Présentées ici sont deux techniques de recherche d’interaction protéine-protéine de base d’anticorps : immunofluorescence et immunoprécipitation. Ces techniques ne conviennent pas pour l’étude des interactions physiques entre les protéines pour la découverte de nouvelles composantes des voies de signalisation cellulaires et pour comprendre la dynamique de protéine.
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Article de méthode
Étude des Interactions protéine-protéine dans la recherche de l’autophagie
Dans cet article
Résumé
Résumé
Interactions protéines-protéines sont importantes pour les cascades de signalisation cellulaire compréhension et identification des composants de voie nouvelle et dynamique des protéines. La majorité des activités cellulaires nécessite des interactions physiques entre les protéines. Pour analyser et cartographier ces interactions, les différentes techniques expérimentales ainsi que des outils bioinformatiques ont été développés. Autophagie est un téléphone cellulaire, mécanisme qui permet aux cellules faire face aux différents stress, y compris l’hypoxie, produits chimiques et la privation nutritive de recyclage. Afin de mieux comprendre les événements de signalisation liés à autophagie et de découvrir de nouveaux facteurs régulateurs complexes protéiques dans autophagie, nous avons réalisé des écrans d’interaction protéine-protéine. Validation de ces résultats de dépistage nécessite l’utilisation de l’immunofluorescence et techniques de l’immunoprécipitation. Dans ce système, les interactions protéine-protéine autophagie spécifique que nous avons découvert ont été testées en Neuro2A (N2A) et des lignées de cellules HEK293T. Détails des procédures techniques utilisées sont expliquées dans le présent document expérience visualisées.
Introduction
Macroautophagy (autophagie, ci-après) est un mécanisme de stress cellulaire qui se caractérise par la séquestration du cytoplasme en vrac, les protéines et les organelles dans les vésicules de membrane double appelés autophagiques vésicules. Par fusion de la couche externe de la membrane double, vésicules autophagiques et leurs cargaisons sont envoyées vers les lysosomes et dégradent y1. Autophagie se produit à faible taux de base dans tous les types de cellules et dans tous les organismes exerçant des fonctions homéostatiques tels que la dégradation des protéines et organelle (p. ex., mitochondries) chiffre d’affaires. Dans des condit....
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Protocole
1. immunofluorescence
- maintenir HEK293T rein embryonnaire humain cellules dans un milieu DMEM hyperglycémie et cellules de neuroblastes N2A souris en DMEM basse moyenne de glucose, dans un 5 % CO 2-humidifié incubateur à 37 ° C. Compléter les milieux de culture avec du sérum 10 % inactivés par la chaleur de foetus bovins (FBS), antibiotiques (50 U/mL de pénicilline, 50 µg/mL de streptomycine) et L-glutamine (2 mM).
- Détacher les cellules à l’aide de 0,25 % de trypsine. Tout d’abord, retirez le support de la culture cellulaire puis laver les cellules avec 10 mL stérile phosphate salin (PBS) et incuber 1 ml de trypsine à 37 ° C pendant 5 m....
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Résultats
Dans la Figure 1 un exemple d’une co-localisation résultat obtenu à l’aide de ce protocole est montré. Une figure de notre récent livre, figure8. Ici, protéine endogène de racks 1 a été coloré en vert, tandis que LC3 endogène a été teinté en rouge. Les points jaunes qui sont observées dans les images fusionnées indiquent les sites de chevauchement entre les signaux rouges et verts. Les points jaunes représentent ainsi la co-localisation partielle de ces deux protéines.......
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Discussion
Techniques d’immunoprécipitation et immunofluorescence sont essentiels pour l’étude des interactions protéine-protéine. Bien que ces deux techniques sont couramment utilisés et bien établie, plusieurs critères devraient être considérés pour définir la qualité des expériences tout en utilisant ces techniques.
