Tomografia computadorizada mediada por fluorescência para a detecção e quantificação de inflamação Intestinal murino macrófago-relacionados
Summary
Sondas de destino-específicos representam uma ferramenta inovadora para a análise de mecanismos moleculares, tais como a expressão da proteína em vários tipos de doença (por exemplo, inflamação, infecção e tumorigênese). Neste estudo, descrevemos uma avaliação tomográfica tridimensional quantitativa da infiltração de macrófagos intestinal em um modelo murino de colite usando tomografia computadorizada mediada por fluorescência de F4/80-específicos.
Abstract
Murino modelos da doença são indispensáveis para a investigação científica. No entanto, muitas ferramentas de diagnóstico como endoscopia ou imagem latente tomográfica não são rotineiramente empregadas em modelos animais. Leituras de experimentais convencionais muitas vezes dependem de análises post-mortem e ex vivo , que evitar exames de acompanhamento intra individuais e aumentam o número de animais de estudo necessário. Tomografia computadorizada mediada por fluorescência permite a avaliação não-invasiva, repetitiva, quantitativa, tridimensional de sondas fluorescentes. É altamente sensível e permite o uso de fabricantes moleculares, que permite a detecção específica e caracterização de alvos moleculares distintas. Em particular, sondas específicas representam uma ferramenta inovadora para a análise de expressão gênica de ativação e proteína na inflamação, doença auto-imune, infecção, doença vascular, migração celular, tumorigênese, etc. Neste artigo, nós fornecemos instruções passo a passo sobre essa tecnologia de imagem sofisticada para na vivo detecção e caracterização de inflamação (i.e., infiltração de macrófagos F4/80-positivo) em um modelo murino amplamente utilizado de inflamação intestinal. Esta técnica também pode ser usada em outras áreas de pesquisa, como o acompanhamento imune de célula ou células-tronco.
Introduction
Modelos animais são amplamente utilizados em investigação científica, e muitos procedimentos invasivos existem a atividade da doença de monitor e vitalidade, como a quantificação de alterações de peso do corpo ou a análise de sangue, urina e fezes. No entanto, estes são apenas os parâmetros indiretos substituto que também estão sujeitas a variabilidade inter-individual. Eles frequentemente devem ser complementados por análises post-mortem de amostra de tecido, que impede a observação serial em pontos de tempo repetitivo e direcionar a observação dos fisiológicos ou patológicos processa em vivo. Sofisticadas técnicas de imagem pequeno-animal surgiram, incluindo Cruz secional de imagem, imagem óptica e endoscopia, que permite a visualização directa destes processos e também permite análises repetitivas do mesmo animais1 , 2 , 3. Além disso, a possibilidade de monitorizar repetidamente vários Estados de doença no mesmo animal pode diminuir o número de animais necessários, que podem ser desejáveis do ponto de vista ética animal.
Várias técnicas de imagem ópticas diferentes existem para imagens de fluorescência na vivo . Originalmente, a imagem latente confocal foi empregado para estudar a superfície e subsuperfície eventos fluorescente4,5. Recentemente, entretanto, tomográficos sistemas que permitem avaliações quantitativas de tecido tridimensional foram desenvolvidos6. Isso foi feito através do desenvolvimento de sondas fluorescentes que emitem luz no espectro infravermelho próximo (NIR), oferecendo baixa absorção, detectores sensíveis e fontes de luz monocromática7. Enquanto técnicas de imagem cross-sectioning tradicionais, tais como a tomografia computadorizada (CT), ressonância magnética (MRI) ou ultra-som (US), dependem principalmente de parâmetros físicos e visualizar a morfologia, imagem latente ótica pode fornecer informações adicionais em processos moleculares subjacentes usar fluorescente endógena ou exógena sondas8.
Avanços na biologia molecular têm contribuído para facilitar a geração de inteligentes e alvo fluorescentes sondas moleculares para um número crescente de destinos. Por exemplo, absorção mediada e distribuição em uma área-alvo determinado podem ser visualizadas usando carbocyanine derivado-etiquetado anticorpos9. A abundância de anticorpos disponíveis, que podem ser rotulados para funcionar como marcadores específicos em áreas inacessíveis do corpo, fornece insights sem precedentes nos processos moleculares e celulares em modelos de tumorigênese e neurodegenerativas, doenças cardiovasculares, imunológicas e inflamatórias7.
Neste estudo, descrevemos o uso de tomografia computadorizada mediada por fluorescência em um modelo murino de colite. Sulfato de dextrano de sódio (DSS)-colite induzida é um modelo padrão de rato quimicamente induzida de inflamação intestinal que se assemelha a inflamatória intestinal (IBD) de doença10. É particularmente útil avaliar a contribuição do sistema imunológico inato para o desenvolvimento do intestino inflamação11. Desde o recrutamento, ativação e infiltração de monócitos e macrófagos representam passos cruciais na patogênese da IBD, visualização de seu recrutamento e cinética de infiltração são essenciais para o monitoramento, por exemplo, o efeito de potenciais substâncias terapêuticas em uma configuração pré-clínicos12. Descrevemos a indução de colite DSS e demonstrar a caracterização mediada por tomografia computadorizada da infiltração de macrófagos da mucosa do intestino utilizando tomografia computadorizada molecular de fluorescência para a visualização específica do marcador de monócitos/macrófagos F4/80 13. Além disso, podemos ilustrar procedimentos auxiliares e complementares, tais como anticorpos rotulagem; a instalação experimental; e análise e interpretação das imagens obtidas, em correlação com as leituras convencionais, tais como índices de atividade de doença, fluem cytometry e análise histológica e imunohistoquímica. Podemos discutir as limitações desta técnica e comparações com outras modalidades de imagem.
