Мониторинг высвобождения кальция ER / SR с помощью целевого Ca<sup> 2+</sup> Сенсорный CatchER<sup> +</sup
Summary
Мы представляем протоколы для применения нашего целевого генетически кодированного индикатора кальция (GECI) CatchER + для мониторинга быстрых переходных процессов кальция в эндоплазматическом / саркоплазматическом ретикулуме (ER / SR) HEK293 и клетках C2C12 скелетной мышцы с использованием флуоресцентной микроскопии в режиме реального времени. Обсуждается также протокол измерения и калибровки in situ K d .
Abstract
Внутриклеточные кальциевые (Ca 2+ ) переходные процессы, вызванные внеклеточными стимулами, инициируют множество биологических процессов в живых организмах. В центре внутриклеточного высвобождения кальция находятся основные внутриклеточные органоиды хранения кальция, эндоплазматический ретикулум (ER) и более специализированный саркоплазматический ретикулум (SR) в мышечных клетках. Динамическое высвобождение кальция из этих органелл опосредуется рианодиновым рецептором (RyR) и 1,4,5-трифосфатным рецептором инозитолом (IP 3 R) с повторным наполнением через насос кальциевой АТФазы sarco / эндоплазматический ретикулум (SERCA). Был создан генетически кодированный датчик кальция (GECI) под названием CatchER для контроля быстрого высвобождения кальция из ER / SR. Здесь подробные протоколы для трансфекции и экспрессии улучшенного EREC-SR-нацеленного GecI CatchER + в клетках HEK293 и C2C12 и его применение в контроле за транзитом кальция, опосредованным насосом IP 3 R, RyR и SERCAС в клетках НЕК293 с использованием флуоресцентной микроскопии. Агонист рецептора или ингибитор выбора диспергируют в растворе в камере, и изменения интенсивности регистрируют в реальном времени. С помощью этого метода снижение ER-кальция наблюдается с активацией RyR с помощью 4-хлор-м-крезола (4 см), косвенной активацией IP 3 R с аденозинтрифосфатом (АТФ) и ингибированием насоса SERCA циклопиазоном Кислота (СРА). Мы также обсуждаем протоколы для определения in situ K d и количественного определения базального [Ca 2+ ] в клетках C2C12. Таким образом, эти протоколы, используемые в сочетании с CatchER + , могут вызывать опосредуемое рецепторами высвобождение кальция из ER с последующим применением при исследовании патологий, связанных с кальцием ER / SR.
Introduction
Пространственно-временные характеристики внутриклеточных кальциевых (Са 2+ ) переходных процессов активируют различные биологические функции 1 . Эти сигнальные события Ca 2+ запускаются внеклеточно через различные стимулы и контролируются внутриклеточно основными органоидами хранения Ca 2+ и многочисленными насосами Ca 2+ , каналами и Ca 2+ -связывающими белками. Переходные процессы Ca 2+ могут быть значительно изменены в результате дефектов с модуляцией сигнала, приводящих к различным заболеваниям 2 . Из-за скорости и сложности системы сигнализации Ca 2+ , с эндо- (ER) и саркоплазматическим ретикулумом (SR) в центре, необходимы генетически кодированные Ca 2+ -пробы, оптимизированные для экспрессии млекопитающих с быстрой кинетикой Наблюдать глобальные и локальные изменения Са 2+ в разных клетках 3 .
