Analisi per misurare il trasporto nucleocitoplasmatico in tempo reale all'interno di motori neuronici come le cellule NSC-34
Summary
Questo protocollo descrive un metodo per misurare sensibilmente il tasso di trasporto nucleocitoplasmatico nelle cellule NSC-34 come motori neuronali quantificando il cambiamento in tempo reale nell'importazione nucleare di una proteina NLS-NES-GFP.
Abstract
Il trasporto nucleocitoplasmatico si riferisce all'importazione e all'esportazione di grandi molecole dal nucleo cellulare. Recentemente, un certo numero di studi hanno mostrato una connessione tra la sclerosi laterale amyotrofica (ALS) e le alterazioni del percorso nucleocitoplasmatico. L'ALS è una malattia neurodegenerativa che colpisce i neuroni motori e che porta alla paralisi e, infine, alla morte, in media di 2-5 anni. La maggior parte dei casi di ALS sono sporadici, privi di qualsiasi legame genetico apparente, ma il 10% viene ereditato in maniera dominante. Recentemente, le espansioni di ripetizione di esanucleotidi (HRE) nel cromosoma 9 aperto frame di lettura 72 (C9orf72) sono stati identificati come una causa genetica di ALS e demenza frontotemporale (FTD). Importante, diversi gruppi hanno recentemente proposto che queste mutanti influenzino il trasporto nucleocitoplasmatico. Questi studi hanno mostrato in gran parte l'esito finale e le manifestazioni causate dagli HRE sul trasporto nucleocitoplasmatico, ma non dimostrano disfunzioni del trasporto nucleare intempo reale. Di conseguenza, solo la carenza nucleocitoplasmatica di trasporto può essere determinata, soprattutto a causa di un'elevata espressione o di inserimento proteico esogeno.
Questo protocollo descrive un nuovo e molto sensibile dosaggio per valutare e quantificare la disfunzione del trasporto nucleocitoplasmatico in tempo reale. Il tasso di importazione di una proteina NLS-NES-GFP (shuttle-GFP) può essere quantificato in tempo reale utilizzando microscopia fluorescente. Questo viene eseguito usando un inibitore dell'esportin, consentendo così alla navetta GFP di entrare solo nel nucleo. Per convalidare il dosaggio, sono state utilizzate le ripetizioni dei dipeptidi tradotte da C9orf72 HRE, poli (GR) e poli (PR), che sono state precedentemente mostrate per interrompere il trasporto nucleocitoplasmico. Utilizzando il saggio descritto, è stata osservata una diminuzione del 50% del tasso di importazione nucleare rispetto al controllo. Utilizzando questo sistema, possono essere esaminati piccoli cambiamenti nel trasporto nucleocitoplasmatico e la capacità di diversi fattori di salvarlo (anche parzialmente) di un nucleo nucleotiplasmaticoPuò essere determinato il difetto di risposta.
Introduction
Il complesso dei pori nucleari (NPC) controlla l'importazione e l'esportazione di grandi molecole in e fuori dal nucleo delle cellule. Contrariamente alle piccole molecole, che possono entrare nel nucleo senza regola 1 , il trasporto di molecole più grandi è fortemente controllato dal NPC. Queste grandi molecole, come le proteine e l'RNA, associano fattori di trasporto, comprese le importazioni e le esportazioni, da importare ed esportare dal nucleo 2 . Per essere importato, le proteine devono contenere un piccolo motivo peptidico, generalmente chiamato un segnale di localizzazione nucleare (NLS), che è vincolato dalle importanti 2 . Queste sequenze di aminoacidi agiscono come un tag e sono diverse nella composizione 3 , 4 . Le proteine possono essere esportate dal nucleo al citoplasma a causa della loro associazione con l'exportinS, che legano una sequenza di segnali, generalmente chiamata segnale di esportazione nucleare (NES) 2 . Entrambe le importazioni e le esportazioni sono in grado di trasportare il loro carico a causa della regolazione della piccola proteina nucleare RTP correlata GTPase (Ran) 2 . Ran ha dimostrato di esistere in diversi stati conformazionali a seconda che sia vincolato al GTP o al PIL. Quando legato a GTP, Ran può legarsi a importini o esportazioni. Dopo l'adesione a RanGTP, le importazioni rilasciano il loro carico, mentre le esportazioni devono obbligare RanGTP a formare un complesso con il loro carico di esportazione. Lo stato di legame nucleotidico dominante di Ran dipende dalla sua collocazione nel nucleo (RanGTP) o nel citoplasma (RanGDP).
