Флуоресценции опосредованной томография для выявления и количественной оценки мышиных кишечного воспаления Макрофаг связанных
Summary
Целевой объект специфического датчики представляют инновационный инструмент для анализа молекулярные механизмы, такие как выражение протеина в различных типах болезни (например, воспаление, инфекция и опухолей). В этом исследовании мы описывают количественную оценку трехмерной томографических кишечных макрофагов инфильтрации в мышиных модель колита с использованием конкретного/80-F4 флуоресценции опосредованной томография.
Abstract
Мышиных моделях заболеваний необходимы для научных исследований. Однако многие средства диагностики эндоскопия или томографических изображений не используются регулярно в животных моделях. Обычные экспериментальной отсчетов часто полагаются на посмертное и ex vivo анализов, которые препятствуют внутри отдельных последующих экзаменов и увеличить количество животных исследования необходимы. Флуоресценции опосредованной томография позволяет неинвазивные, повторяющихся, трехмерные и количественные оценки флуоресцентных зондов. Она очень чувствительна и разрешает использование молекулярных органов, которая позволяет для обнаружения конкретных и характеристик различных молекулярных целей. В частности целевые датчики представляют инновационный инструмент для анализа экспрессии генов активации и белков в воспаление, аутоиммунные заболевания, инфекции, заболевания сосудов, миграции клеток, tumorigenesis, и т.д. В этой статье мы предоставляем пошаговые инструкции на этой сложной визуализации технологии для обнаружения в естественных условиях и характеристика воспаления (т.е., F4/80-позитивных макрофагов инфильтрации) в широко используемых мышиных модели кишечные воспаления. Этот метод может также использоваться в других областях исследований, как иммунные клетки или стволовых клеток отслеживания.
Introduction
Животные модели широко используются в научных исследованиях, и многие неинвазивные процедуры существуют для монитора активности заболевания и жизнеспособность, таких как количественная оценка изменения веса тела или анализ крови, мочи и Кала. Однако это только косвенные замещающих параметров, которые также подлежат межличностная изменчивость. Они часто должны дополняться посмертное анализ образца ткани, которая предотвращает последовательного наблюдения на время повторяющихся точек и прямых наблюдений физиологических и патологических процессов в естественных условиях. Появились сложные методы визуализации малых животных, в том числе кросс-секционные изображений, оптических изображений и эндоскопия, который позволяет прямой визуализации этих процессов, а также позволяет для повторных анализов же животных1 , 2 , 3. Кроме того, возможность многократного контролировать различные состояния болезни в то же самое животное может уменьшить количество животных необходимо, которые могли бы быть желательным с точки зрения животных этики.
Несколько различных оптических изображений методы существуют в vivo флуоресценции изображений. Первоначально конфокальная томография использовалась для изучения поверхностных и подповерхностных флуоресцентные события4,5. Недавно однако, томографические системы, которые позволяют для оценки количественных трехмерные ткани были развитые6. Это было достигнуто путем разработки флуоресцентных зондов, которые излучают свет в ближней ИК-области спектра (NIR), предлагая низкой абсорбцией, чувствительных детекторов и монохроматического света источников7. Хотя традиционные срезов тепловизионные методы такие как компьютерная томография (КТ), магнитно-резонансная томография (МРТ) или УЗИ (США), полагаться главным образом на физических параметров и визуализации морфологии, оптических изображений могут предоставить дополнительную информацию на базовом молекулярных процессов с использованием эндогенного или экзогенного флуоресцентных зондов8.
Достижения в области молекулярной биологии помогли облегчить поколения интеллектуальных и целенаправленных флуоресцентных зондов молекулярные для все большего числа целей. К примеру рецептор опосредованный поглощения и распределения в области заданного целевого объекта могут быть визуализированы с помощью карбоцианиновыми антител, меченных производная9. Обилие доступных антител, которые могут быть помечены в качестве конкретных индикаторов в недоступные участки тела, обеспечивает беспрецедентные понимание молекулярных и клеточных процессов в моделях tumorigenesis и нейродегенеративные, сердечно-сосудистые, иммунологические и воспалительных заболеваний7.
