חקר אינטראקציות חלבון במחקר Autophagy
Summary
מוצגים כאן שתי שיטות מחקר של אינטראקציה עם נוגדן מבוססי חלבון: immunofluorescence ו- immunoprecipitation. טכניקות אלה מתאימים ללמוד הפיזי אינטראקציות בין חלבונים עבור גילוי הרומן מרכיבי הסלולר איתות המסלולים, הבנה חלבון דינמיקה.
Abstract
אינטראקציות חלבון-חלבון חשובים עבור cascades איתות סלולרי הבנה, זיהוי רכיבים הרומן לשביל ודינמיקה חלבון. הרוב המכריע של פעילות הסלולר מחייבים הפיזי אינטראקציות בין חלבונים. כדי לנתח ולמפות אינטראקציות אלה, פותחו טכניקות ניסיוני שונים, כמו גם ושפור. Autophagy הוא סלולרית מיחזור מנגנון המאפשר את התאים להתמודד עם לחצים שונים, כולל מניעת מזון, כימיקלים, היפוקסיה. כדי להבין טוב יותר אירועים איתות הקשורים autophagy, לגלות את הגורמים הרומן לווסת את מתחמי חלבון autophagy, ביצענו מסכי אינטראקציית חלבון-חלבון. אימות של תוצאות אלו ההקרנה מחייב שימוש immunofluorescence וטכניקות immunoprecipitation. במערכת זו, ספציפיות הקשורות autophagy אינטראקציות חלבון שגילינו נבדקו ב- Neuro2A (N2A) וקווים תא HEK293T. הפרטים של ההליכים טכני המשמש מוסברים בעיתון מטמיעים הניסוי הזה.
Introduction
Macroautophagy (autophagy, במסמך זה) הוא מנגנון הלחץ הסלולר המאופיינת פחמיות הציטופלסמה בתפזורת, חלבונים ו organelles ב קרום כפול שלפוחית הנקראת autophagic שלפוחית. באמצעות היתוך של השכבה החיצונית של קרום כפול, שלפוחית autophagic והמטען שלהם יימסרו lysosomes והשפילו ובזה1. Autophagy מתרחשת ברמות הבזליים נמוכות כל סוגי תאים ובתוך כל האורגניזמים, ביצוע פונקציות homeostatic כגון חלבון השפלה והמסירה אברון (למשל, המיטוכונדריה). בתנאים שמוביל מתח סלולארית, כגון רעב, autophagy במהירות upregulated ומאפשרת את התא לשמור על רמות אנרגיה וחילוף חומרים בסיסי1,2,3.
כ-30 גנים autophagy שיבוט של השמרים, מוצריהם חלבון הוצגו לשחק תפקיד בשלבים שונים של התהליך autophagic, לרבות התגרענות שלפוחית, הרחבה, שלפוחית פיוז’ן כדי אנדוזום מאוחר/ליזוזום והשפלות מטען 4 , 5. Orthologs של הרוב של גנים אלה זוהו ואישר לימודי אורגניזמים שונים שימור שלהם תאיים6. מחקרים בעשור האחרון הראו כי מספר הקשורים autophagy מתחמי חלבון, אינטראקציות חלבון-חלבון קיים, כי הם חלים על מסלולים autophagy בצורה מבוקרת הסבוך. צמתים, גיבויים, משוב, feedforward מנגנונים קיימים, הם מאפשרים את התא לתאם autophagy עם אירועים קרובים אחרים (כגון הפרשת vesicular, ליזוזום להן, מיון של תחבורה endosomal7, וכו ‘) במסך לא משוחדת היברידית שמרים-2 באמצעות החלבון autophagy ATG5 בו כפתיון, (ATG5 הוא חלבון מפתח autophagy מעורב במערכת conjugating E2 דמוי המעביר LC3 lipidation ב הרעבה מזורזת autophagy), זיהינו הפעלת קולטן C-קינאז 1 (RACK1; GNB2L1) וגם interactor חזקה של רכיב autophagy הרומן8. חשוב, המסך הראה כי האינטראקציה ATG5-RACK1 הייתה הכרחית עבור אינדוקציה autophagy מאת inducers autophagy קלאסית (קרי, רעב ו mTOR עיכוב).
