Monitoring ER / SR Calcium Release mit dem gezielten Ca<sup> 2+</sup> Sensor Catcher<sup> +</sup
Summary
Wir präsentieren Protokolle für die Anwendung unseres gezielten genetisch codierten Calciumindikators (GECI) CatchER + zur Überwachung von schnellen Calcium-Transienten im endoplasmatischen / sarkoplasmatischen Retikulum (ER / SR) von HEK293 und Skelettmuskel-C2C12-Zellen mittels Echtzeit-Fluoreszenzmikroskopie. Ein Protokoll für die in situ K d Messung und Kalibrierung wird ebenfalls diskutiert.
Abstract
Intrazelluläre Calcium (Ca 2+ ) -Transienten, die durch extrazelluläre Reize hervorgerufen werden, initiieren eine Vielzahl biologischer Prozesse in lebenden Organismen. Im Zentrum der intrazellulären Calciumfreisetzung befinden sich die wichtigsten intrazellulären Calciumlagerorganellen, das endoplasmatische Retikulum (ER) und das spezialisierte sarkoplasmatische Retikulum (SR) in Muskelzellen. Die dynamische Freisetzung von Calcium aus diesen Organellen wird durch den Ryanodinrezeptor (RyR) und den Inositol-1,4,5-Triphosphat-Rezeptor (IP 3 R) vermittelt, wobei das Nachfüllen durch die Sacco / endoplasmatische Retikulum-Calcium-ATPase (SERCA) -Pumpe erfolgt. Ein genetisch kodierter Kalziumsensor (GECI) namens CatchER wurde erstellt, um die schnelle Kalziumfreisetzung aus dem ER / SR zu überwachen. Hier sind die detaillierten Protokolle für die Transfektion und Expression des verbesserten ER / SR-zielgerichteten GECI CatchER + in HEK293 und C2C12 Zellen und deren Anwendung bei der Überwachung von IP 3 R, RyR und SERCA pumpenvermittelter Calcium transientS in HEK293-Zellen mit Fluoreszenzmikroskopie ist umrissen. Der Rezeptor-Agonist oder Inhibitor der Wahl wird in der Kammerlösung dispergiert und die Intensitätsänderungen werden in Echtzeit aufgezeichnet. Bei dieser Methode wird bei RyR-Aktivierung mit 4-Chlor-m-cresol (4-cmc), der indirekten Aktivierung von IP 3 R mit Adenosintriphosphat (ATP) und Hemmung der SERCA-Pumpe mit Cyclopiazon eine Abnahme von ER-Calcium beobachtet Säure (CPA). Wir diskutieren auch Protokolle zur Bestimmung der in situ K d und quantifizierenden basalen [Ca 2+ ] in C2C12-Zellen. Zusammenfassend können diese Protokolle, die in Verbindung mit CatchER + verwendet werden, eine Rezeptor-vermittelte Calciumfreisetzung aus dem ER mit einer zukünftigen Anwendung beim Studium von ER / SR-Calcium-verwandten Pathologien hervorrufen.
Introduction
Die räumlich-zeitlichen Attribute von intrazellulären Calcium (Ca 2+ ) transienten aktivieren verschiedene biologische Funktionen 1 . Diese Ca 2+ -Signalisierungsereignisse werden extrazellulär durch verschiedene Reize ausgelöst und intrazellulär durch die Haupt-Ca 2+ -Speicherorganelle und durch zahlreiche Ca 2+ -Pumpen, Kanäle und Ca 2+ -bindende Proteine kontrolliert. Ca 2+ -Transienten können durch Defekte mit Signalmodulation signifikant verändert werden, was zu unterschiedlichen Erkrankungen führt 2 . Aufgrund der Geschwindigkeit und Kompliziertheit des Ca 2+ -Signalisierungssystems werden mit dem endo- (ER) und dem sarkoplasmatischen Retikulum (SR) im Zentrum genetisch kodierte Ca 2+ -Sonden benötigt, die für die Expression von Säugetieren mit schneller Kinetik optimiert wurden Um globale und lokale Ca 2+ Veränderungen in verschiedenen Zellen zu beobachten 3 .
