Monitorização da libertação de cálcio ER / SR com o Ca<sup> 2+</sup> Captador<sup-benzóico.</sup
Summary
Apresentamos protocolos para a aplicação de nosso indicador de cálcio codificado geneticamente codificado (GECI) CatchER + para monitorar transientes rápidos de cálcio no retículo endoplasmático / sarcoplasmático (ER / SR) de HEK293 e células C2C12 de músculo esquelético usando microscopia de fluorescência em tempo real. Um protocolo para a medição e calibração in situ K d também é discutido.
Abstract
Os transientes intracelulares de cálcio (Ca2 + ) evocados por estímulos extracelulares iniciam uma multiplicidade de processos biológicos em organismos vivos. No centro da libertação de cálcio intracelular estão as principais organelas de armazenamento de cálcio intracelular, o retículo endoplasmático (RE) eo retículo sarcoplasmático (SR) mais especializado nas células musculares. A liberação dinâmica de cálcio a partir destas organelas é mediada pelo receptor de rianodina (RyR) e pelo receptor de inositol 1,4,5-trifosfato (IP3R) com reenchimento ocorrendo através da bomba sarco / retina de cálcio reticular ATPase (SERCA). Um sensor de cálcio geneticamente codificado (GECI) chamado CatchER foi criado para monitorar a rápida liberação de cálcio do ER / SR. Aqui, os protocolos detalhados para a transfecção e expressão do GECI CatchER + melhorado em células HEK293 e C2C12 direccionadas para ER / SR e a sua aplicação na monitorização de transiente de cálcio mediado por bomba IP3R, RyR e SERCAS em células HEK293 utilizando microscopia de fluorescência é delineada. O agonista ou inibidor de receptor de escolha está disperso na solução de câmara e as alterações de intensidade são registadas em tempo real. Com este método, observa-se uma diminuição do cálcio ER com a activação de RyR com 4-cloro-m-cresol (4 cmc), a activação indirecta de IP3R com adenosina trifosfato (ATP) ea inibição da bomba SERCA com ciclopiazónico Ácido (CPA). Também discutimos protocolos para determinar o in situ K d e quantificação basal [Ca 2 + ] em C2C12 células. Em resumo, estes protocolos, utilizados em conjunto com CatchER + , podem desencadear a libertação de cálcio mediada pelo receptor a partir da ER com aplicação futura no estudo de ER / SR relacionadas com cálcio patologias.
Introduction
Os atributos espaço-temporais dos transientes de cálcio intracelular (Ca 2+ ) ativam várias funções biológicas 1 . Estes eventos de sinalização de Ca2 + são desencadeados extracelularmente através de diferentes estímulos e controlados intracelularmente pela maior organela de armazenamento de Ca2 + e por numerosas bombas de Ca2 + , canais e proteínas de ligação de Ca2 + . Os transientes de Ca 2+ podem ser significativamente alterados como resultado de defeitos com modulação do sinal, levando a diferentes doenças 2 . Devido à velocidade e complexidade do sistema de sinalização Ca 2+ , com o retículo endo- (ER) e sarcoplasmático (SR) no centro, sondas de Ca 2+ geneticamente codificadas que foram otimizadas para expressão de mamíferos com cinética rápida são necessárias Para observar global e local Ca 2 + mudanças em diferentes células 3 .
