Исследование взаимодействий протеин протеина в Autophagy исследований
Summary
Представленные здесь являются два методы исследования взаимодействия на основе антител протеин: иммунофлюоресценции и иммунопреципитации. Эти методы подходят для изучения физических взаимодействий между белками для обнаружения новых компонентов клеточной сигнальных путей и понимание динамики белков.
Abstract
Белок белковых взаимодействий являются важными для понимания сотовой сигнальных каскадов и выявления роман путь компонентов и динамики белков. Большая часть клеточной деятельности требует физических взаимодействий между белками. Для анализа и сопоставления этих взаимодействий, были разработаны различные экспериментальные методы, а также инструментов биоинформатики. Autophagy является сотовых рециркуляции механизм, который позволяет справиться с различными раздражители, включая лишение питательных веществ, химических веществ и гипоксии клетки. Чтобы лучше понять сигнализации событий, связанных с autophagy и обнаружить новые факторы, которые регулируют белковых комплексов в autophagy, мы провели экранов взаимодействия протеин протеина. Проверка этих результатов скрининга требует использования иммунофлюоресценции и методы иммунопреципитации. В этой системе, были протестированы конкретных связанных с autophagy белок белковых взаимодействий, которые мы обнаружили в Neuro2A (N2A) и HEK293T клеточных линий. Подробная информация о технических процедур, используемых описаны в этом документе визуализированных эксперимент.
Introduction
Macroautophagy (autophagy, здесь) представляет собой механизм клеточного стресса характеризуется поглощение сыпучих цитоплазмы, белков и органеллы в двойной мембраной пузырьков называется autophagic везикулы. Через слияние внешнего слоя двойной мембраной autophagic везикулы и их грузы доставляются лизосом и деградированных нем1. Autophagy происходит низкими базальный во всех типах клеток и во всех организмах, выполняя гомеостатических функций, таких как деградации белка и органелл (например, митохондрии) оборот. В условиях, ведущих к клеточного стресса, таких, как голод autophagy быстро upregulated и позволяет ячейки для поддержания уровней энергии и основного обмена1,2,3.
Около 30 autophagy гены клонировали от дрожжей и их белковых продуктов были показаны играть роль на различных этапах процесса autophagic, включая везикул нуклеации, расширение, везикул фьюжн конце endosome/Лизосома, и деградация грузов 4 , 5. были выявлены Ортологи большинства этих генов и исследования в различных организмах подтвердил сохранение их клеточных функций6. Исследования в течение последнего десятилетия показали, что несколько autophagy связанных белковых комплексов и белок белковых взаимодействий существуют и что они управляют autophagy пути замысловатые и контролируемым образом. Перекрестки, резервные копии, механизмы обратной связи и прямой существуют, и они позволяют ячейку для координации autophagy с другими мероприятиями (например, везикулярной секреции, лизосома биогенеза, от англ сортировки и транспорта7и т.д.) В беспристрастной дрожжей два гибридных экране с помощью белка autophagy ATG5 как приманку (ATG5 является ключевой autophagy белка участвуют в системе спрягать E2-как, которая опосредует LC3 lipidation в голода индуцированной autophagy), мы определили рецепторов активировано C-киназы 1 (RACK1; GNB2L1) как сильный элемент и Роман autophagy компонент8. Важно отметить, что экран показал, что ATG5-RACK1 взаимодействие незаменимым для индукции autophagy, autophagy классических индукторов (то есть, голода и mTOR торможения).
Методы, основанные на иммунофлюоресценции обычно используются для отслеживания взаимодействий протеин протеина. Эти методы основаны на основном антитела и помочь визуализировать взаимодействие и подтвердить клеточной локализации. В этой технике, флуоресцентные метки конъюгированных антител, которые являются специфическими для протеинов интереса, обычно используются для специфического окрашивания. Каждый белка могут быть помечены с антителами, в сочетании с различными флуоресцентными красителями. С помощью белка специфические антитела, дублирование сигнала при слиянии изображения указывает Сопредседатель Локализация белков под confocal микроскопии. Этот метод применим к клетки или даже ткани. Методы иммунофлуоресценции предоставляют подсказки о взаимодействия динамики и помочь определить размер и распределение белковых комплексов, отслеживая общие изменения в клеточной морфологии под различные условия9. Иммунопреципитация-это другой часто используемый на основе антител метод, который позволяет для анализа взаимодействий между учетом белков10. Используя эту технику, протеинов интереса изолированы от клеток или тканей выдержки, с использованием специфических антител, в результате осаждения белков, которые в комплексе или в контакте с протеином интереса. Co Иммунопреципитация, где обнаружен белок и его Сопредседатель интерактивных, показывает не только взаимодействие между двумя белками, но можно измерить его сила взаимодействия при различных обстоятельствах11.
Этот протокол описывает в детали ключевых методов, которые были использованы для подтверждения и характеризуют ATG5-RACK1 и RACK1-LC3 взаимодействия. Основное внимание уделяется иммунофлюоресценции и иммунопреципитации техники, с уделением особого внимания критических шагов и ловушки для autophagy исследований, а также устранение неполадок предложения.
