マウス網膜循環における血流動態を調べるための赤血球および白血球の蛍光色素標識
Summary
眼循環中の標識された血液細胞の生細胞イメージングは、糖尿病性網膜症および加齢性黄斑変性における炎症および虚血に関する情報を提供し得る。血球を標識し、網膜循環中の標識細胞を画像化するプロトコルが記載されている。
Abstract
網膜および脈絡膜血流動態は、緑内障、糖尿病性網膜症、加齢性黄斑変性（AMD）および他の眼炎症状態などの様々な眼疾患の病態生理学および後遺症についての洞察を提供し得る。また、眼の治療反応をモニターするのに役立ちます。標識された細胞の生細胞イメージングと結びついた血液細胞の適切な標識は、網膜および脈絡膜循環における血流動態の調査を可能にする。ここでは、マウス赤血球および白血球のそれぞれ1.5％インドシアニングリーン（ICG）および1％ナトリウムフルオレセイン標識の標準化プロトコルを記載する。 C57BL / 6Jマウス（野生型）の網膜循環中の標識された細胞を視覚化するために走査型レーザー検眼鏡（SLO）を適用した。両方の方法は、マウス網膜循環において明瞭な蛍光標識細胞を示した。これらの標識方法は、様々な眼疾患モデル。
Introduction
網膜および脈絡膜循環における血球の流動ダイナミクスの研究は、潜在的に視力を脅かす眼疾患および他の眼の炎症状態の病因の理解に不可欠である。しかし、蛍光色素の血漿タンパク質への結合を含む従来の血管造影技術は、赤血球または白血球の動態に関する情報を提供していない1 。赤血球網膜流動ダイナミクスは、様々な炎症状態における細胞の移動、認識、接着および破壊を理解するために、網膜における代謝的に効率的な循環および白血球流動の研究に重要である2 。種々の細胞タイプの同定および特徴付けに使用されるいくつかの蛍光分子がある3 。血液細胞の血行動態は、それらを適切な蛍光で染色することによって測定することができる適切なイメージング技術を適用する4 。
加齢性黄斑変性症（AMD）や糖尿病性網膜症（DR）のような眼内疾患の炎症反応の存在には、病変部にリンパ球が蓄積している5,6 。組織内の免疫細胞を追跡することは、病因のメカニズムに関与する複雑な事象を理解するのに役立ちます。初期の研究では、 51 Crや125 Iのような放射性同位体を細胞トレーサーとして用いた。これらの色素は毒性であり、細胞生存率に影響を及ぼす。放射性マーカー3 Hおよび14 Cは、それらの低い放出エネルギーのために細胞に対して毒性が低いが、系7,8 においてそれらのシグナルを検出することは困難である。関連する潜在的な問題を克服するために、いくつかの蛍光色素が導入された蛍光顕微鏡法とフローサイトメトリーを用いたインビトロでのリンパ球遊走の追跡9,10 。 Hoechst 33342およびチアゾールオレンジは、インビボでリンパ球を追跡するために使用されるDNA結合蛍光色素である。 Hoechst 33342は、DNAのATリッチ領域に結合し、膜透過性であり、2〜4日間蛍光シグナルを保持し、クエンチング9,10 に耐性がある。ヘキスト33342およびチアゾールオレンジの欠点は、リンパ球増殖の阻害11および短い半減期9である 。
カルセイン-AM、フルオレセインジアセテート（FDA）、2 '、7'-ビス – （2-カルボキシエチル）-5-（および-6） – カルボキシフルオレセイン、アセトキシメチルエステル（BCECF-AM）、5-（および-6） – （CFDA）、および5-（および-6） – カルボキシフルオレセインジアセテートアセトキシメチルエステル（CFDA-AM）リンパ球移動研究に用いられる細胞質蛍光色素である。しかし、FDA、CFDAおよびCFDA-AMは細胞内の保持率が低い9 。 BCECF-AMは、増殖応答を低下させ、走化性およびスーパーオキシド産生に影響を及ぼす9,12。カルセイン-AMは蛍光色素であり、短期インビボリンパ球遊走研究に有用である。それは強い蛍光シグナルを放出し、細胞機能の大部分を妨げず、3日まで蛍光シグナルを保持する（ 12,13） 。フルオレセインイソチオシアネート（FITC）およびカルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（CFDA-SE）は、リンパ球の移動研究に使用される共有結合性の蛍光色素です。 FITCは、細胞生存率に影響を示さず、Tリンパ球14,15よりもBリンパ球との親和性が強い</sup>。 CFDA-SEで標識されたリンパ球は、8週間以上および8細胞分裂までの間、インビボで追跡することができる9,16。 C18ジ（1,1'-ジオクタデシル-3,3,3 '、3'-テトラメチルインドカルボシアニン過塩素酸塩）、DiO（3,3'-ジオクタデシルオキサカルボシアニン過塩素酸塩）、Paul Karl Horan（PKH）2、PKH3およびPKH26は、白血球および赤血球を標識するために使用される蛍光親油性カルボシアニン色素を挿入する。 C18 DilおよびDiOは、細胞膜に取り込まれるとより高いシグナルを示し、比較的毒性がない12,17。 PKH2、PKH3およびPKH26標識細胞は、毒性の低い18,19,20,21,22の蛍光シグナルの良好な保持を示す。しかし、PKH2はCD62L発現をダウンレギュレートし、 mphocyte viability 23 。
上記の研究の大部分は、リンパ球におけるリンパ球の移動および増殖を追跡し、非眼球循環における標識された赤血球を研究するために行われてきた。眼球循環中の血液細胞を研究するための標識技術を応用した研究はほとんどない。走査型レーザー検眼鏡（SLO）の適用は、眼底血管撮影法24によって網膜および脈絡膜循環中の標識細胞をインビボで研究することに大きな利点を有する。 SLO 25,26,27,28,29,30,32,34,36,38,40,42,44,46,56,56,58,56,56,56,56,56,56,56,56,56,56,56,56,56,56,56,56,56,58,56,56,56,56,56,56,56,57,58,56,56,56,56,56,57,58,59,56,56,56,56,56,56,56,56class = "xref"> 31,32,33,34 。アクリジンオレンジの光毒性および発がん性26,27 、 FITCと細胞活性の干渉、および網膜および脈絡膜血管の解像度のための血管内造影剤の必要性は、インビボ動物実験29 におけるそれらの適用を制限する。フルオレセインナトリウムおよびICGは、食品医薬品局によって承認された非毒性であり、ヒトでの試験に安全です32,35 。フローダイナミックス研究の大部分は、白血球または赤血球の標識および網膜および脈絡膜血管におけるその視覚化に関連する36,37,38,39 </sアップ>。ここでは、赤血球のICGラベリング、白血球のフルオレセインナトリウム標識、およびSLOを用いたマウス網膜循環における可視化標識細胞の追跡の標準化プロトコルを記載する。