O ER eo SR, Sua contrapartida em células musculares, são os principais organelos de armazenamento intracelular de Ca 2+ e atuam como sumidouros de Ca 2+ que ajudam a amplificar o sinal de Ca 2+ 4 . O ER / SR é parte integrante da sinalização Ca 2+ com papéis duais como transmissor e receptor de sinais 5 . O receptor de rianodina (RyR) e o receptor de inositol 1,4,5-trifosfato (IP3R) são receptores de libertação de Ca2 + localizados nas membranas da ER / SR reguladas por Ca2 + 6 . Outros agentes estimulam directa ou indirectamente a função destes receptores. O 4-cloro-m-cresol (4 cmc) é um potente agonista do RyR, tendo uma sensibilidade 10 vezes maior do que a cafeína para induzir a libertação de SR Ca 2+ onde ambos são regularmente utilizados para estudar a libertação de Ca 2+ mediada por RyR Saudáveis e doentes 7 . ATP aumenta Ca 2 + mediado por IP 3Locação através do IP 3 R 8 . O ATP liga-se ao receptor purinérgico P2YR, um receptor acoplado à proteína G (GPCR), desencadeando a produção de IP 3 que se liga ao IP 3 R para libertar Ca 2+ do ER 9 , 10 . A bomba de ATPase de cálcio reticular sarco-endoplasmático (SERCA) é uma bomba ATPase de tipo P, também localizada na membrana ER / SR que reduz o Ca 2+ citosólico e reabastece o ER / SR ao bombear ativamente o íon no lúmen ER / SR 11 . Inibidores específicos da bomba SERCA incluem tapsigargina, de Thapsia garganica e ácido ciclopiazónico (CPA), de Aspergillus e Penicillium . O CPA tem uma baixa afinidade para a bomba e bloqueia reversivelmente o ponto de acesso Ca 2 + 12 . A tapsigargina, por outro lado, liga-se irreversivelmente à bomba livre de Ca2 + no resíduo F256 na hélice M3 com nanomolAr afinidade 11 . Analisar e quantificar as alterações envolvidas nos eventos estimulados com Ca2 + tem sido e continua a ser um desafio. Uma vez que o ER / SR é o maior subcelular Ca 2 + contendo compartimento com uma função central na propagação do Ca 2 + sinal, muito trabalho tem sido focada na compreensão ER / SR Ca 2 + sinalização 5 .
A criação de corantes sintéticos de Ca 2 + ajudou a avançar o campo ea prática de Ca 2 + imagem. Embora corantes, como o Mag-Fura-2, tenham sido amplamente utilizados para medir o Ca 2+ compartimentado em diferentes células, 13,14,15 têm limitações tais como carga de corante desigual, fotodegradação ea incapacidade de ser direcionado para organelas específicas . A descoberta da proteína verde fluorescente (GFP) eo avanço da proteína fluorescente-Baseado Ca 2 + propulsou o campo de Ca 2 + imagem para a frente 16 . Alguns dos GECIs existentes são pares de transferência de energia de ressonância de Förster (FRET) envolvendo proteína fluorescente amarela (YFP), proteína fluorescente ciana (CFP), calmodulina e o péptido de ligação a M13 17 , 18 . Os GECI baseados em troponina C também estão disponíveis como pares FRET de CFP e Citrino e como sondas únicas de fluoróforo 19 , 20 , 21 . Outros, tais como GCaMP2 e R-GECO são sensores de fluoróforo único envolvendo calmodulina 22 , 23 . Para ultrapassar as limitações da afinação estreita de Kd e da ligação cooperativa associada a múltiplos locais de ligação de Ca2 + encontrados nos seus domínios de ligação a Ca2 + 24 , uma nova classe de cálcio senSors foi criado por projetar um local de ligação Ca 2 + na superfície do barril beta em um local sensível ao cromóforo de proteína verde fluorescente reforçada (EGFP) 25 , 26 . Este altamente touted sensor, chamado CatchER, tem um K d de ~ 0.18 mM, ak em perto do limite de difusão, e ak off de 700 s -1 . CatchER tem sido utilizado para monitorizar a libertação de cálcio ER / SR mediada por receptor em diferentes linhas de células de mamífero tais como HeLa, HEK293 e C2C12 25 . Devido à sua cinética rápida, o CatchER foi utilizado em fibras musculares flexor digitorum brevis (FDB) de jovens e velhos ratos Friend Friend B NIH Jackson (FVB) para revelar que mais Ca 2 + permanece no SR após 2 s de despolarização no FDB De camundongos velhos em comparação com a de camundongos jovens 27 . Para superar a sua baixa fluorescência a 37 ° C, o que dificulta as suas aplicações na imagiologia de cálcio de mamíferosCélulas, desenvolvemos uma versão melhorada do CatchER chamado CatchER + . CatchER + exibe fluorescência melhorada a 37 ° C para melhor aplicação em células de mamífero. Foram incorporadas mutações adicionais no CatchER para melhorar a termoestabilidade e fluorescência a 37 ° C 28 , 29 , para criar CatchER + . CatchER + exibe um aumento de seis vezes em sua relação sinal / ruído (SNR) sobre CatchER 30 .
