Анализ для измерения нуклеоцитоплазматического транспорта в реальном времени в моторных нейроноподобных клетках NSC-34
Summary
Этот протокол описывает метод чувствительного измерения скорости передачи нуклеоцитоплазмы в моторных нейроподобных клетках NSC-34 путем количественного определения изменений в реальном времени в импорте белка NLS-NES-GFP в ядерной области.
Abstract
Нуклеоцитоплазматический транспорт относится к импорту и экспорту крупных молекул из клеточного ядра. Недавно в ряде исследований была показана связь между амиотрофическим латеральным склерозом (ALS) и нарушениями в нуклеоцитоплазматическом пути. ALS – нейродегенеративное заболевание, поражающее двигательные нейроны и приводящее к параличу и, в конечном счете, смерти, в среднем в течение 2-5 лет. Большинство случаев БАС являются спорадическими, отсутствие каких-либо видимых генетических связей, но 10% наследуются доминирующим образом. Недавно были изучены экспансии гексануклеотида (HREs) в открытом раме считывающей рамки 72 (C9orf72) хромосомы 9 как генетическая причина БАС и лобно-височной деменции (FTD). Важно отметить, что различные группы недавно предположили, что эти мутанты влияют на нуклеоцитоплазматический транспорт. Эти исследования в основном показали конечный результат и проявления, вызванные HREs на нуклеоцитоплазматический транспорт, но они не демонстрируют дисфункцию ядерного транспорта вВ реальном времени. В результате может быть определен только тяжелый нуклеоцитоплазматический транспортный дефицит, главным образом из-за высокой избыточной экспрессии или экзогенного введения белка.
Этот протокол описывает новый и очень чувствительный анализ для оценки и количественной оценки дисфункции нуклеоцитоплазматического транспорта в реальном времени. Скорость импорта белка NLS-NES-GFP (челночного GFP) может быть определена количественно в реальном времени с использованием флуоресцентной микроскопии. Это осуществляется с помощью ингибитора exportin, что позволяет челночному GFP только проникать в ядро. Для подтверждения анализа использовали C9orf72 HRE переведённые дипептидные повторы, поли (GR) и поли (PR), которые, как было показано ранее, нарушают нуклеоцитоплазматический перенос. Используя описанный анализ, наблюдалось 50% -ное снижение скорости импорта ядер по сравнению с контролем. Используя эту систему, можно рассмотреть незначительные изменения в нуклеоцитоплазматическом транспорте и способность различных факторов спасти (даже частично) нуклеоцитоплазматическую trAnsport дефект может быть определен.
Introduction
Комплекс ядерных пор (NPC) контролирует импорт и экспорт крупных молекул в и из клеточного ядра. В отличие от малых молекул, которые могут войти в ядро без регуляции 1 , перенос больших молекул строго контролируется NPC. Эти крупные молекулы, такие как белки и РНК, ассоциируются с транспортными факторами, включая импортные и экспортные, которые должны быть импортированы и экспортированы из ядра 2 . Чтобы быть импортированным, белки должны содержать небольшой пептидный мотив, обычно называемый сигналом ядерной локализации (NLS), который связан с importins 2 . Эти последовательности аминокислот действуют как метка и разнообразны по составу 3 , 4 . Белки могут быть экспортированы из ядра в цитоплазму из-за их ассоциации с exportinS, которые связывают сигнальную последовательность, обычно называемую сигналом ядерного экспорта (NES) 2 . Оба importins и exportins способны перевозить их груз из-за регулирования маленького Ras родственного ядерного белка GTPase (Ran) 2 . Было показано, что Ran существует в разных конформационных состояниях в зависимости от того, связан ли он с GTP или ВВП. Когда привязан к GTP, Ran может связываться с importins или exportins. После привязки к RanGTP, importins освобождает свой груз, а exportins должны связывать RanGTP для формирования комплекса с их экспортным грузом. Доминирующее нуклеотидное связывающее состояние Ran зависит от его расположения в ядре (RanGTP) или цитоплазме (RanGDP).