ER и SR, Его аналог в мышечных клетках, являются основными внутриклеточными органоидами хранения Ca 2+ и действуют как поглотители Ca 2+, которые помогают усилить сигнал Ca 2+ 4 . ER / SR является неотъемлемой частью передачи сигналов Ca 2+ с двойными функциями в качестве передатчика и приемника сигналов 5 . Рецепторы рианодина (RyR) и 1,4,5-трифосфатного рецептора инозитола (IP 3 R) являются рецепторами высвобождения Ca 2+, расположенными на мембранах ER / SR, которые регулируются Ca 2+ 6 . Другие агенты прямо или косвенно стимулируют функцию этих рецепторов. 4-хлор-м-крезол (4 см) является сильным агонистом RyR, имеющим чувствительность в 10 раз выше, чем кофеин, для индуцирования высвобождения SR Ca 2+, где оба препарата регулярно используются для изучения RyR-опосредованного выделения Ca 2+ в Здоровые и больные клетки 7 . ATP повышает степень защиты от IP 3 Ca 2+ reАренды через IP 3 R 8 . АТФ связывается с пуринергическим рецептором P2YR, рецептором, связанным с G-белком (GPCR), вызывая выработку IP 3 , который связывается с IP 3 R для высвобождения Ca 2+ из ER 9 , 10 . Насос SARCO-эндоплазматический ретикулум кальция ATPase (SERCA) представляет собой насос АТФазы Р-типа, также расположенный на мембране ER / SR, которая уменьшает цитозольный Ca 2+ и наполняет ER / SR активным насосом иона в просвет ER / SR 11 . Конкретные ингибиторы насоса SERCA включают тапсигаргин, из Thapsia garganica и циклопиазоновую кислоту (CPA), от Aspergillus и Penicillium . CPA имеет низкое сродство к насосу и обратимо блокирует точку доступа Ca 2+ 12 . Thapsigargin, с другой стороны, необратимо связывается с Ca 2+ свободным насосом на остатке F256 в спирали M3 с наномоломAr affinity 11 . Анализ и количественная оценка изменений, связанных с стимулированными Ca 2+ событиями, была и остается проблемой. Поскольку ER / SR является основным субклеточным Ca 2+ -содержащим отделением с центральной функцией в распространении сигнала Ca 2+ , большая работа была сосредоточена на понимании передачи сигналов ER / SR Ca 2+ 5 .
Создание синтетических Ca 2+ красителей помогло продвинуть область и практику получения Ca 2+ . Хотя красители, такие как Mag-Fura-2, широко использовались для измерения компартенсированного Ca 2+ в разных клетках, 13 , 14 , 15 они имеют такие ограничения, как неравномерная погрузка красителя, фотообесцвечивание и невозможность нацеливаться на определенные органеллы , Открытие зеленого флуоресцентного белка (GFP) и продвижение флуоресцентного белка-Основанные на Ca 2+ , продвинули поле изображения Ca 2+ вперед 16 . Некоторые из существующих GECI являются парами FERT (резонансная энергия) (FRET), включающими желтый флуоресцентный белок (YFP), голубой флуоресцентный белок (CFP), кальмодулин и связывающий пептид M13 17,18 . GECI на основе тропонина C также доступны в виде FRET пар CFP и цитрина и в качестве однофлуорофорных зондов 19 , 20 , 21 . Другие, такие как GCaMP2 и R-GECO, являются одними флуорофорными сенсорами, включающими кальмодулин 22 , 23 . Чтобы преодолеть ограничения узкой настройки K d и кооперативного связывания, связанные с множеством сайтов связывания Ca 2+, обнаруженных в их связывающих доменах Ca 2+ 24 , новый класс кальциевых сенSors был создан путем создания участка связывания Ca 2+ на поверхности бета-бочки в чувствительном к хромофорам участке усиленного зеленого флуоресцентного белка (EGFP) 25 , 26 . Этот датчик с высокой разрешающей способностью, называемый CatchER, имеет K d ~ 0,18 мМ, ak – около диффузионного предела и ak off 700 с -1 . CatchER использовался для контроля рецептор-опосредованного высвобождения кальция ER / SR в различных линиях клеток млекопитающих, таких как HeLa, HEK293 и C2C12 25 . Из-за быстрой кинетики CatchER использовался в мышечных волокнах flexor digitorum brevis (FDB) молодых и старых мышей Friend Virus B NIH Jackson (FVB), чтобы показать, что большее количество Ca 2+ остается в SR после 2 сек деполяризации в FDB Волокон старых мышей по сравнению с волокнами старых мышей 27 . Для преодоления его низкой флуоресценции при 37 ° С, что затрудняет ее применение при кальциевых изображениях млекопитающихКлеток, мы разработали улучшенную версию CatchER под названием CatchER + . CatchER + обладает повышенной флуоресценцией при 37 ° C для лучшего применения в клетках млекопитающих. Дополнительные дополнительные мутации были включены в CatchER для улучшения термостабильности и флуоресценции при 37 ° С 28 , 29 , чтобы создать CatchER + . CatchER + демонстрирует шестикратное увеличение отношения сигнал / шум (SNR) по сравнению с CatchER 30 .
Здесь представлены протоколы культивирования и трансфекции клеток HEK293 и C2C12 с CatchER + и его применение для мониторинга ER / SR рецептор-опосредованных кальциевых транзиентов. Представительные результаты показаны для CatchER +, экспрессированного в клетках НЕК293, обработанных 4 см, CPA и ATP. Мы также предоставляем протокол для определения in situ K d CatchER + в клетках миобластов C2C12 и quaОпределение базального [Са 2+ ].
