Estudo das interações proteína-proteína em pesquisa de autofagia
Summary
Apresentados aqui são duas técnicas de pesquisa de interação da proteína-proteína baseada em anticorpos: imunofluorescência e imunoprecipitação. Estas técnicas são apropriadas para estudar interações físicas entre proteínas para a descoberta de novos componentes das vias de sinalização celulares e dinâmica de compreensão da proteína.
Abstract
Interações da proteína-proteína são importantes para cascatas de sinalização celular de compreensão e identificação via novela componentes e dinâmica da proteína. A maioria dos celulares atividades exigem interações físicas entre proteínas. Para analisar e mapear essas interações, foram desenvolvidas várias técnicas experimentais como ferramentas de Bioinformática. Autofagia é um celular, mecanismo que permite que as células lidar com estressores diferentes, incluindo hipoxia, produtos químicos e nutriente privação de reciclagem. Para entender melhor a sinalização de eventos relacionados a autofagia e descobrir novos fatores que regulam a complexos de proteínas em autofagia, realizamos telas de interação da proteína-proteína. Validação destes resultados de rastreio requer o uso de técnicas de imunoprecipitação e imunofluorescência. Neste sistema, interações específicas relacionadas a autofagia da proteína-proteína que descobrimos foram testadas em Neuro2A (N2A) e HEK293T linhas de celulares. Detalhes dos procedimentos técnicos utilizados são explicadas neste documento visualizado experimento.
Introduction
Macroautophagy (autofagia, neste documento) é um mecanismo de estresse celular que se caracteriza por sequestro de citoplasma em massa, proteínas e organelas em vesículas de membrana dupla chamadas vesículas autophagic. Através da fusão da camada externa da membrana dupla, vesículas autophagic e sua carga são entregues aos lisossomos e degradado nele1. Autofagia ocorre em níveis basais baixos em todos os tipos de células e em todos os organismos, realizando funções homeostáticas como degradação proteica e volume de negócios das organelas (por exemplo, as mitocôndrias). Sob condições que levaram ao estresse celular, tais como a fome, a autofagia é rapidamente upregulated e permite que a célula manter os níveis de energia e metabolismo básico1,2,3.
Cerca de 30 genes de autofagia foram clonados de levedura e seus produtos de proteína foram mostrados a desempenhar um papel em várias etapas do processo de autophagic, incluindo a nucleação de vesículas, a expansão, a fusão de vesículas atrasado endosome/lisossomo, e degradação de carga 4 , 5. Orthologs da maioria destes genes têm sido identificados e estudos em vários organismos confirmaram a preservação de suas funções celulares6. Estudos na última década que mostraram vários autofagia relacionados com complexos de proteínas e interações da proteína-proteína existem e que eles governam vias de autofagia de forma intrincada e controlada. Interseções, backups, feedback e feedforward mecanismos existem, e eles permitem que a célula coordenar autofagia com outros eventos relacionados (tais como biogênese lisossoma secreção vesicular, CDDP triagem e transporte7, etc.) Em uma tela de imparcial fermento-dois híbrido usando a proteína de autofagia ATG5 como uma isca, (ATG5 é uma proteína de autofagia chave envolvidos no sistema de conjugação de E2, como que medeia LC3 lipidation de fome induzida autofagia), nós identificamos Receptor ativado C-quinase 1 (RACK1; GNB2L1) como um forte interactor e um componente de autofagia romance8. Importante, a tela mostrou que a interação ATG5-RACK1 era indispensável para indução de autofagia por indutores de autofagia clássica (ou seja, à fome e mTOR inibição).
Métodos baseados em imunofluorescência são comumente usados para monitorar as interações da proteína-proteína. Estas técnicas são principalmente à base de anticorpos e ajudam a visualizar as interações e confirmar suas localizações celulares. Nesta técnica, fluorescente tag anticorpos conjugados que são específicos para as proteínas de interesse são geralmente usadas para a coloração específica. Cada proteína pode ser rotulada com anticorpos acoplados a corantes fluorescentes diferentes. Usando anticorpos específicos de proteínas, uma sobreposição no sinal quando imagens são mescladas indica a localização co das proteínas sob microscopia confocal. A técnica é aplicável para as células ou tecidos mesmo. Técnicas de imunofluorescência fornecem pistas sobre a dinâmica de interação e ajudam a identificar o tamanho e a distribuição de complexos de proteínas, enquanto o rastreamento de alterações gerais na morfologia celular sob diferentes condições de9. Imunoprecipitação é outra técnica comumente usada de anticorpo-baseado que permite a análise de interações entre proteínas10de dado. Usando esta técnica, as proteínas de interesse são isoladas de células ou tecidos extrai usando anticorpos específicos, originando a precipitação de proteínas em um complexo ou em contacto com uma proteína de interesse. Co-imunoprecipitação, onde a proteína e sua co interactor são detectados, revela não só a interação entre as duas proteínas, mas pode medir a sua força de interação sob circunstâncias diferentes11.