В этом исследовании мы описывают использование флюоресценции опосредованной томография в мышиных модель колита. Декстран сульфат натрия (DSS)-индуцированного колит это стандартная модель химически индуцированных мыши кишечного воспаления, что напоминает воспалительное заболевание кишечника болезнь (IBD)10. Это особенно полезно оценить вклад иммунной системы до развития воспаления кишечника11. Поскольку набор, активации и проникновение моноцитов и макрофагов представляют собой важнейшие шаги в патогенезе IBD, Визуализация их найма и кинетика инфильтрации имеют важное значение для мониторинга, например, эффект потенциал лечебных веществ в доклинических параметр12. Мы опишем индукции DSS колит и продемонстрировать томография опосредованной характеристика макрофагов инфильтрации в слизистую оболочку кишки с помощью молекулярных томография флуоресценции для конкретных визуализации моноцитов/макрофагов маркера F4/80 13. Кроме того, мы показываем вспомогательные и дополнительные процедуры, такие как антитела маркировки; экспериментальная установка; и анализа и интерпретации полученных изображений, в корреляции с обычными отсчетов такие индексы активности болезни, поток цитометрии и гистологический анализ и иммуногистохимии. Мы обсуждаем ограничения этой техники и сравнения с другими визуализации формы.
Protocol
Representative Results
Discussion
Хотя медицинские методы визуализации быстро эволюционировали в последние годы, мы по-прежнему ограничены в нашу способность обнаруживать воспалительных процессов или опухоли, а также других заболеваний на ранних стадиях развития. Однако это имеет решающее значение для понимания опу?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим г-жа Соня Dufentester, г-жа Elke Вебер и миссис Klaudia Niepagenkämper за отличную техническую помощь.
Materials
| Reagents | |||
| Alfalfa-free diet | Harlan Laboritories, Madison, USA | 2014 | |
| Bepanthen eye ointment | Bayer, Leverkusen, Germany | 80469764 | |
| Dextran sulphate sodium (DSS) | TdB Consulatancy, Uppsala, Sweden | DB001 | |
| Eosin | Sigma – Aldrich, Deisenhofen, Germany | E 4382 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma – Aldrich, Deisenhofen, Germany | E 9884 | |
| Florene 100V/V | Abbott, Wiesbaden, Germany | B506 | |
| Haematoxylin | Sigma – Aldrich, Deisenhofen, Germany | HHS32-1L | |
| O.C.T. Tissue Tek compound | Sakura, Zoeterwonde, Netherlands | 4583 | fixative for histological analyses |
| Phosphate buffered saline, PBS | Lonza, Verviers, Belgium | 4629 | |
| Sodium Chloride 0,9% | Braun, Melsungen, Germany | 5/12211095/0411 | |
| Sodium bicarbonate powder | Sigma Aldrich Deisenhofen, Germany | S5761 | |
| Standard diet | Altromin, Lage, Germany | 1320 | |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura, Leiden, Netherlands | 4566 | |
| Hemoccult (guaiac paper test) | Beckmann Coulter, Germany | 3060 | |
| Biotin rat-anti-mouse anti-F4/80 antibody | Serotec, Oxford, UK | MCA497B | |
| Biotin rat-anti-mouse anti-GR-1 | BD Pharmingen, Heidelberg Germany | 553125 | |
| Streptavidin-Alexa546 | Molecular Probes, Darmstadt, Germany | S-11225 | excitation/emission maximum: 556/573nm |
| Anti-CD11b rat-anti-mouse antibody TC | Calteg, Burlingame, USA | R2b06 | |
| Purified anti-mouse F4/80 antibody | BioLegend, London, UK | 123102 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | D9542 | |
| FITC-conjugated anti-Ly6C rat-anti-mouse antibody | BD Pharmingen, Heidelberg, Germany | 553104 | |
| FACS buffer | BD Pharmingen, Heidelberg, Germany | 342003 | |
| Cy7 NHS Ester | GE Healthcare Europe, Freiburg, Germany | PA17104 | |
| MPO ELISA | Immundiagnostik AG, Bensheim, Germany | K 6631B | |
| Cy5.5 labeled anti-mouse F4/80 antibody | BioLegend, London, UK | 123127 | ready to use labelled Antibodies (alternative) |