Die ER und die SR, Sein Gegenstück in Muskelzellen, sind die wichtigsten intrazellulären Ca 2+ -Speicherorganellen und wirken als Ca 2+ -Senken, die zur Verstärkung des Ca 2+ -Signals 4 beitragen. Das ER / SR ist ein integraler Bestandteil der Ca 2+ -Signalisierung mit Doppelrollen als Sender und Empfänger von Signalen 5 . Der Ryanodinrezeptor (RyR) und der Inositol-1,4,5-Triphosphatrezeptor (IP 3 R) sind Ca 2+ -Auslösungsrezeptoren, die sich auf den Membranen des ER / SR befinden, die durch Ca 2+ 6 reguliert werden. Andere Wirkstoffe stimulieren direkt oder indirekt die Funktion dieser Rezeptoren. 4-Chlor-m-cresol (4-cmc) ist ein starker Agonist des RyR mit einer 10fach höheren Empfindlichkeit als Koffein zur Induktion der SR Ca 2+ -Ausgabe, bei der beide regelmäßig zur Untersuchung der RyR-vermittelten Ca 2+ -Ausgabe eingesetzt werden Gesunde und kranke Zellen 7 . ATP erhöht IP 3- vermittelte Ca 2+ reLeasing durch die IP 3 R 8 . ATP bindet an den purinergischen Rezeptor P2YR, einen G-Protein-gekoppelten Rezeptor (GPCR), der die Produktion von IP 3 auslöst, die an die IP 3 R bindet, um Ca 2+ aus dem ER 9 , 10 freizusetzen. Die Sacco-endoplasmatische Retikulum-Calcium-ATPase-Pumpe (SERCA) ist eine PP-ATPase-Pumpe, die sich ebenfalls auf der ER / SR-Membran befindet, die das zytosolische Ca 2+ reduziert und das ER / SR durch ein aktives Pumpen des Ions in das ER / SR-Lumen auffüllt 11 Spezifische Inhibitoren der SERCA-Pumpe umfassen Thapsigargin, von Thapsia garganica und Cyclopiazonsäure (CPA), von Aspergillus und Penicillium . CPA hat eine geringe Affinität für die Pumpe und blockiert den Ca 2+ Zugangspunkt 12 reversibel. Thapsigargin hingegen bindet irreversibel an die Ca 2+ freie Pumpe am Rest F256 in der M3-Helix mit NanomolAr affinität 11 Die Analyse und Quantifizierung der Veränderungen in Ca 2+ stimulierten Ereignissen war und bleibt eine Herausforderung. Da das ER / SR das wichtigste subzelluläre Ca 2+ -haltige Kompartiment mit einer zentralen Funktion bei der Ausbreitung des Ca 2+ -Signals ist, wurde viel Arbeit auf das Verständnis der ER / SR Ca 2+ -Signalisierung 5 konzentriert.
Die Schaffung von synthetischen Ca 2+ -Farbstoffen hat dazu beigetragen, das Feld und die Praxis der Ca 2+ -Bildgebung voranzutreiben. Obwohl Farbstoffe wie Mag-Fura-2 weit verbreitet sind, um kompartimentiertes Ca 2+ in verschiedenen Zellen, 13 , 14 , 15 zu messen , haben sie Einschränkungen wie unebene Farbstoffbeladung, Photobleichung und die Unfähigkeit, auf spezifische Organellen gerichtet zu sein . Die Entdeckung des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) und die Weiterentwicklung von fluoreszierendem Protein-Basierte Ca 2+ – Sonden hat das Feld der Ca 2+ – Bildgebung vorangetrieben 16 . Einige der vorhandenen GECIs sind Förster-Resonanz-Energieübertragungs- (FRET-) Paare mit gelbem Fluoreszenzprotein (YFP), Cyan-Fluoreszenzprotein (CFP), Calmodulin und dem M13-Bindungspeptid 17 , 18 . Troponin C-basierte GECIs sind auch als FRET-Paare von CFP und Citrin und als einzelne Fluorophor-Sonden 19 , 20 , 21 erhältlich. Andere, wie GCaMP2 und R-GECO sind einzelne Fluorophore-Sensoren mit Calmodulin 22 , 23 . Um die Einschränkungen der engen Abstimmung von K d 's und kooperativer Bindung zu überwinden, die mit mehreren Ca 2+ Bindungsstellen assoziiert sind, die in ihren Ca 2+ -Bindungsdomänen 24 gefunden wurden , wurde eine neue Klasse von Calcium senSors wurde durch die Konstruktion einer Ca 2+ -Bindungsstelle auf der Oberfläche des Beta-Fasses in einer chromophoreempfindlichen Stelle von verstärktem grün fluoreszierendem Protein (EGFP) 25 , 26 hergestellt. Dieser hochgeladene Sensor, genannt CatchER, hat eine Kd von ~ 0,18 mM, ak de der Nähe der Diffusionsgrenze und ak off von 700 s -1 . Catcher wurde verwendet, um die Rezeptor-vermittelte ER / SR-Calciumfreisetzung in verschiedenen Säugetierzelllinien wie HeLa, HEK293 und C2C12 25 zu überwachen. Wegen seiner schnellen Kinetik wurde CatchER in den Flexor digitorum brevis (FDB) Muskelfasern der jungen und alten Freund Virus B NIH Jackson (FVB) Mäuse verwendet, um zu zeigen, dass mehr Ca 2+ im SR nach 2 s Depolarisation in der FDB bleibt Fasern von alten Mäusen im Vergleich zu denen junger Mäuse 27 . Um seine niedrige Fluoreszenz bei 37 ° C zu überwinden, was seine Anwendungen bei der Calcium-Bildgebung von Säugetieren behindertZellen haben wir eine verbesserte Version von Catcher namens CatchER + entwickelt. Catcher + zeigt eine verbesserte Fluoreszenz bei 37 ° C für eine bessere Anwendung in Säugetierzellen. Zusätzliche Mutationen wurden in CatchER integriert, um die Thermostabilität und Fluoreszenz bei 37 ° C 28 , 29 zu verbessern, um CatchER + zu erzeugen. Catcher + zeigt eine sechsseitige Erhöhung des Signal-Rausch-Verhältnisses (SNR) gegenüber CatchER 30 .
