الأسفار بوساطة التصوير المقطعي للكشف والتحديد الكمي لالتهاب الأمعاء مورين المتصلة بلعم
Summary
تحقيقات محددة الهدف تمثل أداة مبتكرة لتحليل الآليات الجزيئية، مثل تعبير البروتين في أنواع مختلفة من الأمراض (مثل التهاب وعدوى توموريجينيسيس). في هذه الدراسة، يصف لنا إجراء تقييم كمي تمجربهك ثلاثي الأبعاد لتسلل بلعم المعوية في نموذج مورين من التهاب القولون باستخدام التصوير المقطعي الأسفار بوساطة خاصة-F4/80.
Abstract
نماذج مورين من المرض لا غنى عنها للبحث العلمي. ومع ذلك، لا تستخدم العديد من الأدوات التشخيصية مثل التنظير أو تصوير تمجربهك بشكل روتيني في نماذج حيوانية. قراءات التجريبية التقليدية غالباً ما يعتمدون على التحليلات بعد الوفاة و السابقين فيفو ، الذي منع فحوص المتابعة داخل الفرد وزيادة عدد الحيوانات الدراسة المطلوبة. الأسفار بوساطة التصوير المقطعي يمكن التقييم غير الغازية، المتكررة، والكمية، وثلاثي الأبعاد من المسابر الفلورسنت. وهي حساسة للغاية ويسمح باستخدام صانعي الجزيئية، مما يسمح بكشف محددة ووصف أهداف جزيئية متميزة. على وجه الخصوص، والمسابير المستهدفة تمثل أداة مبتكرة لتحليل التعبير الجيني التنشيط والبروتين في التهاب، أمراض المناعة الذاتية، والعدوى، وأمراض الأوعية الدموية، الهجرة الخلية، توموريجينيسيس، إلخ. في هذه المقالة، نقدم إرشادات خطوة بخطوة على هذا تكنولوجيا التصوير المتطورة للكشف في فيفو وتوصيف لالتهاب (أي تسلل بلعم F4/80-إيجابي) في نموذج مورين مستخدمة على نطاق واسع من التهاب الأمعاء. يمكن أيضا استخدام هذه التقنية في مجالات البحث الأخرى، مثل تتبع الخلية أو الخلايا الجذعية محصنة.
Introduction
نماذج حيوانية تستخدم على نطاق واسع في البحوث العلمية، ووجود العديد من الإجراءات غير الغازية لرصد المرض النشاط والحيوية، مثل التحديد الكمي لتغيرات وزن الجسم أو تحليل الدم والبول والبراز. ومع ذلك، هذه هي فقط المعلمات البديلات غير المباشرة التي تخضع أيضا للتباين بين الأفراد. أنهم كثيرا ما يجب أن تكملها بعد الوفاة من تحاليل لعينات الأنسجة، مما يمنع المسلسل من المراقبة في نقاط زمنية متكررة ومباشرة عمليات المراقبة الفسيولوجية أو المرضية في فيفو. ظهرت تقنيات التصوير المتطورة في الحيوانات الصغيرة، بما في ذلك عبر التصوير المقطعية والتصوير الضوئي، والتنظير، التي تمكن من التصور مباشرة لهذه العمليات ويسمح أيضا لإجراء تحاليل متكررة ل الحيوانات نفس1 , 2 , 3. بالإضافة إلى ذلك، إمكانية رصد متكررة الولايات المختلفة للمرض في الحيوان نفسه قد يخفض عدد الحيوانات اللازمة، والتي قد يكون من المستصوب من وجهة نظر أخلاق حيوانية.
توجد عدة تقنيات التصوير الضوئي مختلفة للتصوير في فيفو الأسفار. في الأصل، كان يعمل تصوير [كنفوكل] لدراسة الأحداث الفلورسنت السطحية والجوفية4،5. ، ومع ذلك، تمجربهك الأنظمة التي تسمح لتقييمات كمية الأنسجة ثلاثية الأبعاد في الآونة الأخيرة نمواً6. وقد تحقق من خلال وضع المسابر الفلورسنت التي ينبعث منها الضوء في الطيف (الجرد) القريبة من الأشعة تحت الحمراء، تقدم الاستيعاب منخفضة وأجهزة حساسة للكشف عن مصادر الضوء أحادي اللون7. بينما تقنيات التصوير كروسسيكتيونينج التقليدية، مثل التصوير المقطعي (CT) أو التصوير بالرنين المغناطيسي (التصوير بالرنين المغناطيسي)، أو الموجات فوق الصوتية (الولايات المتحدة)، يعتمد معظمها على البارامترات الفيزيائية وتصور مورفولوجيا، يمكن توفير تصوير بصري معلومات إضافية على العمليات الجزيئية الكامنة وراء استخدام الفلورية داخلية أو خارجية يسبر8.
