Surveillance de la libération de calcium ER / SR avec le Ca ciblé<sup> 2+</sup> Sensor CatchER<sup> +</sup
Summary
Nous présentons des protocoles pour l'application de notre indicateur de calcium codé génétiquement (GECI) CatchER + pour la surveillance des transitoires rapides de calcium dans le réticulum endoplasmique / sarcoplasmique (ER / SR) des cellules HEK293 et C2C12 du muscle squelettique en utilisant une microscopie à fluorescence en temps réel. Un protocole pour la mesure et l'étalonnage in situ K d est également discuté.
Abstract
Les transitoires de calcium intracellulaire (Ca 2+ ) évoqués par des stimuli extracellulaires initient une multitude de processus biologiques dans les organismes vivants. Au centre de la libération de calcium intracellulaire sont les principaux organelles de stockage de calcium intracellulaire, le réticulum endoplasmique (ER) et le réticulum sarcoplasmique (SR) plus spécialisé dans les cellules musculaires. La libération dynamique du calcium à partir de ces organites est médiée par le récepteur du ryanodine (RyR) et le récepteur d'inositol 1,4,5-triphosphate (IP 3 R) avec un remplissage à travers la pompe ATC de calcium ATPase réticulum sarco / endoplasmique (SERCA). Un capteur de calcium génétiquement codé (GECI) appelé CatchER a été créé pour surveiller la libération rapide de calcium de l'ER / SR. Ici, les protocoles détaillés pour la transfection et l'expression du GECI CatchER + amélioré ER / SR ciblé dans les cellules HEK293 et C2C12 et son application dans la surveillance des transitoires de calcium à médiation par pompe IP 3 R, RyR et SERCAS dans les cellules HEK293 utilisant une microscopie à fluorescence est décrite. L'agoniste du récepteur ou l'inhibiteur de choix est dispersé dans la solution de la chambre et les changements d'intensité sont enregistrés en temps réel. Avec cette méthode, on observe une diminution du calcium ER avec une activation de RyR avec 4-chloro-m-crésol (4 cmc), l'activation indirecte d'IP 3 R avec de l'adénosine triphosphate (ATP) et l'inhibition de la pompe SERCA avec cyclopazonium Acide (CPA). Nous discutons également des protocoles pour déterminer le K D in situ et quantifier basal [Ca 2+ ] dans des cellules C2C12. En résumé, ces protocoles, utilisés conjointement avec CatchER + , peuvent provoquer une libération de calcium médiée par les récepteurs à partir de l'ER avec une application future dans l'étude des pathologies liées au calcium ER / SR.
Introduction
Les attributs spatio-temporels des transitoires intracellulaires de calcium (Ca 2+ ) activent diverses fonctions biologiques 1 . Ces événements de signalisation de Ca 2+ sont déclenchés de manière extracellulaire par différents stimuli et contrôlés intracellulairement par l'organelle de stockage principale de Ca 2+ et par de nombreuses pompes Ca 2+ , des canaux et des protéines de liaison Ca 2+ . Les transitoires de Ca 2+ peuvent être modifiés de manière significative à la suite de défauts de modulation du signal, entraînant différentes maladies 2 . En raison de la vitesse et de la complexité du système de signalisation Ca 2+ , avec le réticulum endo- (ER) et le réticulum sarcoplasmique (SR) au centre, des sondes de Ca 2+ codées génétiquement, optimisées pour une expression mammaire avec une cinétique rapide, sont nécessaires Pour observer les changements mondiaux et locaux de Ca 2+ dans différentes cellules 3 .