Recentemente, un certo numero di studi hanno mostrato una connessione tra disturbi del percorso nucleocitoplasmatico e sia la sclerosi laterale amiotrofica (ALS) e la demenza frontotemporale (FTD) 5 , 6 </sup> , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 . L'ALS è una malattia neurodegenerativa progressiva e fatale che colpisce sia i neuroni motori superiori che inferiori (MN) 13 e provoca paralisi e, infine, nella morte, in media da 2-5 anni. La maggior parte dei casi di ALS sono classificati come sporadici (SALS), senza alcun legame genetico apparente, ma il 10% è ereditato in maniera dominante (ALS familiare; FALS). Recentemente, le espansioni di ripetizione dell'esanucleotide (HRE) nel cromosoma 9 aperto frame di lettura 72 (C9orf72) sono stati identificati 14,15 come causa genetica di ALS e FTD. Questi mutanti rappresentano il 30-40% dei casi FALS 16 e diversi studi hanno sostenutoChe provocano tossicità colpendo il trasporto nucleocitoplasmico 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 .
Questi studi hanno mostrato in gran parte i risultati finali e le manifestazioni degli HRE sul trasporto nucleocitoplasmatico, ma non dimostrano la rottura nucleocitoplasmatica in tempo reale. Di conseguenza, solo la mancanza di trasporto nucleocitoplasmatico grave è stata valutata 11 , 17 , 18 .
Questo protocollo descrive un nuovo e vePer valutare e quantificare la disfunzione del trasporto nucleocitoplasmatico in tempo reale. Il tasso di importazione di una proteina NLS-NES-GFP (shuttle-GFP) può essere quantificato in tempo reale utilizzando microscopia fluorescente. Ciò avviene usando un inibitore dell'esportin, come descritto in precedenza 18 , consentendo così al shuttle-GFP di entrare solo nel nucleo. Utilizzando la microscopia fluorescente e un software in grado di quantificare i cambiamenti fluorescenti in tempo reale, è possibile quantificare i cambiamenti graduali nell'intensità di fluorescenza del shuttle-GFP, che si trova nel nucleo. Di conseguenza, può essere effettuata una curva di saturazione simile a Michaelis-Menten dell'asse fluorescenza-tempo, che rappresenta la quantità di GFP nucleare in un dato momento. Utilizzando la velocità lineare iniziale delle curve, è possibile generare una pendenza che rappresenta la velocità di ingresso nel nucleo prima della saturazione della fluorescenza.
Per convalidare il saggio, tradurreRipetizioni di dipeptide di C9orf72, poli (GR) e poli (PR), precedentemente riportate per interrompere il trasporto nucleocitoplasmatico, sono state utilizzate 5 , 7 , 8 , 10 , 12 . Utilizzando questo saggio, è stata osservata una diminuzione del 50% del tasso di importazione nucleare rispetto al controllo. Utilizzando questo sistema, possono essere esaminati piccoli cambiamenti nel trasporto nucleocitoplasmatico. Inoltre, può essere determinata la capacità di diversi fattori per salvare un difetto di trasporto nucleocitoplasmatico.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo dimostra un nuovo test molto sensibile e quantitativo per valutare i minimi cambiamenti nel trasporto nucleocitoplasmatico. Utilizzando questo sistema, è possibile osservare e misurare il trasporto nucleocitoplasmatico e la sua disfunzione in tempo reale, non solo i grandi difetti che comportano cambiamenti drammatici nella distribuzione delle proteine. Questo test non solo ha un vantaggio di sensibilità, ma richiede anche una piccola preparazione, è poco costoso ed è un saggio molto facile e poco …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo tutti i membri del laboratorio AI per i loro utili commenti e suggerimenti. Vorremmo ringraziare il Prof. Mark Hipp (Istituto Max Planck per la Biochimica) per fornirci il vettore shuttle-GFP. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della Fondazione israeliana di scienza (ISF # 124/14), della Fondazione Binational Science (BSF # 2013325), della FP7 Marie Curie Career Integration Grant (CIG # 333794) e dell'Istituto Nazionale di Psicobiologia in Israele NIPI # b133-14 / 15).