| Anti-Mouse F4/80 Antigen PerCP-Cyanine5.5 | eBioscience, Waltham, USA | 45-4801-80 | ready to use labelled Antibodies (alternative) |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | 67-68-5 | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | 792632 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | 64-17-5 | |
| Bovine Serum Albumins (BSA) | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | A4612 | |
| Tris Buffered Saline Solution (TBS) | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | SRE0032 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| FACS Calibur Flow Cytometry System | BD Biosciences GmbH, Heidelberg, Germany | ||
| FMT 2000 In Vivo Imaging System | PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA | FMT2000 | |
| True Quant 3.1 Imaging Analysis Software | PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA | included in FMT2000 | |
| Leica DMLB Fluorescent Microscope | Leica, 35578 Wetzlar, Germany | DMLB | |
| Bandelin Sonopuls HD 2070 | Bandelin, 12207 Berlin, Germany | HD 2070 | ultrasonic homogenizer |
| Disposable scalpel No 10 | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | Z692395-10EA | |
| Metzenbaum scissors 14cm | Ehrhardt Medizinprodukte GmbH, Geislingen, Germany | 22398330 | |
| luer lock syringe 5ml | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | Z248010 | |
| syringe needles | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | Z192368 | |
| Falcon Tube 50ml | BD Biosciences, Erembodegem, Belgium | 352070 |
References
- Bruckner, M., et al. Murine endoscopy for in vivo multimodal imaging of carcinogenesis and assessment of intestinal wound healing and inflammation. J Vis Exp. (90), (2014).
- Lewis, J. S., Achilefu, S., Garbow, J. R., Laforest, R., Welch, M. J. Small animal imaging. current technology and perspectives for oncological imaging. Eur J Cancer. 38 (16), 2173-2188 (2002).
- Bettenworth, D., et al. Translational 18F-FDG PET/CT imaging to monitor lesion activity in intestinal inflammation. J Nucl Med. 54 (5), 748-755 (2013).
- Vowinkel, T., et al. Apolipoprotein A-IV inhibits experimental colitis. J Clin Invest. 114 (2), 260-269 (2004).
- Korlach, J., Schwille, P., Webb, W. W., Feigenson, G. W. Characterization of lipid bilayer phases by confocal microscopy and fluorescence correlation spectroscopy. Proc Natl Acad Sci USA. 96 (15), 8461-8466 (1999).
- Ntziachristos, V., Tung, C. H., Bremer, C., Weissleder, R. Fluorescence molecular tomography resolves protease activity in vivo. Nat Med. 8 (7), 757-760 (2002).
- Ntziachristos, V., Bremer, C., Weissleder, R. Fluorescence imaging with near-infrared light: new technological advances that enable in vivo molecular imaging. Eur Radiol. 13 (1), 195-208 (2003).
- Ntziachristos, V., Bremer, C., Graves, E. E., Ripoll, J., Weissleder, R. In vivo tomographic imaging of near-infrared fluorescent probes. Mol Imaging. 1 (2), 82-88 (2002).
- Ballou, B., et al. Tumor labeling in vivo using cyanine-conjugated monoclonal antibodies. Cancer Immunol Immunother. 41 (4), 257-263 (1995).
- Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nat Protoc. 2 (3), 541-546 (2007).
- Kawada, M., Arihiro, A., Mizoguchi, E. Insights from advances in research of chemically induced experimental models of human inflammatory bowel disease. World J Gastroenterol. 13 (42), 5581-5593 (2007).
- Nowacki, T. M., et al. The 5A apolipoprotein A-I (apoA-I) mimetic peptide ameliorates experimental colitis by regulating monocyte infiltration. Br J Pharmacol. 173 (18), 2780-2792 (2016).
- Hansch, A., et al. In vivo imaging of experimental arthritis with near-infrared fluorescence. Arthritis Rheum. 50 (3), 961-967 (2004).
- Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses. J Vis Exp. (113), (2016).
- Diaz-Granados, N., Howe, K., Lu, J., McKay, D. M. Dextran sulfate sodium-induced colonic histopathology, but not altered epithelial ion transport, is reduced by inhibition of phosphodiesterase activity. Am J Pathol. 156 (6), 2169-2177 (2000).
- Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. Investigating intestinal inflammation in DSS-induced model of IBD. J Vis Exp. (60), e3678 (2012).
- Dieleman, L. A., et al. Chronic experimental colitis induced by dextran sulphate sodium (DSS) is characterized by Th1 and Th2 cytokines. Clin Exp Immunol. 114 (3), 385-391 (1998).
- Kojouharoff, G., et al. Neutralization of tumour necrosis factor (TNF) but not of IL-1 reduces inflammation in chronic dextran sulphate sodium-induced colitis in mice. Clin Exp Immunol. 107 (2), 353-358 (1997).
- Sunderkotter, C., et al. Subpopulations of mouse blood monocytes differ in maturation stage and inflammatory response. J Immunol. 172 (7), 4410-4417 (2004).
- Willmann, J. K., van Bruggen, N., Dinkelborg, L. M., Gambhir, S. S. Molecular imaging in drug development. Nat Rev Drug Discov. 7 (7), 591-607 (2008).
- Ntziachristos, V., Ripoll, J., Wang, L. V., Weissleder, R. Looking and listening to light: the evolution of whole-body photonic imaging. Nat Biotechnol. 23 (3), 313-320 (2005).
- Ntziachristos, V. Going deeper than microscopy: the optical imaging frontier in biology. Nat Methods. 7 (8), 603-614 (2010).
- Stuker, F., Ripoll, J., Rudin, M. Fluorescence molecular tomography: principles and potential for pharmaceutical research. Pharmaceutics. 3 (2), 229-274 (2011).
- Beziere, N., Ntziachristos, V. Optoacoustic imaging: an emerging modality for the gastrointestinal tract. Gastroenterology. 141 (6), 1979-1985 (2011).
- Habtezion, A., Nguyen, L. P., Hadeiba, H., Butcher, E. C. Leukocyte Trafficking to the Small Intestine and Colon. Gastroenterology. 150 (2), 340-354 (2016).
- Ungar, B., Kopylov, U. Advances in the development of new biologics in inflammatory bowel disease. Ann Gastroenterol. 29 (3), 243-248 (2016).
- Sandborn, W. J., et al. Vedolizumab as induction and maintenance therapy for Crohn’s disease. N Engl J Med. 369 (8), 711-721 (2013).
- Vermeire, S., et al. Etrolizumab as induction therapy for ulcerative colitis: a randomised, controlled, phase 2 trial. Lancet. 384 (9940), 309-318 (2014).
- Coskun, M., Vermeire, S., Nielsen, O. H. Novel Targeted Therapies for Inflammatory Bowel Disease. Trends Pharmacol Sci. , (2016).
- Vermeire, S., et al. The mucosal addressin cell adhesion molecule antibody PF-00547,659 in ulcerative colitis: a randomised study. Gut. 60 (8), 1068-1075 (2011).
- Terai, T., Nagano, T. Small-molecule fluorophores and fluorescent probes for bioimaging. Pflugers Arch. 465 (3), 347-359 (2013).
- Ren, W., et al. Dynamic Measurement of Tumor Vascular Permeability and Perfusion using a Hybrid System for Simultaneous Magnetic Resonance and Fluorescence Imaging. Mol Imaging Biol. 18 (2), 191-200 (2016).
- Ale, A., Ermolayev, V., Deliolanis, N. C., Ntziachristos, V. Fluorescence background subtraction technique for hybrid fluorescence molecular tomography/x-ray computed tomography imaging of a mouse model of early stage lung cancer. J Biomed Opt. 18 (5), 56006 (2013).
- Chames, P., Van Regenmortel, M., Weiss, E., Baty, D. Therapeutic antibodies: successes, limitations and hopes for the future. Br J Pharmacol. 157 (2), 220-233 (2009).
- Faust, A., Hermann, S., Schafers, M., Holtke, C. Optical imaging probes and their potential contribution to radiotracer development. Nuklearmedizin. 55 (2), 51-62 (2016).
- Mahler, M., et al. Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis. Am J Physiol. 274 (3 Pt 1), G544-G551 (1998).