L'ER et le SR, Son homologue dans les cellules musculaires, sont les principales organelles intracellulaires de stockage de Ca 2+ et agissent comme des éviers Ca 2+ qui aident à amplifier le signal Ca 2+ 4 . L'ER / SR fait partie intégrante de la signalisation Ca 2 + avec deux rôles d'émetteur et de récepteur de signaux 5 . Le récepteur de ryanodine (RyR) et le récepteur d'inositol 1,4,5-triphosphate (IP 3 R) sont des récepteurs de libération de Ca 2+ situés sur les membranes de l'ER / SR qui sont régulés par Ca 2+ 6 . D'autres agents stimulent directement ou indirectement la fonction de ces récepteurs. Le 4-chloro-m-crésol (4 cmc) est un agoniste puissant du RyR, ayant une sensibilité 10 fois plus élevée que la caféine pour induire une libération de SR Ca 2+ où les deux sont régulièrement employés pour étudier la libération de Ca 2+ médiée par RyR dans Cellules saines et malades 7 . L'ATP augmente le Ca 2+Bail via IP 3 R 8 . L'ATP se lie au récepteur purinergique P2YR, un récepteur couplé à la protéine G (GPCR), déclenchant la production d'IP 3 qui se lie à l'IP 3 R pour libérer Ca 2+ de l'ER 9 , 10 . La pompe ATPase de calcium du réticulum sarco-endoplasmique (SERCA) est une pompe ATPase de type P, également située sur la membrane ER / SR qui réduit le Ca 2+ cytosolique et recharge l'ER / SR en pompant activement l'ion dans la lumière ER / SR 11 . Les inhibiteurs spécifiques de la pompe SERCA comprennent thapsigargin, de Thapsia garganica et de l'acide cyclopiazonique (CPA), d' Aspergillus et Penicillium . CPA a une faible affinité pour la pompe et bloque de manière réversible le point d'accès au Ca 2+ 12 . Thapsigargin, d'autre part, se lie de manière irréversible à la pompe libre de Ca 2 + au résidu F256 dans l'hélice M3 avec nanomolAr affinité 11 . L'analyse et la quantification des changements impliqués dans les événements stimulés par Ca 2 + ont été et continuent d'être un défi. Étant donné que le ER / SR est le compartiment principal subcellulaire Ca 2+ avec une fonction centrale dans la propagation du signal Ca 2+ , beaucoup de travail a été mis au point pour la compréhension de la signalisation ER / SR Ca 2+ 5 .
La création de colorants synthétiques Ca 2 + a contribué à faire avancer le terrain et à pratiquer l'imagerie Ca 2+ . Bien que les colorants, tels que Mag-Fura-2, aient été largement utilisés pour mesurer le Ca 2+ compartimenté dans différentes cellules, 13 , 14 , 15 , ils ont des limitations telles que le chargement irrégulier de la teinture, le photoblanchage et l'incapacité d'être ciblés sur des organites spécifiques . La découverte de la protéine fluorescente verte (GFP) et l'avancement des protéines fluorescentes -Les sondes à base de Ca 2+ ont propulsé le champ de l'imagerie Ca 2 + vers l'avant 16 . Certains des GECI existants sont des paires de transfert d'énergie de résonance de Förster (FRET) impliquant des protéines fluorescentes jaunes (YFP), des protéines cyan fluorescentes (PCP), la calmoduline et le peptide de liaison M13 17 , 18 . Les GECI à base de Troponin C sont également disponibles sous forme de paires de CFP et de Citrine FRET et en tant que sondes fluorophores simples 19 , 20 , 21 . D'autres, comme GCaMP2 et R-GECO, sont des capteurs fluorophores individuels impliquant la calmoduline 22 , 23 . Pour surmonter les limites du réglage étroit de K d et de la liaison coopérative associée à de multiples sites de liaison au Ca 2+ trouvés dans leurs domaines de liaison au Ca 2+ 24 , une classe de calcium récenteSors a été créé en concevant un site de liaison au Ca 2+ à la surface du baril bêta dans un emplacement sensible au chromophore de la protéine fluorescente verte améliorée (EGFP) 25 , 26 . Ce capteur hautement touché, appelé CatchER, a un K d de ~ 0,18 mM, ak sur près de la limite de diffusion, et ak hors de 700 s -1 . CatchER a été utilisé pour surveiller la libération de calcium ER / SR médiée par les récepteurs dans différentes lignées cellulaires de mammifères telles que HeLa, HEK293 et C2C12 25 . En raison de sa cinétique rapide, CatchER a été utilisé dans les fibres musculaires flexor digitorum brevis (FDB) des souris jeunes et anciennes Friend Virus B NIH Jackson (FVB) pour révéler que plus de Ca 2+ reste dans la SR après 2 s de dépolarisation dans la FDB Fibres de souris anciennes comparées à celles de souris jeunes 27 . Pour surmonter sa faible fluorescence à 37 ° C, ce qui entrave ses applications dans l'imagerie au calcium de mammifèresCell, nous avons développé une version améliorée de CatchER appelée CatchER + . CatchER + présente une fluorescence améliorée à 37 ° C pour une meilleure application dans les cellules de mammifères. Des mutations supplémentaires ont été incorporées dans CatchER pour améliorer la thermostabilité et la fluorescence à 37 ° C 28 , 29 , pour créer CatchER + . CatchER + affiche une augmentation de six fois de son rapport signal sur bruit (SNR) sur CatchER 30 .
