Studio delle interazioni proteina-proteina nella ricerca di autofagia
Summary
Presentato qui sono due tecniche di ricerca di interazione proteina-proteina anticorpo-basato: immunofluorescenza e immunoprecipitazione. Queste tecniche sono adatte per lo studio delle interazioni fisiche tra le proteine per la scoperta di nuovi componenti delle vie di segnalazione cellulare e per la dinamica di proteina di comprensione.
Abstract
Interazioni proteina-proteina sono importanti per Cascate di segnalazione cellulare comprensione e identificazione via novella componenti e dinamica di proteine. La maggior parte delle attività cellulari richiede interazioni fisiche tra proteine. Per analizzare e mappare queste interazioni, sono state sviluppate varie tecniche sperimentali, nonché strumenti di bioinformatica. L’autofagia è un cellulare di riciclaggio il meccanismo che permette alle cellule di far fronte a diversi fattori di stress, compreso ipossia, prodotti chimici e privazione nutriente. Al fine di comprendere meglio autophagy-relative segnalazione eventi e scoprire nuovi fattori che regolano i complessi della proteina nell’autofagia, abbiamo effettuato gli schermi di interazione proteina-proteina. Convalida di questi risultati di screening richiede l’utilizzo di tecniche di immunoprecipitazione e di immunofluorescenza. In questo sistema, interazioni proteina-proteina specifica autophagy-relative che abbiamo scoperto sono state testate in Neuro2A (N2A) e linee cellulari di HEK293T. Dettagli delle procedure tecniche utilizzate sono spiegati in questa carta visualizzati esperimento.
Introduction
Macroautophagy (autofagia, nel presente documento) è un meccanismo di stress cellulare che si caratterizza per il sequestro di massa citoplasma, proteine e organelli in vescicole di membrana doppia chiamati vescicole autofagiche. Attraverso la fusione dello strato esterno della membrana doppia, vescicole autofagiche e loro carico vengono recapitati ai lisosomi e degradato in esso1. L’autofagia si verifica a bassi livelli basali in tutti i tipi cellulari e in tutti gli organismi, svolgono funzioni omeostatiche come degradazione proteica e fatturato organello (ad es., mitocondri). Sotto condizioni che portano a stress cellulare, come la fame, l’autofagia è rapidamente aumentata e permette alla cellula di mantenere livelli di energia e metabolismo di base1,2,3.
Circa 30 geni di autofagia sono stati clonati dal lievito e loro prodotti proteici sono stati indicati per svolgere un ruolo nelle varie fasi del processo autofagico, tra cui nucleazione della vescicola, espansione, fusione della vescicola a fine endosoma/lisosoma e il degrado del carico 4 , 5. ortologhi della maggior parte di questi geni sono stati identificati e gli studi in vari organismi hanno confermato la conservazione delle loro funzioni cellulari6. Studi nell’ultimo decennio hanno dimostrato che diversi autophagy-relative complessi della proteina e interazioni proteina-proteina esistano e che governano le vie dell’autofagia in modo intricato e controllato. Intersezioni, backup, feedback e feedforward meccanismi esistono, e consentono la cella coordinare l’autofagia con altri eventi correlati (ad esempio la secrezione vescicolare, biogenesi lisosoma, endosomal cernita e trasporto7, ecc.) In uno schermo di imparziale LIEVITO-due ibrido utilizzando la proteina di autofagia ATG5 come esca, (ATG5 è una proteina di autofagia chiave coinvolti nel sistema di coniugazione E2-come che media LC3 translazionale nell’inedia indotta autofagia), abbiamo identificato il recettore attivato C-chinasi 1 (RACK1; GNB2L1) come una forte interazione e un romanzo autofagia componente8. D’importanza, lo schermo ha mostrato che l’interazione di ATG5-RACK1 era indispensabile per induzione di autofagia da induttori di autofagia classica (cioè, inedia e mTOR inibizione).