Hier werden die Protokolle für die Kultur und Transfektion von HEK293- und C2C12-Zellen mit CatchER + und deren Anwendung zur Überwachung von ER / SR-Rezeptor-vermittelten Calcium-Transienten vorgestellt. Repräsentative Ergebnisse sind für CatchER + gezeigt, die in HEK293-Zellen exprimiert wurden, die mit 4-cmc, CPA und ATP behandelt wurden. Wir liefern auch ein Protokoll zur Bestimmung der in situ Kd von CatchER + in C2C12 Myoblastenzellen und quaNtifizierung von basal [Ca 2+ ].
Protocol
Representative Results
Discussion
Live-Einzelzell-Bildgebung von fluoreszierenden Sonden wie CatchER + ist eine effektive Technik zur Analyse komplizierter ER / SR Ca 2+ -Signalisierungsprozesse in jeder Zelle als Reaktion auf Rezeptor-Agonisten oder -Antagonisten. Diese Technik eignet sich auch für die Bildgebung unter Verwendung von mehreren Wellenlängen gleichzeitig, wie sie für Fura-2 benötigt werden, oder um Catcher + und Rhod-2 zusammen zu bilden, um sowohl ER- als auch cytosolische Calciumänderungen zu überw…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde gefördert von NIH GM62999, NIH EB007268, NIH AG15820, B & B Seed Grant und einem NIH Supplemental Grant an FR, BB-Stipendium an CM, CDT-Stipendium an RG.
Materials
| 4-Chloro-3-methylphenol (4-CmC) | Sigma-Aldrich | C55402 |
| 515DCXR dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | NC338059 |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A26209 |
| Calcium chloride dihydrate | EMD Millipore | 102382 |
| Corning tissue-culture treated culture dishes (100 mm) | Sigma-Aldrich | CLS430167 |
| Corning tissue-culture treated culture dishes (60 mm) | Sigma-Aldrich | CLS430166 |
| Cyclopiazonic Acid (CPA) | EMD Millipore | 239805 |
| D(+)-Glucose | ACROS Organics | 41095-0010 |
| Dow Corning 111 Valve Lubricant & Sealant | Warner Instruments | 64-0275 |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D7777 |
| Ethylenebis(oxyethylenenitrilo) tetraacetic Acid (EGTA) |
ACROS Organics | 409911000 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher | 26140087 |
| Fisherbrand Cover Glasses 22×40 mm | Fisher Scientific | 12-544B |
| Hanks’ Balanced Salts (HBSS) | Sigma-Aldrich | H4891 |
| HEPES, Free Acid, Molecular Biology Grade | EMD Millipore | 391340 |
| Immersion Oil without autofluorescence | Leica | 11513859 |
| Ionomycin, Free Acid | Fisher Scientific | 50-230-5804 |
| Leica DM6100B inverted microscope with a cooled EM-CCD camera | Hamamatsu | C9100-13 |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | ThermoFisher | 11668019 |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | ThermoFisher | L3000015 |
| Low Profile Open Diamond Bath Imaging Chamber | Warner Instruments | RC-26GLP |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Fisher Scientific | M33-500 |
| Opti-MEM | ThermoFisher | 51985034 |
| Potassium Chloride | EMD Millipore | PX1405 |
| Potassium Phosphate, Dibasic | EMD Millipore | PX1570 |
| Potassium Phosphate, Monobasic | EMD Millipore | PX1565 |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 |
| SimplePCI Image Analysis Software | Hamamatsu | N/A |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S233-3 |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 |
| Sterivex-GV 0.22 µm filter | EMD Millipore | SVGVB1010 |
| Till Polychrome V Xenon lamp | Till Photonics | N/A |
| Trypsin (2.5%), no phenol red (10X) | ThermoFisher | 15090046 |
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