Assay voor het meten van nucleocytoplasmisch transport in realtime binnen motor neuronachtige NSC-34 cellen
Summary
Dit protocol beschrijft een methode om de nucleocytoplasmatische transportsnelheid binnen motor neuronachtige NSC-34 cellen nauwkeurig te meten door de real-time verandering in de nucleaire invoer van een NLS-NES-GFP eiwit te kwantificeren.
Abstract
Nucleocytoplasmisch transport verwijst naar de import en export van grote moleculen uit de celkern. Onlangs hebben een aantal studies een verband getoond tussen amyotrofische laterale sclerose (ALS) en afwijkingen in de nucleocytoplasmatische route. ALS is een neurodegeneratieve ziekte die de motorneuronen beïnvloedt en resulteert in verlamming en uiteindelijk in de dood, binnen gemiddeld 2-5 jaar. De meeste gevallen van ALS zijn sporadisch zonder enige schijnbare genetische koppeling, maar 10% worden op een dominante manier geërfd. Onlangs werden hexanucleotide-herhalingsuitbreidingen (HREs) in het chromosoom 9 open leesframe 72 (C9orf72) gen geïdentificeerd als een genetische oorzaak van ALS en frontotemporale dementie (FTD). Het is belangrijk dat verschillende groepen onlangs hebben voorgesteld dat deze mutanten nucleocytoplasmisch transport beïnvloeden. Deze studies hebben meestal het uiteindelijke resultaat en de manifestaties veroorzaakt door HRE's op het nucleocytoplasmisch vervoer laten zien, maar ze tonen geen dysfunctie van nucleaire transport inechte tijd. Als gevolg hiervan kan alleen ernstige nucleocytoplasmische transporttekorten worden bepaald, hoofdzakelijk door hoge overexpressie of exogene eiwitinbreng.
Dit protocol beschrijft een nieuwe en zeer gevoelige test om de nucleocytoplasmatische transportdysfunctie in realtime te evalueren en te kwantificeren. De invoerhoeveelheid van een NLS-NES-GFP-eiwit (shuttle-GFP) kan in real-time worden gekwantificeerd met behulp van fluorescerende microscopie. Dit wordt uitgevoerd door gebruik te maken van een exportinhibitor, waardoor de shuttle GFP alleen de kern kan binnendringen. Om de test te valideren, werden de C9orf72 HRE vertaalde dipeptide herhalingen, poly (GR) en poly (PR), die eerder werden getoond om nucleocytoplasmisch transport te verstoren, gebruikt. Met behulp van de beschreven test werd een 50% daling van de nucleaire importrate waargenomen in vergelijking met de controle. Met behulp van dit systeem kunnen kleine veranderingen in nucleocytoplasmisch transport worden onderzocht en het vermogen van verschillende factoren om een nucleocytoplasmatische tr (zelfs gedeeltelijk) te reddenAnsport defect kan worden bepaald.
Introduction
Het nucleaire porecomplex (NPC) controleert de invoer en uitvoer van grote moleculen in en uit de celkern. In tegenstelling tot kleine moleculen, die de nucleus zonder regulatie 1 kunnen binnengaan, wordt het transport van grotere moleculen sterk gecontroleerd door de NPC. Deze grote moleculen, zoals eiwitten en RNA, associëren met transportfactoren, waaronder importins en exportins, worden geïmporteerd en geëxporteerd vanuit de kern 2 . Om geïmporteerd te worden, moeten eiwitten een klein peptidemotief bevatten, in het algemeen een nucleair lokalisatiesignaal (NLS) genoemd, dat gebonden is door importins 2 . Deze sequenties van aminozuren fungeren als een label en zijn verschillend in samenstelling 3 , 4 . Proteïnen kunnen worden geëxporteerd van de kern naar het cytoplasma door hun associatie met exportinS, die een signaalsequentie binden, in het algemeen genaamd een nucleair uitvoer signaal (NES) 2 . Zowel importins als exportins zijn in staat om hun lading te transporteren door de regulering van het kleine Ras-gerelateerde nucleaire eiwit GTPase (Ran) 2 . Ran is gebleken te bestaan in verschillende conformationalstaten, afhankelijk van of het aan GTP of het BBP is gebonden. Wanneer gebonden aan GTP, kan Ran binden aan importins of exportins. Bij het binden aan RanGTP vrijmaken importins hun lading, terwijl exportins RanGTP moeten binden om een complex te vormen met hun exportlading. De dominante nucleotide bindende toestand van Ran hangt af van de plaats in de kern (RanGTP) of het cytoplasma (RanGDP).
