivo labeling of the spleen with a red-fluorescent cell dye. J Immunol Meth. 165, 121-125 (1993).
  22. Albertine, K. H., Gee, M. H. In vivo labeling of neutrophils using a fluorescent cell linker. J Leukoc Biol. 59, 631-638 (1996).
  23. Samlowski, W. E., Robertson, B. A., Draper, B. K., Prystas, E., McGregor, J. R. Effects of supravital fluorochromes used to analyze the in vivo homing of murine lymphocytes on cellular function. J Immunol Meth. 144, 101-115 (1991).
  24. Manivannan, A., et al. Digital fundus imaging using a scanning laser ophthalmoscope. Physiol Meas. 14, 43-56 (1993).
  25. Okanouchi, T., Shiraga, F., Takasu, I., Tsuchida, Y., Ohtsuki, H. Evaluation of the dynamics of choroidal circulation in experimental acute hypertension using indocyanine green-stained leukocytes. Jpn J Ophthalmol. 47 (6), 572-577 (2003).
  26. Zdolsek, J. M., Olsson, G. M., Brunk, U. T. Photooxidative damage to lysosomes of cultured macrophages by acridine orange. Photochem Photobiol. 51, 67-76 (1990).
  27. Molnar, J., et al. Antiplasmid and carcinogenic molecular orbitals of benz[c]acridine and related compounds. Anticancer Res. 13, 263-266 (1993).
  28. Fillacier, K., Peyman, G. A., Luo, Q., Khoobehi, B. Study of lymphocyte dynamics in the ocular circulation: technique of labeling cells. Curr Eye Res. 14 (7), 579-584 (1995).
  29. Horan, P. K., et al. Fluorescent cell labeling for in vivo and in vitro cell tracking. Methods Cell Biol. 33, 469-490 (1990).
  30. Hossain, P., et al. In vivo cell tracking by scanning laser ophthalmoscopy: quantification of leukocyte kinetics. Invest Ophthalmol Vis Sci. 39 (10), 1879-1887 (1998).
  31. Yang, Y., Kim, S., Kim, J. Visualization of retinal and choroidal blood flow with fluorescein leukocyte angiography in rabbits. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 235 (1), 27-31 (1997).
  32. Kim, J., Yang, Y., Shin, B., Cho, C. Visualization and flow of platelets and leukocytes in vivo in rat retinal and choroidal vessels. Ophthalmic Res. 29 (6), 374-380 (1997).
  33. Le Gargasson, J. F., et al. Scanning laser ophthalmoscope imaging of fluorescein-labeled blood cells. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 235, 56-58 (1997).
  34. Yang, Y., Kim, S., Kim, J. Fluorescent dots in fluorescein angiography and fluorescein leukocyte angiography using a scanning laser ophthalmoscope in humans. Ophthalmology. 104 (10), 1670-1676 (1997).
  35. Yannuzzi, L. A. Indocyanine green angiography: a perspective on use in the clinical setting. Am J Ophthalmol. 151 (5), 745-751 (2011).
  36. Khoobehi, B., Peyman, G. A. Fluorescent labeling of blood cells for evaluation of retinal and choroidal circulation. Ophthalmic Surg Lasers. 30 (2), 140-145 (1999).
  37. Kornfield, T. E., Newman, E. A. Regulation of blood flow in the retinal trilaminar vascular network. J Neurosci. 34 (34), 11504-11513 (2014).
  38. Kornfield, T. E., Newman, E. A. Measurement of Retinal Blood Flow Using Fluorescently Labeled Red Blood Cells. eNeuro. 2 (2), (2015).
  39. Matsuda, N., et al. Visualization of leukocyte dynamics in the choroid with indocyanine green. Invest Ophthalmol Vis Sci. 37 (11), 2228-2233 (1996).
  40. Wang, Y., Lu, A., Gil-Flamer, J., Tan, O., Izatt, J. A., Huang, D. Measurement of total blood flow in the normal human retina using Doppler Fourier-domain optical coherence tomography. Br J Ophthalmol. 93 (5), 634-637 (2009).
  41. Wang, Y., Fawzim, A., Tan, O., Gil-Flamer, J., Huang, D. Retinal blood flow detection in diabetic patients by Doppler Fourier domain optical coherence tomography. Opt Express. 17 (5), 4061-4073 (2009).
  42. Srinivas, S., Tan, O., Wu, S., Nittala, M. G., Huang, D., Varma, R., Sadda, S. R. Measurement of retinal blood flow in normal Chinese-American subjects by Doppler Fourier-domain optical coherence tomography. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (3), 1569-1574 (2015).
  43. Sugiyama, T., Araie, M., Riva, C. E., Schmetterer, L., Orgul, S. Use of laser speckle flowgraphy in ocular blood flow research. Acta Ophthalmol. 88 (7), 723-729 (2010).
  44. Nakano, Y., Shimazaki, T., Kobayashi, N., Miyoshi, Y., Ono, A., Kobayashi, M., Shiragami, C., Hirooka, K., Tsujikawa, A. Retinal Oximetry in a Healthy Japanese Population. PLoS One. 11 (7), 0159650 (2016).
  45. Turksever, C., Orgul, S., Todorova, M. G. Reproducibility of retinal oximetry measurements in healthy and diseased retinas. Acta Ophthalmol. 93 (6), 439-445 (2015).
  46. Sharp, P. F., Manivannan, A., Xu, H., Forrester, J. V. The scanning laser ophthalmoscope-a review of its role in bioscience and medicine. Phys Med Biol. 49 (7), 1085-1096 (2004).
  47. Clermont, A. C., Aiello, L. P., Mori, F., Aiello, L. M., Bursell, S. E. Vascular endothelial growth factor and severity of nonproliferative diabetic retinopathy mediate retinal hemodynamics in vivo: a potential role for vascular endothelial growth factor in the progression of nonproliferative diabetic retinopathy. Am J Ophthalmol. 124 (4), 433-446 (1997).
  48. Nguyen, H. T., et al. Retinal blood flow is increased in type 1 diabetes mellitus patients with advanced stages of retinopathy. BMC Endocr Disord. 16 (1), 25 (2016).
  49. Schumann, J., Orgül, S., Gugleta, K., Dubler, B., Flammer, J. Interocular difference in progression of glaucoma correlates with interocular differences in retrobulbar circulation. Am J Ophthalmol. 129 (6), 728-733 (2000).

Tags

ErythrocytesLeukocytesRetinal CirculationMouseFluorescent Dye LabelingICGSodium FluoresceinScanning Laser OphthalmoscopeBlood Cell Flow DynamicsRetinal Diseases
check_url/fr/55495?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Agrawal, R., Balne, P. K., Tun, S. B. B., Sia Wey, Y., Khandelwal, N., Barathi, V. A. Fluorescent Dye Labeling of Erythrocytes and Leukocytes for Studying the Flow Dynamics in Mouse Retinal Circulation. J. Vis. Exp. (125), e55495, doi:10.3791/55495 (2017).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image