Este protocolo descreve em técnicas de chave de detalhe que foram usadas para confirmar e caracterizar a interação ATG5-RACK1 e RACK1-LC3. O foco é sobre as técnicas de imunofluorescência e imunoprecipitação, com ênfase de passos críticos e armadilhas para pesquisa de autofagia, bem como sugestões de resolução de problemas.
Protocol
Representative Results
Discussion
As técnicas de imunoprecipitação e imunofluorescência são cruciais para o estudo das interações da proteína-proteína. Embora estas duas técnicas são comumente usadas e bem estabelecida, diversos critérios devem ser considerados para definir a qualidade das experiências ao usar estas técnicas.
Anticorpos primários, primeiros que são usados em testes devem ser específicos para as proteínas de interesse. Para garantir isso, use knockdowns shRNA ou células de nocaute para testar…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo científico e tecnológico pesquisa Conselho da Turquia (TUBITAK) 1001 Grant 107T153, da Universidade Sabanci. SEB e NMK são suportados por uma bolsa TUBITAK BIDEB 2211 para estudos de doutorado.
Materials
| Trypsin EDTA Solution A | Biological Industries | BI03-050-1A | |
| PBS | GE Healthcare | SH-30256.01 | |
| DMEM (high glucose) | Sigma | 5671 | |
| DMEM (low glucose) | Sigma | 5546 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Hemocytometer | Sigma | Z359629-1EA | |
| coverslides | Jena Bioscience | CSL-103 | |
| slides | Isolab | I.075.02.005 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | |
| Torin | Tocris | 4247 | |
| DMSO | Sigma | VWRSAD2650 | |
| EBSS | Biological Industries | BI02-010-1A | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | 15812-7 | |
| BSA | Sigma | A4503 | |
| Saponin | Sigma | 84510 | |
| LC3 Antibody | Sigma | L7543 | |
| Anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11011 | |
| RACK1 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-17754 | |
| Anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | |
| NP-40 | Applichem | A16694.0250 | |
| Sodium Chloride | Applichem | A9242.5000 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 30970 | |
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Biochemika | A2572 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| Triton-X | Applichem | 4975 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma | 450243 | |
| ATG5 Antibody | Sigma | A0856 | |
| Glycerol | Applichem | A4453 | |
| β-Mercaptoethanol | Applichem | A1108.0250 | |
| Bromophenol blue | Applichem | A3640.0005 | |
| Non-Fat milk | Applichem | A0830 | |
| Tween 20 | Sigma | P5927 | |
| Sodium Azide | Riedel de Haen | 13412 | |
| Phenol red | Sigma | 114537-5G | |
| anti-rabbit IgG , HRP conjugated | Jackson Immuno. | 1110305144 | |
| Luminol | Fluka | 9253 | |
| Coumeric Acid | Sigma | C9008 | |
| Hydrogen Peroxide | Merck | K35522500604 | |
| anti mouse IgG, HRP conjugated | Jackson Immuno. | 115035003 | |
| β-Actin Antibody | Sigma | A5441 | |
| Normal rabbit serum | Santa Cruz Biotechnology | sc-2027 | |
| Rapamycin | Sigma | R0395 | |
| Protein A-Agarose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2001 | |
| fetal bovine serum | Biowest | S1810-500 | |
| penicillin/streptomycin solution | Biological Industries | 03-031-1B | |
| L-glutamine | Biological Industries | BI03-020-1B | |
| Bradford Solution | Sigma | 6916 | |
| Nitocellulose membrane | GE Healthcare | A10083108 | |
| X-ray Films | Fujifilm | 47410 19289 | |
| Protease inhibitor | Sigma | P8340 |
References
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