Protocol
Representative Results
Discussion
Живая одноячеечная визуализация флуоресцентных зондов, таких как CatchER + , является эффективным методом анализа сложных сигнальных процессов ER / SR Ca 2+ в каждой клетке в ответ на агонисты или антагонисты рецепторов. Этот метод также полезен для визуализации одновременно с исп?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа финансировалась NIH GM62999, NIH EB007268, NIH AG15820, B & B Seed Grant и дополнительным грантом NIH для FR, стипендиями BB для CM, стипендиями CDT для RG.
Materials
| 4-Chloro-3-methylphenol (4-CmC) | Sigma-Aldrich | C55402 |
| 515DCXR dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | NC338059 |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A26209 |
| Calcium chloride dihydrate | EMD Millipore | 102382 |
| Corning tissue-culture treated culture dishes (100 mm) | Sigma-Aldrich | CLS430167 |
| Corning tissue-culture treated culture dishes (60 mm) | Sigma-Aldrich | CLS430166 |
| Cyclopiazonic Acid (CPA) | EMD Millipore | 239805 |
| D(+)-Glucose | ACROS Organics | 41095-0010 |
| Dow Corning 111 Valve Lubricant & Sealant | Warner Instruments | 64-0275 |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D7777 |
| Ethylenebis(oxyethylenenitrilo) tetraacetic Acid (EGTA) |
ACROS Organics | 409911000 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher | 26140087 |
| Fisherbrand Cover Glasses 22×40 mm | Fisher Scientific | 12-544B |
| Hanks’ Balanced Salts (HBSS) | Sigma-Aldrich | H4891 |
| HEPES, Free Acid, Molecular Biology Grade | EMD Millipore | 391340 |
| Immersion Oil without autofluorescence | Leica | 11513859 |
| Ionomycin, Free Acid | Fisher Scientific | 50-230-5804 |
| Leica DM6100B inverted microscope with a cooled EM-CCD camera | Hamamatsu | C9100-13 |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | ThermoFisher | 11668019 |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | ThermoFisher | L3000015 |
| Low Profile Open Diamond Bath Imaging Chamber | Warner Instruments | RC-26GLP |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Fisher Scientific | M33-500 |
| Opti-MEM | ThermoFisher | 51985034 |
| Potassium Chloride | EMD Millipore | PX1405 |
| Potassium Phosphate, Dibasic | EMD Millipore | PX1570 |
| Potassium Phosphate, Monobasic | EMD Millipore | PX1565 |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 |
| SimplePCI Image Analysis Software | Hamamatsu | N/A |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S233-3 |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 |
| Sterivex-GV 0.22 µm filter | EMD Millipore | SVGVB1010 |
| Till Polychrome V Xenon lamp | Till Photonics | N/A |
| Trypsin (2.5%), no phenol red (10X) | ThermoFisher | 15090046 |
References
- Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).
- Berridge, M. J. Calcium signalling remodelling and disease. Biochem. Soc. Trans. 40, 297-309 (2012).
- Tang, S., Reddish, F., Zhuo, Y., Yang, J. J. Fast kinetics of calcium signaling and sensor. Curr. Opin. Chem. Biol. 27, 90-97 (2015).
- Rizzuto, R., Pozzan, T. Microdomains of intracellular Ca2+: Molecular determinants and functional consequences. Physiol. Rev. 86 (1), 369-408 (2006).
- Berridge, M. J. The endoplasmic reticulum: a multifunctional signaling organelle. Cell Calcium. 32 (5-6), 235-249 (2002).
- Clapham, D. E. Calcium Signaling. Cell. 131 (6), 1047-1058 (2007).
- HerrmannFrank, A., Richter, M., Sarkozi, S., Mohr, U., LehmannHorn, F. 4-chloro-m-cresol, a potent and specific activator of the skeletal muscle ryanodine receptor. Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1289 (1), 31-40 (1996).
- Ferris, C. D., Huganir, R. L., Bredt, D. S., Cameron, A. M., Snyder, S. H. Inositol trisphosphate receptor: phosphorylation by protein kinase C and calcium calmodulin-dependent protein kinases in reconstituted lipid vesicles. Proc. Natl. Acad. Sci. 88 (6), 2232-2235 (1991).
- Dubyak, G. R., el-Moatassim, C. Signal transduction via P2-purinergic receptors for extracellular ATP and other nucleotides. Am. J. Physiol., Cell Physiol. 265 (3 Pt 1), C577-C606 (1993).
- Song, Z., Vijayaraghavan, S., Sladek, C. D. ATP increases intracellular calcium in supraoptic neurons by activation of both P2X and P2Y purinergic receptors. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 292 (1), R423-R431 (2007).