Recentelijk hebben een aantal studies een verband getoond tussen verminderingen in de nucleocytoplasmatische route en zowel amyotrofische laterale sclerose (ALS) en frontotemporale dementie (FTD) 5 , 6 </sup> , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 . ALS is een progressieve en fatale neurodegeneratieve ziekte die zowel de bovenste als de onderste motorneuronen (MNs) 13 beïnvloedt, waardoor de verlamming en uiteindelijk in de dood binnen 2 tot 5 jaar gemiddeld zijn. De meeste gevallen van ALS zijn geclassificeerd als sporadisch (SALS), zonder enige schijnbare genetische koppeling, maar 10% is overheersend geërfd (familiale ALS; FALS). Onlangs werden hexanucleotide herhalingsuitbreidingen (HREs) in het chromosoom 9 open leesframe 72 (C9orf72) gen geïdentificeerd 14 , 15 als een genetische oorzaak van ALS en FTD. Deze mutanten staan voor 30-40% van de FALS-gevallen 16 , en verschillende studies hebben aangevoerdDat ze toxiciteit veroorzaken door nucleocytoplasmisch transport 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 te beïnvloeden.
Deze studies hebben meestal de laatste uitkomsten en manifestaties van HRE's op nucleocytoplasmisch transport getoond, maar ze tonen niet in real-time nucleocytoplasmatische verstoring. Als gevolg hiervan is alleen ernstige nucleocytoplasmische transporttekorten geëvalueerd 11 , 17 , 18 .
Dit protocol beschrijft een nieuw en veRij gevoelige test om de nucleocytoplasmatische transportdysfunctie in realtime te evalueren en te kwantificeren. De invoerhoeveelheid van een NLS-NES-GFP-eiwit (shuttle-GFP) kan in real-time worden gekwantificeerd met behulp van fluorescerende microscopie. Dit wordt gedaan met behulp van een exportinhibitor, zoals eerder beschreven 18 , waardoor de shuttle-GFP alleen in de kern komt. Met behulp van florescerende microscopie en een software die in staat is fluorescerende veranderingen in real-time te kwantificeren, is het mogelijk om geleidelijke veranderingen in de fluorescentie-intensiteit van de shuttle-GFP, die zich in de kern bevindt, te kwantificeren. Als gevolg hiervan kan een Michaelis-Menten-achtige verzadigingscurve van de fluorescentie-tot-tijd-as, die de hoeveelheid nucleaire shuttle-GFP op elk gewenst moment vertegenwoordigt, worden gemaakt. Door gebruik te maken van de initiële lineaire snelheid van de krommen, is het mogelijk om een helling te genereren, die de snelheid van toegang tot de kern voor fluorescentie verzadiging vertegenwoordigt.
Om de test te valideren, vertaalt hetD C9orf72 dipeptide herhalingen, poly (GR) en poly (PR), die eerder gerapporteerd zijn om nucleocytoplasmisch transport te verstoren, werden gebruikt 5 , 7 , 8 , 10 , 12 . Met behulp van deze test werd een 50% daling van de nucleaire invoerpercentage waargenomen in vergelijking met de controle. Met dit systeem kunnen kleine veranderingen in nucleocytoplasmisch transport worden onderzocht. Bovendien kan het vermogen van verschillende factoren om een nucleocytoplasmatisch transportdefect te redden, worden bepaald.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol toont een zeer gevoelige en kwantitatieve nieuwe analyse om de kleine veranderingen in nucleocytoplasmisch vervoer te evalueren. Met behulp van dit systeem is het mogelijk om nucleocytoplasmatisch transport en de dysfunctie ervan in real-time te observeren en te meten, niet alleen grote defecten die leiden tot dramatische veranderingen in eiwitverdeling. Deze analyse heeft niet alleen een gevoeligheids voordeel, maar vereist ook weinig voorbereiding, is goedkoop, en is een zeer makkelijke en lage-engagement…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij bedanken alle leden van het AI laboratorium voor hun nuttige opmerkingen en suggesties. Wij danken prof. Mark Hipp (Max Planck Instituut voor Biochemie) om ons te voorzien van de shuttle-GFP vector. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Israëlische Wetenschapsstichting (ISF # 124/14), de Binational Science Foundation (BSF # 2013325), FP7 Marie Curie Career Integration Grant (CIG # 333794) en het National Institute for Psychobiology in Israël NIPI # b133-14 / 15).