Metodi basati su immunofluorescenza sono comunemente utilizzati per monitorare le interazioni proteina-proteina. Queste tecniche sono principalmente basati su anticorpi e aiutano a visualizzare interazioni e confermare localizzazioni cellulari. In questa tecnica, fluorescente tag anticorpi coniugati che sono specifici per le proteine di interesse sono generalmente utilizzate per la colorazione specifica. Ogni proteina può essere etichettato con anticorpi accoppiati a tinture fluorescenti differenti. Utilizzando anticorpi specifici per proteine, una sovrapposizione del segnale quando le immagini vengono unite indica la co-localizzazione di proteine nell’ambito di microscopia confocale. La tecnica è applicabile a cellule o tessuti anche. Tecniche di immunofluorescenza forniscono indizi circa la dinamica di interazione e aiutano a identificare le dimensioni e la distribuzione dei complessi della proteina, tenendo traccia delle modifiche generali in morfologia cellulare sotto diverse condizioni9. Immunoprecipitazione è un’altra tecnica comunemente usata anticorpo-basato che permette l’analisi delle interazioni tra dato proteine10. Utilizzando questa tecnica, le proteine di interesse sono isolate da cellule o tessuti estratti utilizzando anticorpi specifici, con conseguente precipitazione delle proteine che sono in un complesso o a contatto con una proteina di interesse. Co-immunoprecipitazione, dove la proteina e la sua co-interactor vengono rilevati, rivela non solo l’interazione tra le due proteine, ma può misurare la sua forza di interazione sotto diverse circostanze11.
Questo protocollo descrive in dettaglio le tecniche di base che sono state usate per confermare e caratterizzare ATG5-RACK1 e RACK1-LC3 interazione. Il focus è sulle tecniche di immunofluorescenza e immunoprecipitazione, con enfasi di passaggi critici e insidie per autofagia ricerca, così come suggerimenti di risoluzione dei problemi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tecniche di immunoprecipitazione e di immunofluorescenza sono cruciali per lo studio delle interazioni proteina-proteina. Anche se queste due tecniche sono comunemente utilizzati e ben consolidata, dovrebbero essere considerati diversi criteri per definire la qualità di esperimenti durante l’utilizzo di queste tecniche.
In primo luogo, primari anticorpi che vengono utilizzati in queste prove devono essere specifici per le proteine di interesse. A tal fine, utilizzare shRNA atterramenti o cell…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da scientifica e tecnologica ricerca Consiglio della Turchia (TUBITAK) 1001 Grant 107T153, l’Università di Sabanci. SEB e NMK sono supportati da una borsa di studio di TUBITAK BIDEB 2211 per gli studi di dottorato di ricerca.
Materials
| Trypsin EDTA Solution A | Biological Industries | BI03-050-1A | |
| PBS | GE Healthcare | SH-30256.01 | |
| DMEM (high glucose) | Sigma | 5671 | |
| DMEM (low glucose) | Sigma | 5546 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Hemocytometer | Sigma | Z359629-1EA | |
| coverslides | Jena Bioscience | CSL-103 | |
| slides | Isolab | I.075.02.005 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | |
| Torin | Tocris | 4247 | |
| DMSO | Sigma | VWRSAD2650 | |
| EBSS | Biological Industries | BI02-010-1A | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | 15812-7 | |
| BSA | Sigma | A4503 | |
| Saponin | Sigma | 84510 | |
| LC3 Antibody | Sigma | L7543 | |
| Anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11011 | |
| RACK1 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-17754 | |
| Anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | |
| NP-40 | Applichem | A16694.0250 | |
| Sodium Chloride | Applichem | A9242.5000 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 30970 | |
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Biochemika | A2572 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| Triton-X | Applichem | 4975 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma | 450243 | |
| ATG5 Antibody | Sigma | A0856 | |
| Glycerol | Applichem | A4453 | |
| β-Mercaptoethanol | Applichem | A1108.0250 | |
| Bromophenol blue | Applichem | A3640.0005 | |
| Non-Fat milk | Applichem | A0830 | |
| Tween 20 | Sigma | P5927 | |
| Sodium Azide | Riedel de Haen | 13412 | |
| Phenol red | Sigma | 114537-5G | |
| anti-rabbit IgG , HRP conjugated | Jackson Immuno. | 1110305144 | |
| Luminol | Fluka | 9253 | |
| Coumeric Acid | Sigma | C9008 | |
| Hydrogen Peroxide | Merck | K35522500604 | |
| anti mouse IgG, HRP conjugated | Jackson Immuno. | 115035003 | |
| β-Actin Antibody | Sigma | A5441 | |
| Normal rabbit serum | Santa Cruz Biotechnology | sc-2027 | |
| Rapamycin | Sigma | R0395 | |
| Protein A-Agarose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2001 | |
| fetal bovine serum | Biowest | S1810-500 | |
| penicillin/streptomycin solution | Biological Industries | 03-031-1B | |
| L-glutamine | Biological Industries | BI03-020-1B | |
| Bradford Solution | Sigma | 6916 | |
| Nitocellulose membrane | GE Healthcare | A10083108 | |
| X-ray Films | Fujifilm | 47410 19289 | |
| Protease inhibitor | Sigma | P8340 |
References
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