- Brini, M., Carafoli, E. Calcium Pumps in Health and Disease. Physiol. Rev. 89 (4), 1341-1378 (2009).
- Michelangeli, F., East, J. M. A diversity of SERCA Ca2+ pump inhibitors. Biochem. Soc. Trans. 39 (3), 789-797 (2011).
- Hofer, A. M., Landolfi, B., Debellis, L., Pozzan, T., Free Curci, S. Ca2+ dynamics measured in agonist-sensitive stores of single living intact cells: a new look at the refilling process. Embo J. 17 (7), 1986-1995 (1998).
- Hofer, A. M., Machen, T. E. Technique For InSitu Measurement of Calcium in Intracellular Inositol 1,4,5-Trisphosphate-Sensitive Stores Using The Fluorescent Indicator Mag-Fura-2. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90 (7), 2598-2602 (1993).
- Raju, B., Murphy, E., Levy, L. A., Hall, R. D., London, R. E. A fluorescent indicator for measuring cytosolic free magnesium. Am J Physiol. 256, (1989).
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Miyawaki, A., et al. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388 (6645), 882-887 (1997).
- Palmer, A. E., Jin, C., Reed, J. C., Tsien, R. Y. Bcl-2-mediated alterations in endoplasmic reticulum Ca2+ analyzed with an improved genetically encoded fluorescent sensor. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (50), 17404-17409 (2004).
- Heim, N., Griesbeck, O. Genetically Encoded Indicators of Cellular Calcium Dynamics Based on Troponin C and Green Fluorescent Protein. J. Biol. Chem. 279 (14), 14280-14286 (2004).
- Mank, M., et al. A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change. Biophys. J. 90 (5), 1790-1796 (2006).
- Garaschuk, O., Griesbeck, O., Konnerth, A. Troponin C-based biosensors: A new family of genetically encoded indicators for in vivo calcium imaging in the nervous system. Cell Calcium. 42 (4-5), 351-361 (2007).
- Carlson, H. J., Campbell, R. E. Mutational Analysis of a Red Fluorescent Protein-Based Calcium Ion Indicator. Sensors. 13 (9), 11507-11521 (2013).
- Wang, Q., Shui, B., Kotlikoff, M. I., Sondermann, H. Structural Basis for Calcium Sensing by GCaMP2. Structure. 16 (12), 1817-1827 (2008).
- Koldenkova, V. P., Nagai, T. Genetically encoded Ca2+ indicators: Properties and evaluation. Biochim. Biophys. Acta-Mol. Cell Res. 1833 (7), 1787-1797 (2013).
- Tang, S., et al. Design and application of a class of sensors to monitor Ca2+ dynamics in high Ca2+ concentration cellular compartments. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (39), 16265-16270 (2011).
- Zou, J., et al. Developing sensors for real-time measurement of high Ca2+ concentrations. Biochimie. 46 (43), 12275-12288 (2007).
- Wang, Z. -. M., Tang, S., Messi, M. L., Yang, J. J., Delbono, O. Residual sarcoplasmic reticulum Ca2+ concentration after Ca2+ release in skeletal myofibers from young adult and old mice. Pflugers Arch., EJP. 463 (4), 615-624 (2012).
- Pedelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 24 (1), 79-88 (2006).
- Siemering, K. R., Golbik, R., Sever, R., Haseloff, J. Mutations that suppress the thermosensitivity of green fluorescent protein. Current Biology. 6 (12), 1653-1663 (1996).
- Reddish, F. N. . Design Of Genetically-Encoded Ca2+ Probes With Rapid Kinetics for Sub-Cellular Application [dissertation]. , (2016).
- Seo, M. D., Enomoto, M., Ishiyama, N., Stathopulos, P. B., Ikura, M. Structural insights into endoplasmic reticulum stored calcium regulation by inositol 1,4,5-trisphosphate and ryanodine receptors. Biochim. Biophys. Acta-Mol. Cell Res. 1853 (9), 1980-1991 (2015).
- Lambert, D. G. . Calcium signaling protocols. , (1999).
- Stephens, D. J., Allan, V. J. Light microscopy techniques for live cell imaging. Science. 300 (5616), 82-86 (2003).
- Bootman, M. D., Rietdorf, K., Collins, T., Walker, S., Sanderson, M. Ca2+-sensitive fluorescent dyes and intracellular Ca2+ imaging. Cold Spring Harb. 2013 (2), 83-99 (2013).