Materials
| Mouse Motor Neuron-Like hybrid Cell Line (NSC-34) | tebu-bio | CLU140-A |
| DMEM 4.5g/L L-glucose | Biological Industries | 01-055-1A |
| FBS European Grade | Biological Industries | 04-007-1A |
| SL 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004030 |
| Thermo Forma Series ii Water Jacketed CO2 Incubator | Thermo Scientific | 3111 |
| Cover glass 12mm dia. thick 0.13-0.17mm | Bar Naor LTD | |
| TurboFect Transfection Reagent | Thermo Scientific | R0531 |
| Axiovert 100 inverted microscope | Zeiss | |
| IMAGING WORKBENCH 2 | Axon Instruments | |
| Leptomycin B | Sigma | L2913 |
| PBS | Biological Industries | 02-023-1A |
| Homogenizer motor/control/chuck/90-degree clamp | Glas-Col | 099C K5424CE |
| MicroCL 17R Centrifuge, Refrigerated | Thermo Scientific | 75002455 |
References
- Alberts, B. . Molecular biology of the cell. , (2002).
- Freitas, N., Cunha, C. Mechanisms and signals for the nuclear import of proteins. Curr Genomics. 10, 550-557 (2009).
- Kalderon, D., Roberts, B. L., Richardson, W. D., Smith, A. E. A short amino acid sequence able to specify nuclear location. Cell. 39, 499-509 (1984).
- la Cour, T., et al. Analysis and prediction of leucine-rich nuclear export signals. Protein Eng Des Sel. 17, 527-536 (2004).
- Boeynaems, S., et al. Drosophila screen connects nuclear transport genes to DPR pathology in c9ALS/FTD. Sci Rep. 6, 20877 (2016).
- Freibaum, B. D., et al. GGGGCC repeat expansion in C9orf72 compromises nucleocytoplasmic transport. Nature. 525, 129-133 (2015).
- Jovicic, A., et al. Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS. Nat Neurosci. 18, 1226-1229 (2015).
- Kwon, I., et al. Poly-dipeptides encoded by the C9orf72 repeats bind nucleoli, impede RNA biogenesis, and kill cells. Science. 345, 1139-1145 (2014).
- Rossi, S., et al. Nuclear accumulation of mRNAs underlies G4C2-repeat-induced translational repression in a cellular model of C9orf72 ALS. J Cell Sci. 128, 1787-1799 (2015).
- Shi, K. Y., et al. Toxic PRn poly-dipeptides encoded by the C9orf72 repeat expansion block nuclear import and export. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2017).
- Zhang, K., et al. The C9orf72 repeat expansion disrupts nucleocytoplasmic transport. Nature. 525, 56-61 (2015).
- Zhang, Y. J., et al. C9ORF72 poly(GA) aggregates sequester and impair HR23 and nucleocytoplasmic transport proteins. Nat Neurosci. 19, 668-677 (2016).
- Cleveland, D. W., Rothstein, J. D. From Charcot to Lou Gehrig: deciphering selective motor neuron death in ALS. Nat Rev Neurosci. 2, 806-819 (2001).
- DeJesus-Hernandez, M., et al. Expanded GGGGCC hexanucleotide repeat in noncoding region of C9ORF72 causes chromosome 9p-linked FTD and ALS. Neuron. 72, 245-256 (2011).
- Renton, A. E., et al. A hexanucleotide repeat expansion in C9ORF72 is the cause of chromosome 9p21-linked ALS-FTD. Neuron. 72, 257-268 (2011).
- Boeve, B. F., et al. Characterization of frontotemporal dementia and/or amyotrophic lateral sclerosis associated with the GGGGCC repeat expansion in C9ORF72. Brain. 135, 765-783 (2012).
- Haeusler, A. R., Donnelly, C. J., Rothstein, J. D. The expanding biology of the C9orf72 nucleotide repeat expansion in neurodegenerative disease. Nat Rev Neurosci. 17, 383-395 (2016).
- Woerner, A. C., et al. Cytoplasmic protein aggregates interfere with nucleocytoplasmic transport of protein and RNA. Science. 351, 173-176 (2016).
- Tao, Z., et al. Nucleolar stress and impaired stress granule formation contribute to C9orf72 RAN translation-induced cytotoxicity. Hum Mol Genet. 24, 2426-2441 (2015).
- Wen, X., et al. Antisense proline-arginine RAN dipeptides linked to C9ORF72-ALS/FTD form toxic nuclear aggregates that initiate in vitro and in vivo neuronal death. Neuron. 84, 1213-1225 (2014).