Tout d’abord, primaires des anticorps qui sont utilisées pour ces épreuves doivent être spécifiques aux protéines d’intérêt. Pour ce faire, utilisez shARN passes rabattues ou cellules knoc.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par la recherche scientifique et technologique Conseil de Turquie (TUBITAK) 1001 Grant 107T153, l’Université Sabanci. SEB et NMK sont pris en charge par une bourse TUBITAK BIDEB 2211 pour des études de doctorat.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Trypsine EDTA Solution A | Biological Industries ; | BI03-050-1A | |
| PBS | GE Healthcare | SH-30256.01 | |
| DMEM (glycémie élevée) | Sigma ; | 5671 | |
| DMEM (faible teneur en glucose) | Sigma | 5546 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Hémocytomètre | Sigma | Z359629-1EA | |
| coverslides | Jena Bioscience | CSL-103 | |
| slides | Isolab | I.075.02.005 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma ; | P8920 | |
| Torin | Tocris | 4247 | |
| DMSO | Sigma | VWRSAD2650 | |
| EBSS | Biological Industries ; | BI02-010-1A | |
| Paraformaldéhyde (PFA) | Sigma | 15812-7 | |
| BSA | Sigma | ; A4503 | |
| Saponin | Sigma | 84510 | |
| LC3 Anticorps | Sigma | L7543 | |
| Anti-Lapin IgG Alexa Fluor 568 | ; Invitrogen | A11011 | |
| RACK1 Anticorps | Santa Cruz Biotechnology | ; sc-17754 | |
| Anti-souris IgG Alexa Fluor 488 | ; Invitrogen | A11001 | |
| NP-40 | Applichem | A16694.0250 | |
| Chlorure de sodium | Applichem | A9242.5000 | |
| Désoxycholate | de sodium Sigma | 30970 | |
| Dodécylsulfate de sodium (SDS) | Biochemika | A2572 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| Triton-X ; | Applichem | 4975 | |
| Orthovanadate sodique | Sigma | 450243 | |
| ATG5 Anticorps | Sigma | A0856 | |
| Glycérol | Applichem | A4453 | |
| &beta ;-Mercaptoéthanol ; | Applichem | A1108.0250 | |
| Bleu de bromophénol | Applichem | A3640.0005 | |
| Lait écrémé | Applichem | A0830 | |
| Tween 20 | Sigma | P5927 | |
| Azoture de sodium | Riedel de Haen | 13412 | |
| Rouge phénolique | Sigma | 114537-5G | |
| IgG anti-lapin, HRP conjuguée | Jackson Immuno. ; | ||
| Luminol | Fluka | 9253 | |
| Acide coumérique | Sigma | C9008 | |
| Peroxyde d’hydrogène | Merck | K35522500604 | |
| anti souris IgG, HRP conjugué | Jackson Immuno. | Anticorps anti-actine 115035003 | |
| &bêta ;- | Sigma ; | A5441 | |
| Sérum de lapin normal | Santa Cruz Biotechnology | sc-2027 | |
| Rapamycin | Sigma | ; R0395 | |
| Protéine A-Agarose Perles | Santa Cruz Biotechnology | sc-2001 | |
| sérum fœtal bovin ; | Biowest | S1810-500 | |
| pénicilline/streptomycine solution | Biological Industries ; | 03-031-1B | |
| L-glutamine ; | Industries biologiques ; | BI03-020-1B | |
| Bradford Solution | Sigma | 6916 | |
| Membrane en nitocellulose | GE Healthcare | A10083108 | |
| Films à rayons X Fujifilm | 47410 19289 | ||
| Inhibiteur de protéase | Sigma | P8340 |
Références
- Oral, O., Akkoc, Y., Bayraktar, O., Gozuacik, D. Physiological and pathological significance of the molecular cross-talk between autophagy and apoptosis. Histol Histopathol. 31, 479-498 (2016).
- Korkmaz, G., Tekirdag, K. A., Ozturk, D. G., Kosar, A., Sezerman, O. U., Gozuacik, D.
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Réimpressions et autorisations