التقدم في علم الأحياء الجزيئي ساعدت على تسهيل توليد المسابر الجزيئية الفلورسنت ذكية وهادفة لعدد متزايد من الأهداف. على سبيل المثال، بوساطة مستقبلات الامتصاص والتوزيع في منطقة مستهدفة معينة يمكن تصور استخدام الأجسام المضادة المسمى مشتق كاربوسيانيني9. الوفرة من الأجسام المضادة المتاحة، التي يمكن أن يكون المسمى لتؤدي وظيفة معينة تتبع في مناطق لا يمكن الوصول إليها إلا من الجسم، ويقدم أفكاراً لم يسبق له مثيل في العمليات الجزيئية والخلوية في نماذج توموريجينيسيس والأعصاب، 7من أمراض القلب والأوعية الدموية والمناعية والالتهابات.
في هذه الدراسة، يصف لنا استخدام التصوير المقطعي بوساطة fluorescence في نموذج مورين من التهاب القولون. كبريتات الصوديوم ديكستران (DSS)-التهاب القولون المحرض هو نموذج مستحث كيميائيا ماوس قياسية لالتهاب الأمعاء يشبه التهاب الأمعاء المرض (بنك التنمية بين الأمريكتين)10. أنها مفيدة بشكل خاص لتقييم مساهمة نظام المناعة الفطرية لتطوير التهاب الأمعاء11. منذ تعيين والتنشيط، وتسلل وحيدات والضامة تمثل خطوات حاسمة في الآلية المرضية لبنك التنمية بين الأمريكتين، التصور لتجنيدهم والحركية من تسلل ضرورية للرصد، على سبيل المثال، أثر المواد العلاجية المحتملة في إعداد السريري12. ونحن تصف تنظيم دورات تعريفية لالتهاب القولون DSS وإثبات وصف التصوير المقطعي بوساطة بلعم تسلل إلى الغشاء المخاطي للقناة الهضمية استخدام التصوير المقطعي fluorescence الجزيئية لتصور محدد لعلامة الوحيدات/بلعم F4/80 13-وبالإضافة إلى ذلك، نحن لتوضيح الإجراءات الإضافية والتكميلية، مثل وضع العلامات جسم؛ الإعداد التجريبية؛ وتحليل وتفسير الصور التي تم الحصول عليها، وفي ترابط مع قراءات التقليدية مثل مؤشرات نشاط المرض، التدفق الخلوي والتحليل النسيجي، وإيمونوهيستوتشيميستري. نحن مناقشة القيود المفروضة على هذا الأسلوب ومقارنات بطرائق أخرى للتصوير.
Protocol
Representative Results
Discussion
على الرغم من أن تقنيات التصوير الطبية قد تطورت بسرعة في السنوات الأخيرة، ونحن لا تزال محدودة في قدرتنا على الكشف عن عمليات التهابات أو الأورام، فضلا عن الأمراض الأخرى، وفي هذه المراحل الأولى من التنمية. ومع ذلك، وهذا بالغ الأهمية لفهم نمو الورم والغزو، أو الانبثاث التنمية والعمليات الخلو…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونشكر السيدة سونيا دوفينتيستير، والسيدة الكه فيبر، والسيدة كلاوديا Niepagenkämper للمساعدة التقنية الممتازة.