Недавно в ряде исследований была показана связь между нарушениями в нуклеоцитоплазматическом пути и как боковой амиотрофический склероз (ALS), так и лобно-височная деменция (FTD) 5 , 6 </sup> , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 . ALS – это прогрессирующая и фатальная нейродегенеративная болезнь, поражающая как верхние, так и нижние мотонейроны (MN) 13 и приводящая к параличу и, в конечном счете, смерти, в среднем в течение 2-5 лет. Большинство случаев БАС классифицируются как спорадические (SALS), у которых отсутствуют какие-либо видимые генетические связи, но 10% наследуются доминирующим образом (семейная ALS, FALS). В последнее время были выявлены экспрессии гексануклеотида (HREs) в открытом раме считывающей рамки хромосомы 72 (C9orf72) 14,15 как генетическая причина ALS и FTD. Эти мутанты составляют 30-40% случаев FALS 16 , и различные исследования подтверждаютЧто они вызывают токсичность, воздействуя на нуклеоцитоплазматический транспорт 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 .
Эти исследования в основном показали конечные результаты и проявления HREs по нуклеоцитоплазматическому транспорту, но они не демонстрируют нарушения нуклеоцитоплазмы в реальном времени. В результате был оценен только тяжелый нуклеоцитоплазматический транспортный дефицит 11 , 17 , 18 .
Этот протокол описывает новое иЧувствительный анализ для оценки и количественной оценки дисфункции нуклеоцитоплазматического транспорта в реальном времени. Скорость импорта белка NLS-NES-GFP (челночного GFP) может быть определена количественно в реальном времени с использованием флуоресцентной микроскопии. Это делается с использованием ингибитора exportin, как описано ранее 18 , таким образом позволяя челноку-GFP только войти в ядро. Используя флуоресцентную микроскопию и программное обеспечение, способное количественно определять флуоресцентные изменения в реальном времени, можно количественно оценить постепенное изменение интенсивности флуоресценции челночного GFP, расположенного в ядре. В результате может быть сделана кривая насыщения по Михаэлису-Ментену оси флуоресценции-времени, представляющая количество ядерного челнока-GFP в любой момент времени. Используя начальную линейную скорость кривых, можно создать наклон, который представляет скорость входа в ядро до насыщения флуоресценции.
Чтобы подтвердить анализ, перевестиD Дипептидные повторы C9orf72, поли (GR) и поли (PR), которые, как сообщалось ранее, нарушают нуклеоцитоплазматический перенос, были использованы 5 , 7 , 8 , 10 , 12 . Используя этот анализ, наблюдалось 50% -ное снижение уровня импорта ядер по сравнению с контролем. Используя эту систему, можно рассмотреть незначительные изменения в нуклеоцитоплазматическом транспорте. Кроме того, можно определить способность различных факторов спасти нуклеоцитоплазматический транспортный дефект.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол демонстрирует очень чувствительный и количественный новый анализ для оценки минутных изменений в нуклеоцитоплазматическом транспорте. Используя эту систему, можно наблюдать и измерять нуклеоцитоплазматический транспорт и его дисфункцию в реальном времени, а не тольк?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим всех членов лаборатории ИИ за их полезные замечания и предложения. Мы хотели бы поблагодарить профессора Марка Хиппа (Институт биохимии им. Макса Планка) за предоставленный нам вектор челночного GFP. Эта работа была поддержана грантами израильского научного фонда (ISF # 124/14), Бинационального научного фонда (BSF # 2013325), гранта интеграции карьеры Мари-Кюри FP7 (CIG # 333794) и Национального института психобиологии в Израиле NIPI # b133-14 / 15).