Protocol
Representative Results
Discussion
網膜および脈絡膜循環における血行動態の研究は、多くの眼疾患の病態生理を理解する上で不可欠です。網膜循環における血流動態は、フーリエドメイン光コヒーレンストモグラフィ（FD-OCT）、レーザースペックルフローグラフィ（LSFG）および網膜オキシメトリーによって研究することができる。これらの方法は、網膜循環路40,41,42,43,44,45における全血流を研究するために異なるアプローチ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究プロジェクトはシンガポール国家医学研究評議会（NMRC）のNew Investigator助成金のもとで資金提供された。研究チームは、2012年11月から2014年10月まで、National Medical Research Council（NMRC）の海外研究訓練フェローシップの下、University College of Ophthalmology（IoO）、University College（UCL）のAgrawal博士に研究訓練を教えていただきます。 David Shima。 Agrawal博士は、細胞を標識し、Shima博士の研究室でライブイメージングの概念と技術を取得しました。チームはDavid Shima教授、Kenith Meissner教授、Peter Lundh博士、Daiju Iwata教授からの訓練フェローシップの監督と指導を認めたいと思っています。
Materials
| Cardiogreen polymethine dye (Indocyanine green) | Sigma Aldrich | 12633-50MG | |
| Fluorescein 100 mg/mL | Novartis | U1705A/H-1330292 | |
| 10X Phosphate-buffered saline (PBS) Ultra Pure Grade | 1st BASE | BUF-2040-10X1L | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A7906-100G | |
| Microtainer tubes with K2E (K2EDTA) – EDTA concentration – 1.8 mg/mL of blood | BD, USA | REF 365974 | |
| Histopaque 1077 solution | Sigma Aldrich | 10771 | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 05-413-401 | |
| Microcentrifuge tubes 2mL | Axygen | MCT-200-C-S | |
| Vortex mixer | Insta BioAnalytik pte. ltd | FINE VORTEX | |
| Shaker incubator | Lab Tech | ||
| Ceva Ketamine injection (Ketamine hydrochloride 100mg/mL) | Ceva | KETALAB03 | |
| ILIUM XYLAZIL-20 (Xylazine hydrochloride 20mg/Ml) | Troy Laboratories PTY. Limited | LI0605 | |
| 1% Mydriacyl 15 mL (Tropicamide 1%) | Alcon Laboratories, Inc. USA | NDC 0998-0355-15 | |
| 2.5% Mydfrin 5 mL (Phenylephrine hydrochloride 2.5%) | Alcon Laboratories, Inc. USA | NDC 0998-0342-05 | |
| Terumo syringe with needle 1cc/mL Tuberculin | Terumo (Philippenes) Corporation, Philippines | SS-01T2613 | |
| Vidisic Gel 10G | Dr. Gerhard Mann, Chem.-Pharm, Fabrik Gmbh, Berlin, Germany | ||
| Alcohol swabs | Assure medical disposables | 7M-004-L-01 | |
| Confocal laser scanning angiography system (Heidelberg Retina Angiograph 2) | Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Germany | ||
| Hiedelberg Spectralis Viewing Module software, v4.0 | Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Germany | ||
| Fluorescent microscope | ZEISS | Model: axio imager z1 |
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