Materials
| Reagents | |||
| Alfalfa-free diet | Harlan Laboritories, Madison, USA | 2014 | |
| Bepanthen eye ointment | Bayer, Leverkusen, Germany | 80469764 | |
| Dextran sulphate sodium (DSS) | TdB Consulatancy, Uppsala, Sweden | DB001 | |
| Eosin | Sigma – Aldrich, Deisenhofen, Germany | E 4382 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma – Aldrich, Deisenhofen, Germany | E 9884 | |
| Florene 100V/V | Abbott, Wiesbaden, Germany | B506 | |
| Haematoxylin | Sigma – Aldrich, Deisenhofen, Germany | HHS32-1L | |
| O.C.T. Tissue Tek compound | Sakura, Zoeterwonde, Netherlands | 4583 | fixative for histological analyses |
| Phosphate buffered saline, PBS | Lonza, Verviers, Belgium | 4629 | |
| Sodium Chloride 0,9% | Braun, Melsungen, Germany | 5/12211095/0411 | |
| Sodium bicarbonate powder | Sigma Aldrich Deisenhofen, Germany | S5761 | |
| Standard diet | Altromin, Lage, Germany | 1320 | |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura, Leiden, Netherlands | 4566 | |
| Hemoccult (guaiac paper test) | Beckmann Coulter, Germany | 3060 | |
| Biotin rat-anti-mouse anti-F4/80 antibody | Serotec, Oxford, UK | MCA497B | |
| Biotin rat-anti-mouse anti-GR-1 | BD Pharmingen, Heidelberg Germany | 553125 | |
| Streptavidin-Alexa546 | Molecular Probes, Darmstadt, Germany | S-11225 | excitation/emission maximum: 556/573nm |
| Anti-CD11b rat-anti-mouse antibody TC | Calteg, Burlingame, USA | R2b06 | |
| Purified anti-mouse F4/80 antibody | BioLegend, London, UK | 123102 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | D9542 | |
| FITC-conjugated anti-Ly6C rat-anti-mouse antibody | BD Pharmingen, Heidelberg, Germany | 553104 | |
| FACS buffer | BD Pharmingen, Heidelberg, Germany | 342003 | |
| Cy7 NHS Ester | GE Healthcare Europe, Freiburg, Germany | PA17104 | |
| MPO ELISA | Immundiagnostik AG, Bensheim, Germany | K 6631B | |
| Cy5.5 labeled anti-mouse F4/80 antibody | BioLegend, London, UK | 123127 | ready to use labelled Antibodies (alternative) |
| Anti-Mouse F4/80 Antigen PerCP-Cyanine5.5 | eBioscience, Waltham, USA | 45-4801-80 | ready to use labelled Antibodies (alternative) |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | 67-68-5 | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | 792632 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | 64-17-5 | |
| Bovine Serum Albumins (BSA) | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | A4612 | |
| Tris Buffered Saline Solution (TBS) | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | SRE0032 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| FACS Calibur Flow Cytometry System | BD Biosciences GmbH, Heidelberg, Germany | ||
| FMT 2000 In Vivo Imaging System | PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA | FMT2000 | |
| True Quant 3.1 Imaging Analysis Software | PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA | included in FMT2000 | |
| Leica DMLB Fluorescent Microscope | Leica, 35578 Wetzlar, Germany | DMLB | |
| Bandelin Sonopuls HD 2070 | Bandelin, 12207 Berlin, Germany | HD 2070 | ultrasonic homogenizer |
| Disposable scalpel No 10 | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | Z692395-10EA | |
| Metzenbaum scissors 14cm | Ehrhardt Medizinprodukte GmbH, Geislingen, Germany | 22398330 | |
| luer lock syringe 5ml | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | Z248010 | |
| syringe needles | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | Z192368 | |
| Falcon Tube 50ml | BD Biosciences, Erembodegem, Belgium | 352070 |
References
- Bruckner, M., et al. Murine endoscopy for in vivo multimodal imaging of carcinogenesis and assessment of intestinal wound healing and inflammation. J Vis Exp. (90), (2014).
- Lewis, J. S., Achilefu, S., Garbow, J. R., Laforest, R., Welch, M. J. Small animal imaging. current technology and perspectives for oncological imaging. Eur J Cancer. 38 (16), 2173-2188 (2002).
- Bettenworth, D., et al. Translational 18F-FDG PET/CT imaging to monitor lesion activity in intestinal inflammation. J Nucl Med. 54 (5), 748-755 (2013).
- Vowinkel, T., et al. Apolipoprotein A-IV inhibits experimental colitis. J Clin Invest. 114 (2), 260-269 (2004).
- Korlach, J., Schwille, P., Webb, W. W., Feigenson, G. W. Characterization of lipid bilayer phases by confocal microscopy and fluorescence correlation spectroscopy. Proc Natl Acad Sci USA. 96 (15), 8461-8466 (1999).
- Ntziachristos, V., Tung, C. H., Bremer, C., Weissleder, R. Fluorescence molecular tomography resolves protease activity in vivo. Nat Med. 8 (7), 757-760 (2002).
- Ntziachristos, V., Bremer, C., Weissleder, R. Fluorescence imaging with near-infrared light: new technological advances that enable in vivo molecular imaging. Eur Radiol. 13 (1), 195-208 (2003).
- Ntziachristos, V., Bremer, C., Graves, E. E., Ripoll, J., Weissleder, R. In vivo tomographic imaging of near-infrared fluorescent probes. Mol Imaging. 1 (2), 82-88 (2002).
- Ballou, B., et al. Tumor labeling in vivo using cyanine-conjugated monoclonal antibodies. Cancer Immunol Immunother. 41 (4), 257-263 (1995).
- Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nat Protoc. 2 (3), 541-546 (2007).
- Kawada, M., Arihiro, A., Mizoguchi, E. Insights from advances in research of chemically induced experimental models of human inflammatory bowel disease. World J Gastroenterol. 13 (42), 5581-5593 (2007).