Materials
| Mouse Motor Neuron-Like hybrid Cell Line (NSC-34) | tebu-bio | CLU140-A |
| DMEM 4.5g/L L-glucose | Biological Industries | 01-055-1A |
| FBS European Grade | Biological Industries | 04-007-1A |
| SL 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004030 |
| Thermo Forma Series ii Water Jacketed CO2 Incubator | Thermo Scientific | 3111 |
| Cover glass 12mm dia. thick 0.13-0.17mm | Bar Naor LTD | |
| TurboFect Transfection Reagent | Thermo Scientific | R0531 |
| Axiovert 100 inverted microscope | Zeiss | |
| IMAGING WORKBENCH 2 | Axon Instruments | |
| Leptomycin B | Sigma | L2913 |
| PBS | Biological Industries | 02-023-1A |
| Homogenizer motor/control/chuck/90-degree clamp | Glas-Col | 099C K5424CE |
| MicroCL 17R Centrifuge, Refrigerated | Thermo Scientific | 75002455 |
References
- Alberts, B. . Molecular biology of the cell. , (2002).
- Freitas, N., Cunha, C. Mechanisms and signals for the nuclear import of proteins. Curr Genomics. 10, 550-557 (2009).
- Kalderon, D., Roberts, B. L., Richardson, W. D., Smith, A. E. A short amino acid sequence able to specify nuclear location. Cell. 39, 499-509 (1984).
- la Cour, T., et al. Analysis and prediction of leucine-rich nuclear export signals. Protein Eng Des Sel. 17, 527-536 (2004).
- Boeynaems, S., et al. Drosophila screen connects nuclear transport genes to DPR pathology in c9ALS/FTD. Sci Rep. 6, 20877 (2016).
- Freibaum, B. D., et al. GGGGCC repeat expansion in C9orf72 compromises nucleocytoplasmic transport. Nature. 525, 129-133 (2015).
- Jovicic, A., et al. Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS. Nat Neurosci. 18, 1226-1229 (2015).
- Kwon, I., et al. Poly-dipeptides encoded by the C9orf72 repeats bind nucleoli, impede RNA biogenesis, and kill cells. Science. 345, 1139-1145 (2014).
- Rossi, S., et al. Nuclear accumulation of mRNAs underlies G4C2-repeat-induced translational repression in a cellular model of C9orf72 ALS. J Cell Sci. 128, 1787-1799 (2015).
- Shi, K. Y., et al. Toxic PRn poly-dipeptides encoded by the C9orf72 repeat expansion block nuclear import and export. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2017).
- Zhang, K., et al. The C9orf72 repeat expansion disrupts nucleocytoplasmic transport. Nature. 525, 56-61 (2015).
- Zhang, Y. J., et al. C9ORF72 poly(GA) aggregates sequester and impair HR23 and nucleocytoplasmic transport proteins. Nat Neurosci. 19, 668-677 (2016).
- Cleveland, D. W., Rothstein, J. D. From Charcot to Lou Gehrig: deciphering selective motor neuron death in ALS. Nat Rev Neurosci. 2, 806-819 (2001).
- DeJesus-Hernandez, M., et al. Expanded GGGGCC hexanucleotide repeat in noncoding region of C9ORF72 causes chromosome 9p-linked FTD and ALS. Neuron. 72, 245-256 (2011).
- Renton, A. E., et al. A hexanucleotide repeat expansion in C9ORF72 is the cause of chromosome 9p21-linked ALS-FTD. Neuron. 72, 257-268 (2011).
- Boeve, B. F., et al. Characterization of frontotemporal dementia and/or amyotrophic lateral sclerosis associated with the GGGGCC repeat expansion in C9ORF72. Brain. 135, 765-783 (2012).
- Haeusler, A. R., Donnelly, C. J., Rothstein, J. D. The expanding biology of the C9orf72 nucleotide repeat expansion in neurodegenerative disease. Nat Rev Neurosci. 17, 383-395 (2016).
- Woerner, A. C., et al. Cytoplasmic protein aggregates interfere with nucleocytoplasmic transport of protein and RNA. Science. 351, 173-176 (2016).
- Tao, Z., et al. Nucleolar stress and impaired stress granule formation contribute to C9orf72 RAN translation-induced cytotoxicity. Hum Mol Genet. 24, 2426-2441 (2015).
- Wen, X., et al. Antisense proline-arginine RAN dipeptides linked to C9ORF72-ALS/FTD form toxic nuclear aggregates that initiate in vitro and in vivo neuronal death. Neuron. 84, 1213-1225 (2014).