Protocol
Representative Results
Discussion
Методы иммунопреципитации и иммунофлюоресценции имеют решающее значение для изучения взаимодействий протеин протеина. Хотя эти две техники широко используются и устоявшейся, некоторые критерии должны рассматриваться для определения качества экспериментов при использовании этих м?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана науки и технологических исследований Совет Турции (ТУБИТАК) 1001 Грант 107T153, университета Сабанчи. SEB и НМК поддерживаются TUBITAK BIDEB 2211 стипендии кандидат исследований.
Materials
| Trypsin EDTA Solution A | Biological Industries | BI03-050-1A | |
| PBS | GE Healthcare | SH-30256.01 | |
| DMEM (high glucose) | Sigma | 5671 | |
| DMEM (low glucose) | Sigma | 5546 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Hemocytometer | Sigma | Z359629-1EA | |
| coverslides | Jena Bioscience | CSL-103 | |
| slides | Isolab | I.075.02.005 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | |
| Torin | Tocris | 4247 | |
| DMSO | Sigma | VWRSAD2650 | |
| EBSS | Biological Industries | BI02-010-1A | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | 15812-7 | |
| BSA | Sigma | A4503 | |
| Saponin | Sigma | 84510 | |
| LC3 Antibody | Sigma | L7543 | |
| Anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11011 | |
| RACK1 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-17754 | |
| Anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | |
| NP-40 | Applichem | A16694.0250 | |
| Sodium Chloride | Applichem | A9242.5000 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 30970 | |
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Biochemika | A2572 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| Triton-X | Applichem | 4975 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma | 450243 | |
| ATG5 Antibody | Sigma | A0856 | |
| Glycerol | Applichem | A4453 | |
| β-Mercaptoethanol | Applichem | A1108.0250 | |
| Bromophenol blue | Applichem | A3640.0005 | |
| Non-Fat milk | Applichem | A0830 | |
| Tween 20 | Sigma | P5927 | |
| Sodium Azide | Riedel de Haen | 13412 | |
| Phenol red | Sigma | 114537-5G | |
| anti-rabbit IgG , HRP conjugated | Jackson Immuno. | 1110305144 | |
| Luminol | Fluka | 9253 | |
| Coumeric Acid | Sigma | C9008 | |
| Hydrogen Peroxide | Merck | K35522500604 | |
| anti mouse IgG, HRP conjugated | Jackson Immuno. | 115035003 | |
| β-Actin Antibody | Sigma | A5441 | |
| Normal rabbit serum | Santa Cruz Biotechnology | sc-2027 | |
| Rapamycin | Sigma | R0395 | |
| Protein A-Agarose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2001 | |
| fetal bovine serum | Biowest | S1810-500 | |
| penicillin/streptomycin solution | Biological Industries | 03-031-1B | |
| L-glutamine | Biological Industries | BI03-020-1B | |
| Bradford Solution | Sigma | 6916 | |
| Nitocellulose membrane | GE Healthcare | A10083108 | |
| X-ray Films | Fujifilm | 47410 19289 | |
| Protease inhibitor | Sigma | P8340 |
References
- Oral, O., Akkoc, Y., Bayraktar, O., Gozuacik, D. Physiological and pathological significance of the molecular cross-talk between autophagy and apoptosis. Histol Histopathol. 31, 479-498 (2016).
- Korkmaz, G., Tekirdag, K. A., Ozturk, D. G., Kosar, A., Sezerman, O. U., Gozuacik, D. MIR376A is a regulator of starvation-induced autophagy. PLoS One. 8, e82556 (2013).
- Itah, Z., et al. Hydrodynamic cavitation kills prostate cells and ablates benign prostatic hyperplasia tissue. Exp Biol Med (Maywood). 238, 1242-1250 (2013).
- Gozuacik, D., Kimchi, A. Autophagy as a cell death and tumor suppressor mechanism). Oncogene. 23, 2891-2906 (2004).
- Erzurumlu, Y., Kose, F. A., Gozen, O., Gozuacik, D., Toth, E. A., Ballar, P. A unique IBMPFD-related P97/VCP mutation with differential binding pattern and subcellular localization. Int J Biochem Cell Biol. 45, 773-782 (2013).
- Kuzuoglu-Ozturk, D., et al. Autophagy-related gene, TdAtg8, in wild emmer wheat plays a role in drought and osmotic stress response. Planta. 236, 1081-1092 (2012).
- Longatti, A., Tooze, S. A. Vesicular trafficking and autophagosome formation. Cell Death Differ. 16, 956-965 (2009).
- Erbil, S., et al. RACK1 Is an Interaction Partner of ATG5 and a Novel Regulator of Autophagy. J Biol Chem. 291, 16753-16765 (2016).
- Gozuacik, D., Yagci-Acar, H. F., Akkoc, Y., Kosar, A., Dogan-Ekici, A. I., Ekici, S. Anticancer use of nanoparticles as nucleic acid carriers. J Biomed Nanotechnol. 10, 1751-1783 (2014).
- Phizicky, E. M., Fields, S. Protein-protein interactions: methods for detection and analysis. Microbiol Rev. 59, 94-123 (1995).
- Uetz, P., et al. A comprehensive analysis of protein-protein interactions in Saccharomyces cerevisiae. Nature. 403, 623-627 (2000).