שיטות מבוססות immunofluorescence משמשות כדי לפקח על אינטראקציות חלבון חלבון. טכניקות אלה הן בעיקר נוגדן מבוסס, לסייע להמחיש אינטראקציות ואשר הגרסא הסלולרית המקומית. בטכניקה זו, תיוג פלורסנט מצומדת נוגדנים ספציפיים חלבונים עניין משמשות בדרך כלל עבור צביעת ספציפיים. כל חלבון יכולה להיקרא עם נוגדנים מצמידים צבעי פלורסנט שונים. חפיפה בתוך האות בעת מיזוג תמונות באמצעות נוגדנים ספציפיים חלבון, מציין לוקליזציה שיתוף של חלבונים תחת מיקרוסקופיה קונפוקלית. הטכניקה היא החלים על תאים או רקמות אפילו. Immunofluorescence טכניקות מספקים רמזים לגבי האינטראקציה dynamics, לזהות את גודל ואת ההפצה של מתחמי חלבון, תוך מעקב אחר שינויים כלליים במורפולוגיה הסלולר תחת תנאים שונים9. Immunoprecipitation הוא נפוץ נוגדן מבוסס טכניקה נוספת המאפשרת הניתוח של אינטראקציות בין חלבונים10שניתנו. בעזרת טכניקה זו, חלבונים עניין מבודדים מתאי או רקמות תמציות באמצעות נוגדנים ספציפיים, וכתוצאה מכך המשקעים של חלבונים הנמצאים במתחם או במגע עם חלבון עניין. Co-immunoprecipitation, שבו מזוהים החלבון ו interactor המשנה שלה, מגלה לא רק את האינטראקציה בין שני סוגי החלבונים, אבל יכול למדוד את עוצמתה של אינטראקציה תחת נסיבות שונות11.
פרוטוקול זה מתאר טכניקות מפתח פרט ששימשו לאשר ולאפיין ATG5-RACK1 ו- RACK1-LC3 אינטראקציה. הדגש הוא על טכניקות immunofluorescence ו- immunoprecipitation, עם דגש על שלבים קריטיים ואת החסרונות autophagy המחקר, כמו גם הצעות לפתרון בעיות.
Protocol
Representative Results
Discussion
Immunoprecipitation טכניקות immunofluorescence מכריעים עבור חקר אינטראקציות חלבון-חלבון למרות שתי שיטות אלה משמשות ומבוססת, מספר קריטריונים לשקול להגדיר את האיכות של ניסויים תוך שימוש הטכניקות הללו.
נוגדנים לאדמתה המשמשים המבחנים האלה צריך להיות ספציפי החלבונים של ריבית. כדי להבטיח זאת, הש…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מדעי, טכנולוגי מחקר המועצה של טורקיה (TUBITAK) 1001 גרנט 107T153, האוניברסיטה Sabanci. סאב NMK נתמכים על ידי מלגה TUBITAK BIDEB 2211 ללימודי דוקטורט.