Materials
| Mouse Motor Neuron-Like hybrid Cell Line (NSC-34) | tebu-bio | CLU140-A |
| DMEM 4.5g/L L-glucose | Biological Industries | 01-055-1A |
| FBS European Grade | Biological Industries | 04-007-1A |
| SL 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004030 |
| Thermo Forma Series ii Water Jacketed CO2 Incubator | Thermo Scientific | 3111 |
| Cover glass 12mm dia. thick 0.13-0.17mm | Bar Naor LTD | |
| TurboFect Transfection Reagent | Thermo Scientific | R0531 |
| Axiovert 100 inverted microscope | Zeiss | |
| IMAGING WORKBENCH 2 | Axon Instruments | |
| Leptomycin B | Sigma | L2913 |
| PBS | Biological Industries | 02-023-1A |
| Homogenizer motor/control/chuck/90-degree clamp | Glas-Col | 099C K5424CE |
| MicroCL 17R Centrifuge, Refrigerated | Thermo Scientific | 75002455 |
References
- Alberts, B. . Molecular biology of the cell. , (2002).
- Freitas, N., Cunha, C. Mechanisms and signals for the nuclear import of proteins. Curr Genomics. 10, 550-557 (2009).
- Kalderon, D., Roberts, B. L., Richardson, W. D., Smith, A. E. A short amino acid sequence able to specify nuclear location. Cell. 39, 499-509 (1984).
- la Cour, T., et al. Analysis and prediction of leucine-rich nuclear export signals. Protein Eng Des Sel. 17, 527-536 (2004).
- Boeynaems, S., et al. Drosophila screen connects nuclear transport genes to DPR pathology in c9ALS/FTD. Sci Rep. 6, 20877 (2016).
- Freibaum, B. D., et al. GGGGCC repeat expansion in C9orf72 compromises nucleocytoplasmic transport. Nature. 525, 129-133 (2015).
- Jovicic, A., et al. Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS. Nat Neurosci. 18, 1226-1229 (2015).
- Kwon, I., et al. Poly-dipeptides encoded by the C9orf72 repeats bind nucleoli, impede RNA biogenesis, and kill cells. Science. 345, 1139-1145 (2014).
- Rossi, S., et al. Nuclear accumulation of mRNAs underlies G4C2-repeat-induced translational repression in a cellular model of C9orf72 ALS. J Cell Sci. 128, 1787-1799 (2015).
- Shi, K. Y., et al. Toxic PRn poly-dipeptides encoded by the C9orf72 repeat expansion block nuclear import and export. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2017).
- Zhang, K., et al. The C9orf72 repeat expansion disrupts nucleocytoplasmic transport. Nature. 525, 56-61 (2015).
- Zhang, Y. J., et al. C9ORF72 poly(GA) aggregates sequester and impair HR23 and nucleocytoplasmic transport proteins. Nat Neurosci. 19, 668-677 (2016).
- Cleveland, D. W., Rothstein, J. D. From Charcot to Lou Gehrig: deciphering selective motor neuron death in ALS. Nat Rev Neurosci. 2, 806-819 (2001).
- DeJesus-Hernandez, M., et al. Expanded GGGGCC hexanucleotide repeat in noncoding region of C9ORF72 causes chromosome 9p-linked FTD and ALS. Neuron. 72, 245-256 (2011).
- Renton, A. E., et al. A hexanucleotide repeat expansion in C9ORF72 is the cause of chromosome 9p21-linked ALS-FTD. Neuron. 72, 257-268 (2011).
- Boeve, B. F., et al. Characterization of frontotemporal dementia and/or amyotrophic lateral sclerosis associated with the GGGGCC repeat expansion in C9ORF72. Brain. 135, 765-783 (2012).
- Haeusler, A. R., Donnelly, C. J., Rothstein, J. D. The expanding biology of the C9orf72 nucleotide repeat expansion in neurodegenerative disease. Nat Rev Neurosci. 17, 383-395 (2016).
- Woerner, A. C., et al. Cytoplasmic protein aggregates interfere with nucleocytoplasmic transport of protein and RNA. Science. 351, 173-176 (2016).
- Tao, Z., et al. Nucleolar stress and impaired stress granule formation contribute to C9orf72 RAN translation-induced cytotoxicity. Hum Mol Genet. 24, 2426-2441 (2015).
- Wen, X., et al. Antisense proline-arginine RAN dipeptides linked to C9ORF72-ALS/FTD form toxic nuclear aggregates that initiate in vitro and in vivo neuronal death. Neuron. 84, 1213-1225 (2014).
