Estudio de las interacciones proteína-proteína en la autofagia investigación
Summary
Presentados aquí son dos técnicas de investigación de interacción de proteínas anticuerpo-basado: la inmunofluorescencia y la inmunoprecipitación. Estas técnicas son convenientes para el estudio de interacciones físicas entre proteínas para el descubrimiento de nuevos componentes de vías de señalización celulares y para la dinámica de la proteína de comprensión.
Abstract
Las interacciones proteína-proteína son importantes cascadas de señalización celular de comprensión identificación vía nuevos componentes y dinámica de proteínas. La mayoría de las actividades celulares requiere interacciones físicas entre proteínas. Para analizar y mapear estas interacciones, se desarrollaron varias técnicas experimentales como herramientas bioinformáticas. La autofagia es un celular reciclado mecanismo que permite a las células hacer frente a diferentes factores de estrés, incluyendo hipoxia, productos químicos y privación de nutrientes. Para entender mejor la autofagia-eventos relacionados con señalización y descubrir nuevos factores que regulan los complejos proteicos en la autofagia, realizamos pantallas de interacción proteína-proteína. Validación de estos resultados requiere el uso de técnicas de inmunoprecipitación y la inmunofluorescencia. En este sistema, interacciones proteína-proteína relacionada con la autofagia específico que descubrimos fueron probadas en Neuro2A (N2A) y líneas de células HEK293T. Detalles de los procedimientos técnicos utilizados se explican en este artículo experimento visualizado.
Introduction
Macroautophagy (autofagia, aquí) es un mecanismo de estrés celular que se caracteriza por el secuestro de citoplasma grueso, proteínas y organelos en vesículas de doble membrana llamados vesículas autofágicas. A través de la fusión de la capa externa de la membrana doble, vesículas autofágicas y su carga se entregan a los lisosomas y degradación en ella1. Autofagia ocurre en bajos niveles basales en todos los tipos celulares y en todos los organismos, realizando funciones homeostáticas como degradación de las proteínas y organelas (p. ej., mitocondrias) facturación. Bajo condiciones de estrés celular, como el hambre, la autofagia es rápidamente alza y permite a la célula mantener los niveles de energía y metabolismo básico1,2,3.
Alrededor de 30 genes de autofagia han sido clonados de la levadura y sus productos de proteína fueron demostrados para desempeñar un papel en las distintas etapas del proceso de autofagia, incluyendo nucleación de vesícula, expansión, fusión de la vesícula al último endosome/lisosoma y degradación de la carga 4 , 5. se han identificado ortólogos de la mayoría de estos genes y estudios en distintos organismos confirmaron la preservación de sus funciones celulares6. Estudios en la última década demostraron que varios autofagia relacionadas existen complejos de la proteína y las interacciones proteína-proteína y que gobiernan las vías autofagia de manera intrincada y controlada. Existen intersecciones, copias de seguridad, retroalimentación y mecanismos de feedforward, y permiten que la célula de coordinación de la autofagia con otros eventos relacionados (tales como secreción vesicular, biogénesis del lisosoma, endosomal clasificación y transporte7, etc.) En una pantalla de imparcial híbrido de levadura-dos utilizando la proteína autofagia ATG5 como cebo (ATG5 es una proteína de autofagia clave implicados en el sistema de conjugación como E2 que media lipidation LC3 en inanición inducida por autofagia), hemos identificado del Receptor activado C-kinasa 1 (RACK1; GNB2L1) como un fuerte interactor y un componente de autofagia novela8. Lo importante, la pantalla mostró que la interacción ATG5-RACK1 fue indispensable para la inducción autofagia por inductores de autofagia clásica (inhibición, es decir, hambre y mTOR).
