検出とマクロファージによるマウス腸管炎症の定量化のための蛍光を介したトモグラフィー
Summary
ターゲット特定プローブなど各種疾患 (例えば炎症、感染、腫瘍) におけるタンパク質発現の分子機構を解析するための革新的なツールを表します。本研究では F4/80 固有蛍光を介したトモグラフィによる大腸炎のマウスモデルにおける腸管マクロファージ浸潤の定量的三次元断層評価について述べる。
Abstract
病気のマウスモデルが科学的な研究に不可欠であります。しかし、内視鏡や断層イメージングなど多くの診断ツールは、動物モデルで日常的には採用されません。従来実験的読み出しは、しばしば事後と前のヴィヴォ分析、個人内のフォロー アップ検査を防止し、必要な研究の動物の数を増やすに依存します。蛍光を介したトモグラフィーできます蛍光プローブの非侵襲的、反復的、定量的な三次元評価です。非常に敏感であり、特異的検出と異なる分子標的の特性評価を可能にする分子のメーカーの使用を許可します。特に、ターゲット プローブは、炎症、自己免疫疾患、感染症、血管疾患、細胞遊走、腫瘍などで遺伝子の活性化および蛋白質の表現の分析のための革新的なツールを表します。この記事で私たちは体内検出と (すなわちF4/80 陽性マクロファージ浸潤) の広く使用されているマウス モデルにおける炎症の評価のこの高度なイメージング技術のステップバイ ステップの手順を提供します。腸の炎症。この手法は免疫細胞と幹細胞の追跡など、他の研究分野でもされる可能性があります。
Introduction
動物モデルは、科学的な研究で広く使用されて、多くの非侵襲的な手順が存在するモニターの疾患活動性と活力を体重の増減の定量化や血液、尿、糞便の分析など。ただし、これらは個体間変動予告も間接代理パラメーターのみです。彼らはよく反復的な時点でシリアルの観察を防ぐ組織標本の事後分析によって補完する必要があります、生理や病理組織学的観察を処理で体内を直接します。断面イメージング、光学イメージング、および内視鏡検査は、これらのプロセスの直接可視化を実現し、同じ動物1の反復的な解析ができますクロスを含む高度な小動物イメージング技術が浮上しています。,2,3。 さらに、繰り返し同じ動物の疾患のさまざまな状態を監視する可能性、必要な動物の倫理の観点から望ましいと考えられる動物の数を減らします。
生体内蛍光イメージングのためにいくつか別の光イメージング技術が存在します。もともと、共焦点レーザー顕微鏡を用いて地表および地下の蛍光イベント4,5を研究します。最近では、ただし、三次元組織の定量的評価を可能にする断層システム先進6をされています。これが単色光源7検波器、低吸収を提供する近赤外線 (NIR) スペクトルで発光する蛍光プローブの開発によって達成されました。伝統的な断面解析イメージングしながらコンピューター断層撮影 (CT) や磁気共鳴画像 (MRI)、超音波 (米国)、ほとんど物理的なパラメーターに依存して、形態を視覚化するなど光イメージングすることができます追加情報を提供します。基になる分子プロセスに内因性あるいは外因性蛍光プローブ8をの。
分子生物学の進歩は、ターゲットの増加する数のスマートかつターゲットを絞った蛍光分子プローブの生成を促進に貢献しています。たとえば、受容体を介した取り込みと特定のターゲット領域における分布視覚化できます carbocyanine 誘導体標識抗体9を使用しています。体のそうでなければアクセスできない領域に特定のトレーサーとして機能するラベル付けできますが、利用可能な抗体の豊富な腫瘍と神経変性のモデル分子・細胞のプロセスに前例のない洞察を提供します。心血管系、免疫学的、および炎症性疾患7。
本研究では大腸炎のマウスモデルにおける蛍光を介したトモグラフィの使用をについて説明します。デキストラン硫酸ナトリウム (DSS)-誘導大腸炎、炎症性腸疾患 (IBD)10のような腸の炎症の標準化学物質誘発マウス モデル。腸炎症11の開発に生来の免疫システムの貢献を評価するために特に便利です。採用、アクティブ化、および単球やマクロファージの浸潤は、IBD の病因の重要なステップを表す、採用の可視化や浸潤の動態が、たとえばの効果をモニターします。12の臨床設定で、潜在的な治療剤。我々 は DSS 大腸炎の誘導をについて説明し、単球/マクロファージ マーカー F4/80 の具体的な可視化の蛍光分子トモグラフィーを用いた消化管粘膜へのマクロファージ浸潤の断層撮影による評価を示します13さらに、抗体はラベリング; などの補助および補足的な手順を示す。実験のセットアップ;疾患活動指標など従来の読み出しとの相関関係で、得られた画像の分析と解釈流れ cytometry と組織学的解析および免疫組織化学。我々 は、この手法との比較その他の画像診断装置の制限をについて説明します。
Protocol
すべての動物実験は、Landesamt für Natur、ドイツ動物保護法 (Tierschutzgesetz) によると環 und Verbraucherschutz (LANUV) ノルトライン ・ ヴェストファーレン州によって承認されました。 1. 材料と実験のセットアップ 動物の世話。 20-25 g の体重で (例えばC57BL/6) に任意の DSS 感受性系統の性別と年齢をマッチさせたマウスを使用します。 ロ…
Representative Results
大腸炎の評価: DSS 誘発大腸炎は人間の IBD に似ており、減量、直腸出血、表面的な潰瘍、感受性のあるマウス15粘膜損傷につながる腸管炎症の化学物質誘発マウス モデルです。特に自然免疫炎症性腸10,11の開発の貢献の研究に有用です。合併の炎症?…
Discussion
医療イメージング技術は、近年急速に進化してきたが我々 はまだ開発のごく初期の段階で炎症性プロセスまたは他の病気と同様、腫瘍を検出する当社の能力に制限されます。ただし、これは理解腫瘍の成長、侵略、または転移開発および炎症性疾患と変性、心血管及び免疫疾患の開発の細胞プロセスに重要です。伝統的なイメージング技術は、身体的または生理学的なパラメーターに依存し…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
優れたテクニカル サポート、さんソニア Dufentester、さんエルケ ・ ウェーバーと夫人クローディア Niepagenkämper に感謝します。
Materials
| Reagents | |||
| Alfalfa-free diet | Harlan Laboritories, Madison, USA | 2014 | |
| Bepanthen eye ointment | Bayer, Leverkusen, Germany | 80469764 | |
| Dextran sulphate sodium (DSS) | TdB Consulatancy, Uppsala, Sweden | DB001 | |
| Eosin | Sigma – Aldrich, Deisenhofen, Germany | E 4382 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma – Aldrich, Deisenhofen, Germany | E 9884 | |
| Florene 100V/V | Abbott, Wiesbaden, Germany | B506 | |
| Haematoxylin | Sigma – Aldrich, Deisenhofen, Germany | HHS32-1L | |