Protocol
Representative Results
Discussion
Apesar de técnicas de imagem médicas têm evoluído rapidamente nos últimos anos, nós ainda somos limitados em nossa capacidade de detectar processos inflamatórios ou tumores, bem como outras doenças, em seus primeiros estágios de desenvolvimento. No entanto, isso é crucial para o crescimento do tumor de compreensão, invasão, ou desenvolvimento de metástases e processos celulares no desenvolvimento de doenças inflamatórias e doenças degenerativas, cardiovasculares e imunológicas. Enquanto as técnicas trad…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Sra. Sonja Dufentester, Sra. Elke Weber e Sra. Klaudia Niepagenkämper pela excelente assistência técnica.
Materials
| Reagents | |||
| Alfalfa-free diet | Harlan Laboritories, Madison, USA | 2014 | |
| Bepanthen eye ointment | Bayer, Leverkusen, Germany | 80469764 | |
| Dextran sulphate sodium (DSS) | TdB Consulatancy, Uppsala, Sweden | DB001 | |
| Eosin | Sigma – Aldrich, Deisenhofen, Germany | E 4382 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma – Aldrich, Deisenhofen, Germany | E 9884 | |
| Florene 100V/V | Abbott, Wiesbaden, Germany | B506 | |
| Haematoxylin | Sigma – Aldrich, Deisenhofen, Germany | HHS32-1L | |
| O.C.T. Tissue Tek compound | Sakura, Zoeterwonde, Netherlands | 4583 | fixative for histological analyses |
| Phosphate buffered saline, PBS | Lonza, Verviers, Belgium | 4629 | |
| Sodium Chloride 0,9% | Braun, Melsungen, Germany | 5/12211095/0411 | |
| Sodium bicarbonate powder | Sigma Aldrich Deisenhofen, Germany | S5761 | |
| Standard diet | Altromin, Lage, Germany | 1320 | |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura, Leiden, Netherlands | 4566 | |
| Hemoccult (guaiac paper test) | Beckmann Coulter, Germany | 3060 | |
| Biotin rat-anti-mouse anti-F4/80 antibody | Serotec, Oxford, UK | MCA497B | |
| Biotin rat-anti-mouse anti-GR-1 | BD Pharmingen, Heidelberg Germany | 553125 | |
| Streptavidin-Alexa546 | Molecular Probes, Darmstadt, Germany | S-11225 | excitation/emission maximum: 556/573nm |
| Anti-CD11b rat-anti-mouse antibody TC | Calteg, Burlingame, USA | R2b06 | |
| Purified anti-mouse F4/80 antibody | BioLegend, London, UK | 123102 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | D9542 | |
| FITC-conjugated anti-Ly6C rat-anti-mouse antibody | BD Pharmingen, Heidelberg, Germany | 553104 | |
| FACS buffer | BD Pharmingen, Heidelberg, Germany | 342003 | |
| Cy7 NHS Ester | GE Healthcare Europe, Freiburg, Germany | PA17104 | |
| MPO ELISA | Immundiagnostik AG, Bensheim, Germany | K 6631B | |
| Cy5.5 labeled anti-mouse F4/80 antibody | BioLegend, London, UK | 123127 | ready to use labelled Antibodies (alternative) |
| Anti-Mouse F4/80 Antigen PerCP-Cyanine5.5 | eBioscience, Waltham, USA | 45-4801-80 | ready to use labelled Antibodies (alternative) |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | 67-68-5 | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | 792632 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | 64-17-5 | |
| Bovine Serum Albumins (BSA) | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | A4612 | |
| Tris Buffered Saline Solution (TBS) | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | SRE0032 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| FACS Calibur Flow Cytometry System | BD Biosciences GmbH, Heidelberg, Germany | ||
| FMT 2000 In Vivo Imaging System | PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA | FMT2000 | |
| True Quant 3.1 Imaging Analysis Software | PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA | included in FMT2000 | |
| Leica DMLB Fluorescent Microscope | Leica, 35578 Wetzlar, Germany | DMLB | |
| Bandelin Sonopuls HD 2070 | Bandelin, 12207 Berlin, Germany | HD 2070 | ultrasonic homogenizer |
| Disposable scalpel No 10 | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | Z692395-10EA | |
| Metzenbaum scissors 14cm | Ehrhardt Medizinprodukte GmbH, Geislingen, Germany | 22398330 | |
| luer lock syringe 5ml | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | Z248010 | |
| syringe needles | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | Z192368 | |
| Falcon Tube 50ml | BD Biosciences, Erembodegem, Belgium | 352070 |
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