Materials
| Trypsin EDTA Solution A | Biological Industries | BI03-050-1A | |
| PBS | GE Healthcare | SH-30256.01 | |
| DMEM (high glucose) | Sigma | 5671 | |
| DMEM (low glucose) | Sigma | 5546 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Hemocytometer | Sigma | Z359629-1EA | |
| coverslides | Jena Bioscience | CSL-103 | |
| slides | Isolab | I.075.02.005 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | |
| Torin | Tocris | 4247 | |
| DMSO | Sigma | VWRSAD2650 | |
| EBSS | Biological Industries | BI02-010-1A | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | 15812-7 | |
| BSA | Sigma | A4503 | |
| Saponin | Sigma | 84510 | |
| LC3 Antibody | Sigma | L7543 | |
| Anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11011 | |
| RACK1 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-17754 | |
| Anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | |
| NP-40 | Applichem | A16694.0250 | |
| Sodium Chloride | Applichem | A9242.5000 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 30970 | |
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Biochemika | A2572 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| Triton-X | Applichem | 4975 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma | 450243 | |
| ATG5 Antibody | Sigma | A0856 | |
| Glycerol | Applichem | A4453 | |
| β-Mercaptoethanol | Applichem | A1108.0250 | |
| Bromophenol blue | Applichem | A3640.0005 | |
| Non-Fat milk | Applichem | A0830 | |
| Tween 20 | Sigma | P5927 | |
| Sodium Azide | Riedel de Haen | 13412 | |
| Phenol red | Sigma | 114537-5G | |
| anti-rabbit IgG , HRP conjugated | Jackson Immuno. | 1110305144 | |
| Luminol | Fluka | 9253 | |
| Coumeric Acid | Sigma | C9008 | |
| Hydrogen Peroxide | Merck | K35522500604 | |
| anti mouse IgG, HRP conjugated | Jackson Immuno. | 115035003 | |
| β-Actin Antibody | Sigma | A5441 | |
| Normal rabbit serum | Santa Cruz Biotechnology | sc-2027 | |
| Rapamycin | Sigma | R0395 | |
| Protein A-Agarose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2001 | |
| fetal bovine serum | Biowest | S1810-500 | |
| penicillin/streptomycin solution | Biological Industries | 03-031-1B | |
| L-glutamine | Biological Industries | BI03-020-1B | |
| Bradford Solution | Sigma | 6916 | |
| Nitocellulose membrane | GE Healthcare | A10083108 | |
| X-ray Films | Fujifilm | 47410 19289 | |
| Protease inhibitor | Sigma | P8340 |
References
- Oral, O., Akkoc, Y., Bayraktar, O., Gozuacik, D. Physiological and pathological significance of the molecular cross-talk between autophagy and apoptosis. Histol Histopathol. 31, 479-498 (2016).
- Korkmaz, G., Tekirdag, K. A., Ozturk, D. G., Kosar, A., Sezerman, O. U., Gozuacik, D. MIR376A is a regulator of starvation-induced autophagy. PLoS One. 8, e82556 (2013).
- Itah, Z., et al. Hydrodynamic cavitation kills prostate cells and ablates benign prostatic hyperplasia tissue. Exp Biol Med (Maywood). 238, 1242-1250 (2013).
- Gozuacik, D., Kimchi, A. Autophagy as a cell death and tumor suppressor mechanism). Oncogene. 23, 2891-2906 (2004).
- Erzurumlu, Y., Kose, F. A., Gozen, O., Gozuacik, D., Toth, E. A., Ballar, P. A unique IBMPFD-related P97/VCP mutation with differential binding pattern and subcellular localization. Int J Biochem Cell Biol. 45, 773-782 (2013).
- Kuzuoglu-Ozturk, D., et al. Autophagy-related gene, TdAtg8, in wild emmer wheat plays a role in drought and osmotic stress response. Planta. 236, 1081-1092 (2012).
- Longatti, A., Tooze, S. A. Vesicular trafficking and autophagosome formation. Cell Death Differ. 16, 956-965 (2009).
- Erbil, S., et al. RACK1 Is an Interaction Partner of ATG5 and a Novel Regulator of Autophagy. J Biol Chem. 291, 16753-16765 (2016).
- Gozuacik, D., Yagci-Acar, H. F., Akkoc, Y., Kosar, A., Dogan-Ekici, A. I., Ekici, S. Anticancer use of nanoparticles as nucleic acid carriers. J Biomed Nanotechnol. 10, 1751-1783 (2014).
- Phizicky, E. M., Fields, S. Protein-protein interactions: methods for detection and analysis. Microbiol Rev. 59, 94-123 (1995).
- Uetz, P., et al. A comprehensive analysis of protein-protein interactions in Saccharomyces cerevisiae. Nature. 403, 623-627 (2000).