Aqui são apresentados os protocolos para a cultura e transfecção de células HEK293 e C2C12 com CatchER + e a sua aplicação para monitorizar transientes de cálcio mediados por receptores ER / SR. Apresentam-se resultados representativos para CatchER + expresso em células HEK293 tratadas com 4 cmc, CPA e ATP. Nós também fornecemos um protocolo para determinar o K d in situ de CatchER + em células de mioblasto C2C12 e quaNação de Ca2 + ] basal.
Protocol
Representative Results
Discussion
A imagiologia com células vivas de sondas fluorescentes, tal como CatchER + , é uma técnica eficaz para analisar processos de sinalização intrínsecos de ER / SR Ca2 + em cada célula em resposta a agonistas ou antagonistas de receptores. Esta técnica também é útil para imagens usando múltiplos comprimentos de onda simultaneamente, como necessário para Fura-2 ou para a imagem CatchER + e Rhod-2 em conjunto para monitorar ER e citosólicas alterações de cálcio, respectivamen…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo NIH GM62999, NIH EB007268, NIH AG15820, B & B Seed Grant, e um NIH Suplementar Grant para FR, BB bolsa para CM, CDT bolsa para RG.
Materials
| 4-Chloro-3-methylphenol (4-CmC) | Sigma-Aldrich | C55402 |
| 515DCXR dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | NC338059 |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A26209 |
| Calcium chloride dihydrate | EMD Millipore | 102382 |
| Corning tissue-culture treated culture dishes (100 mm) | Sigma-Aldrich | CLS430167 |
| Corning tissue-culture treated culture dishes (60 mm) | Sigma-Aldrich | CLS430166 |
| Cyclopiazonic Acid (CPA) | EMD Millipore | 239805 |
| D(+)-Glucose | ACROS Organics | 41095-0010 |
| Dow Corning 111 Valve Lubricant & Sealant | Warner Instruments | 64-0275 |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D7777 |
| Ethylenebis(oxyethylenenitrilo) tetraacetic Acid (EGTA) |
ACROS Organics | 409911000 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher | 26140087 |
| Fisherbrand Cover Glasses 22×40 mm | Fisher Scientific | 12-544B |
| Hanks’ Balanced Salts (HBSS) | Sigma-Aldrich | H4891 |
| HEPES, Free Acid, Molecular Biology Grade | EMD Millipore | 391340 |
| Immersion Oil without autofluorescence | Leica | 11513859 |
| Ionomycin, Free Acid | Fisher Scientific | 50-230-5804 |
| Leica DM6100B inverted microscope with a cooled EM-CCD camera | Hamamatsu | C9100-13 |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | ThermoFisher | 11668019 |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | ThermoFisher | L3000015 |
| Low Profile Open Diamond Bath Imaging Chamber | Warner Instruments | RC-26GLP |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Fisher Scientific | M33-500 |
| Opti-MEM | ThermoFisher | 51985034 |
| Potassium Chloride | EMD Millipore | PX1405 |
| Potassium Phosphate, Dibasic | EMD Millipore | PX1570 |
| Potassium Phosphate, Monobasic | EMD Millipore | PX1565 |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 |
| SimplePCI Image Analysis Software | Hamamatsu | N/A |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S233-3 |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 |
| Sterivex-GV 0.22 µm filter | EMD Millipore | SVGVB1010 |
| Till Polychrome V Xenon lamp | Till Photonics | N/A |
| Trypsin (2.5%), no phenol red (10X) | ThermoFisher | 15090046 |
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