- Nowacki, T. M., et al. The 5A apolipoprotein A-I (apoA-I) mimetic peptide ameliorates experimental colitis by regulating monocyte infiltration. Br J Pharmacol. 173 (18), 2780-2792 (2016).
- Hansch, A., et al. In vivo imaging of experimental arthritis with near-infrared fluorescence. Arthritis Rheum. 50 (3), 961-967 (2004).
- Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses. J Vis Exp. (113), (2016).
- Diaz-Granados, N., Howe, K., Lu, J., McKay, D. M. Dextran sulfate sodium-induced colonic histopathology, but not altered epithelial ion transport, is reduced by inhibition of phosphodiesterase activity. Am J Pathol. 156 (6), 2169-2177 (2000).
- Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. Investigating intestinal inflammation in DSS-induced model of IBD. J Vis Exp. (60), e3678 (2012).
- Dieleman, L. A., et al. Chronic experimental colitis induced by dextran sulphate sodium (DSS) is characterized by Th1 and Th2 cytokines. Clin Exp Immunol. 114 (3), 385-391 (1998).
- Kojouharoff, G., et al. Neutralization of tumour necrosis factor (TNF) but not of IL-1 reduces inflammation in chronic dextran sulphate sodium-induced colitis in mice. Clin Exp Immunol. 107 (2), 353-358 (1997).
- Sunderkotter, C., et al. Subpopulations of mouse blood monocytes differ in maturation stage and inflammatory response. J Immunol. 172 (7), 4410-4417 (2004).
- Willmann, J. K., van Bruggen, N., Dinkelborg, L. M., Gambhir, S. S. Molecular imaging in drug development. Nat Rev Drug Discov. 7 (7), 591-607 (2008).
- Ntziachristos, V., Ripoll, J., Wang, L. V., Weissleder, R. Looking and listening to light: the evolution of whole-body photonic imaging. Nat Biotechnol. 23 (3), 313-320 (2005).
- Ntziachristos, V. Going deeper than microscopy: the optical imaging frontier in biology. Nat Methods. 7 (8), 603-614 (2010).
- Stuker, F., Ripoll, J., Rudin, M. Fluorescence molecular tomography: principles and potential for pharmaceutical research. Pharmaceutics. 3 (2), 229-274 (2011).
- Beziere, N., Ntziachristos, V. Optoacoustic imaging: an emerging modality for the gastrointestinal tract. Gastroenterology. 141 (6), 1979-1985 (2011).
- Habtezion, A., Nguyen, L. P., Hadeiba, H., Butcher, E. C. Leukocyte Trafficking to the Small Intestine and Colon. Gastroenterology. 150 (2), 340-354 (2016).
- Ungar, B., Kopylov, U. Advances in the development of new biologics in inflammatory bowel disease. Ann Gastroenterol. 29 (3), 243-248 (2016).
- Sandborn, W. J., et al. Vedolizumab as induction and maintenance therapy for Crohn’s disease. N Engl J Med. 369 (8), 711-721 (2013).
- Vermeire, S., et al. Etrolizumab as induction therapy for ulcerative colitis: a randomised, controlled, phase 2 trial. Lancet. 384 (9940), 309-318 (2014).
- Coskun, M., Vermeire, S., Nielsen, O. H. Novel Targeted Therapies for Inflammatory Bowel Disease. Trends Pharmacol Sci. , (2016).
- Vermeire, S., et al. The mucosal addressin cell adhesion molecule antibody PF-00547,659 in ulcerative colitis: a randomised study. Gut. 60 (8), 1068-1075 (2011).
- Terai, T., Nagano, T. Small-molecule fluorophores and fluorescent probes for bioimaging. Pflugers Arch. 465 (3), 347-359 (2013).
- Ren, W., et al. Dynamic Measurement of Tumor Vascular Permeability and Perfusion using a Hybrid System for Simultaneous Magnetic Resonance and Fluorescence Imaging. Mol Imaging Biol. 18 (2), 191-200 (2016).
- Ale, A., Ermolayev, V., Deliolanis, N. C., Ntziachristos, V. Fluorescence background subtraction technique for hybrid fluorescence molecular tomography/x-ray computed tomography imaging of a mouse model of early stage lung cancer. J Biomed Opt. 18 (5), 56006 (2013).
- Chames, P., Van Regenmortel, M., Weiss, E., Baty, D. Therapeutic antibodies: successes, limitations and hopes for the future. Br J Pharmacol. 157 (2), 220-233 (2009).
- Faust, A., Hermann, S., Schafers, M., Holtke, C. Optical imaging probes and their potential contribution to radiotracer development. Nuklearmedizin. 55 (2), 51-62 (2016).
- Mahler, M., et al. Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis. Am J Physiol. 274 (3 Pt 1), G544-G551 (1998).