Métodos de inmunofluorescencia se utilizan para controlar las interacciones proteína-proteína. Estas técnicas están principalmente basados en anticuerpos y ayudan a visualizar las interacciones y confirmar localizaciones celulares. En esta técnica fluorescente etiqueta conjugados anticuerpos que son específicos de las proteínas de interés se utilizan generalmente para la tinción específica. Cada proteína puede etiquetarse con anticuerpos acoplados a tintes fluorescentes diferentes. Usando los anticuerpos específicos de proteína, una superposición de la señal cuando se combinan imágenes indica la colocalización de proteínas bajo microscopia confocal. La técnica es aplicable a células o tejidos incluso. Técnicas de inmunofluorescencia proporcionan pistas sobre la dinámica de interacción y ayudar a identificar el tamaño y distribución de complejos proteicos, y seguimiento de los cambios generales en la morfología celular bajo diferentes condiciones9. La inmunoprecipitación es otra técnica utilizada basados en anticuerpos que permite el análisis de las interacciones entre dado proteínas10. Usando esta técnica, proteínas de interés se aíslan de células o tejido extractos utilizando anticuerpos específicos, dando por resultado la precipitación de proteínas que se encuentran en un complejo o en contacto con una proteína de interés. Co-inmunoprecipitación, donde se detectaron la proteína y su interactor Co, revela no sólo la interacción entre dos proteínas, pero puede medir su intensidad de interacción bajo diferentes circunstancias11.
Este protocolo se describe en técnicas clave de detalle que se utilizaron para confirmar y caracterizar la interacción ATG5-RACK1 y RACK1-LC3. El enfoque es sobre técnicas de inmunofluorescencia y la inmunoprecipitación con énfasis de pasos críticos y las dificultades para la investigación de la autofagia, así como sugerencias de solución de problemas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Técnicas de inmunoprecipitación e inmunofluorescencia son cruciales para el estudio de las interacciones proteína-proteína. Aunque estas dos técnicas se utilizan y bien establecido, se deben considerar varios criterios para definir la calidad de los experimentos durante el uso de estas técnicas.
En primer lugar, primarios los anticuerpos que se utilizan en estas pruebas deben ser específicos para las proteínas de interés. Para ello, utilizar shRNA caídas o células de nocaut para pro…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por científicos y tecnológicos investigación Consejo de Turquía (TUBITAK) 1001 107T153 de la beca, la Universidad de Sabanci. SEB y NMK cuentan con una beca de TUBITAK BIDEB 2211 para estudios de doctorado.
Materials
| Trypsin EDTA Solution A | Biological Industries | BI03-050-1A | |
| PBS | GE Healthcare | SH-30256.01 | |
| DMEM (high glucose) | Sigma | 5671 | |
| DMEM (low glucose) | Sigma | 5546 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Hemocytometer | Sigma | Z359629-1EA | |
| coverslides | Jena Bioscience | CSL-103 | |
| slides | Isolab | I.075.02.005 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | |
| Torin | Tocris | 4247 | |
| DMSO | Sigma | VWRSAD2650 | |
| EBSS | Biological Industries | BI02-010-1A | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | 15812-7 | |
| BSA | Sigma | A4503 | |
| Saponin | Sigma | 84510 | |
| LC3 Antibody | Sigma | L7543 | |
| Anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11011 | |
| RACK1 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-17754 | |
| Anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | |
| NP-40 | Applichem | A16694.0250 | |
| Sodium Chloride | Applichem | A9242.5000 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 30970 | |
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Biochemika | A2572 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| Triton-X | Applichem | 4975 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma | 450243 | |
| ATG5 Antibody | Sigma | A0856 | |
| Glycerol | Applichem | A4453 | |
| β-Mercaptoethanol | Applichem | A1108.0250 | |
| Bromophenol blue | Applichem | A3640.0005 | |
| Non-Fat milk | Applichem | A0830 | |
| Tween 20 | Sigma | P5927 | |
| Sodium Azide | Riedel de Haen | 13412 | |
| Phenol red | Sigma | 114537-5G | |
| anti-rabbit IgG , HRP conjugated | Jackson Immuno. | 1110305144 | |
| Luminol | Fluka | 9253 | |
| Coumeric Acid | Sigma | C9008 | |
| Hydrogen Peroxide | Merck | K35522500604 | |
| anti mouse IgG, HRP conjugated | Jackson Immuno. | 115035003 | |
| β-Actin Antibody | Sigma | A5441 | |
| Normal rabbit serum | Santa Cruz Biotechnology | sc-2027 | |
| Rapamycin | Sigma | R0395 | |
| Protein A-Agarose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2001 | |
| fetal bovine serum | Biowest | S1810-500 | |
| penicillin/streptomycin solution | Biological Industries | 03-031-1B | |
| L-glutamine | Biological Industries | BI03-020-1B | |
| Bradford Solution | Sigma | 6916 | |
| Nitocellulose membrane | GE Healthcare | A10083108 | |
| X-ray Films | Fujifilm | 47410 19289 | |
| Protease inhibitor | Sigma | P8340 |
References
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