Ici, les protocoles pour la culture et la transfection de cellules HEK293 et C2C12 avec CatchER + et son application pour la surveillance des transitoires de calcium médiés par les récepteurs ER / SR sont présentés. Des résultats représentatifs sont présentés pour CatchER + exprimé dans des cellules HEK293 traitées avec 4 cmc, CPA et ATP. Nous proposons également un protocole pour déterminer le K d in situ de CatchER + dans les cellules myoblastes C2C12 et quaNtification de basal [Ca 2+ ].
Protocol
Representative Results
Discussion
L'imagerie monocellulaire vivante de sondes fluorescentes, comme CatchER + , est une technique efficace pour analyser des processus complexes de signalisation ER / SR Ca 2+ dans chaque cellule en réponse à des agonistes ou antagonistes de récepteurs. Cette technique est également utile pour l'imagerie en utilisant simultanément plusieurs longueurs d'ondes, telles que nécessaire pour Fura-2 ou pour l'image de CatchER + et Rhod-2 pour surveiller à la fois les variati…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé par NIH GM62999, NIH EB007268, NIH AG15820, B & B Seed Grant, et une subvention supplémentaire NIH à FR, bourse BB à CM, bourse CDT à RG.
Materials
| 4-Chloro-3-methylphenol (4-CmC) | Sigma-Aldrich | C55402 |
| 515DCXR dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | NC338059 |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A26209 |
| Calcium chloride dihydrate | EMD Millipore | 102382 |
| Corning tissue-culture treated culture dishes (100 mm) | Sigma-Aldrich | CLS430167 |
| Corning tissue-culture treated culture dishes (60 mm) | Sigma-Aldrich | CLS430166 |
| Cyclopiazonic Acid (CPA) | EMD Millipore | 239805 |
| D(+)-Glucose | ACROS Organics | 41095-0010 |
| Dow Corning 111 Valve Lubricant & Sealant | Warner Instruments | 64-0275 |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D7777 |
| Ethylenebis(oxyethylenenitrilo) tetraacetic Acid (EGTA) |
ACROS Organics | 409911000 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher | 26140087 |
| Fisherbrand Cover Glasses 22×40 mm | Fisher Scientific | 12-544B |
| Hanks’ Balanced Salts (HBSS) | Sigma-Aldrich | H4891 |
| HEPES, Free Acid, Molecular Biology Grade | EMD Millipore | 391340 |
| Immersion Oil without autofluorescence | Leica | 11513859 |
| Ionomycin, Free Acid | Fisher Scientific | 50-230-5804 |
| Leica DM6100B inverted microscope with a cooled EM-CCD camera | Hamamatsu | C9100-13 |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | ThermoFisher | 11668019 |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | ThermoFisher | L3000015 |
| Low Profile Open Diamond Bath Imaging Chamber | Warner Instruments | RC-26GLP |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Fisher Scientific | M33-500 |
| Opti-MEM | ThermoFisher | 51985034 |
| Potassium Chloride | EMD Millipore | PX1405 |
| Potassium Phosphate, Dibasic | EMD Millipore | PX1570 |
| Potassium Phosphate, Monobasic | EMD Millipore | PX1565 |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 |
| SimplePCI Image Analysis Software | Hamamatsu | N/A |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S233-3 |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 |
| Sterivex-GV 0.22 µm filter | EMD Millipore | SVGVB1010 |
| Till Polychrome V Xenon lamp | Till Photonics | N/A |
| Trypsin (2.5%), no phenol red (10X) | ThermoFisher | 15090046 |
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