| O.C.T. Tissue Tek compound | Sakura, Zoeterwonde, Netherlands | 4583 | fixative for histological analyses |
| Phosphate buffered saline, PBS | Lonza, Verviers, Belgium | 4629 | |
| Sodium Chloride 0,9% | Braun, Melsungen, Germany | 5/12211095/0411 | |
| Sodium bicarbonate powder | Sigma Aldrich Deisenhofen, Germany | S5761 | |
| Standard diet | Altromin, Lage, Germany | 1320 | |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura, Leiden, Netherlands | 4566 | |
| Hemoccult (guaiac paper test) | Beckmann Coulter, Germany | 3060 | |
| Biotin rat-anti-mouse anti-F4/80 antibody | Serotec, Oxford, UK | MCA497B | |
| Biotin rat-anti-mouse anti-GR-1 | BD Pharmingen, Heidelberg Germany | 553125 | |
| Streptavidin-Alexa546 | Molecular Probes, Darmstadt, Germany | S-11225 | excitation/emission maximum: 556/573nm |
| Anti-CD11b rat-anti-mouse antibody TC | Calteg, Burlingame, USA | R2b06 | |
| Purified anti-mouse F4/80 antibody | BioLegend, London, UK | 123102 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | D9542 | |
| FITC-conjugated anti-Ly6C rat-anti-mouse antibody | BD Pharmingen, Heidelberg, Germany | 553104 | |
| FACS buffer | BD Pharmingen, Heidelberg, Germany | 342003 | |
| Cy7 NHS Ester | GE Healthcare Europe, Freiburg, Germany | PA17104 | |
| MPO ELISA | Immundiagnostik AG, Bensheim, Germany | K 6631B | |
| Cy5.5 labeled anti-mouse F4/80 antibody | BioLegend, London, UK | 123127 | ready to use labelled Antibodies (alternative) |
| Anti-Mouse F4/80 Antigen PerCP-Cyanine5.5 | eBioscience, Waltham, USA | 45-4801-80 | ready to use labelled Antibodies (alternative) |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | 67-68-5 | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | 792632 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | 64-17-5 | |
| Bovine Serum Albumins (BSA) | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | A4612 | |
| Tris Buffered Saline Solution (TBS) | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | SRE0032 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| FACS Calibur Flow Cytometry System | BD Biosciences GmbH, Heidelberg, Germany | ||
| FMT 2000 In Vivo Imaging System | PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA | FMT2000 | |
| True Quant 3.1 Imaging Analysis Software | PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA | included in FMT2000 | |
| Leica DMLB Fluorescent Microscope | Leica, 35578 Wetzlar, Germany | DMLB | |
| Bandelin Sonopuls HD 2070 | Bandelin, 12207 Berlin, Germany | HD 2070 | ultrasonic homogenizer |
| Disposable scalpel No 10 | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | Z692395-10EA | |
| Metzenbaum scissors 14cm | Ehrhardt Medizinprodukte GmbH, Geislingen, Germany | 22398330 | |
| luer lock syringe 5ml | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | Z248010 | |
| syringe needles | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | Z192368 | |
| Falcon Tube 50ml | BD Biosciences, Erembodegem, Belgium | 352070 |
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Cite This Article
Nowacki, T. M., Bettenworth, D., Brückner, M., Cordes, F., Lenze, F., Becker, A., Wildgruber, M., Eisenblätter, M. Fluorescence-mediated Tomography for the Detection and Quantification of Macrophage-related Murine Intestinal Inflammation. J. Vis. Exp. (130), e55942, doi:10.3791/55942 (2017).