Fluorescens-medierad tomografi för påvisande och kvantifiering av makrofag-relaterade murina tarminflammation
Summary
Mål-specifika prober representerar ett innovativt verktyg för att analysera molekylära mekanismer, såsom proteinuttryck i olika typer av sjukdom (t.ex. inflammation, infektion och uppkomst). I denna studie beskriver vi en kvantitativ tredimensionella tomografiska bedömning av intestinal makrofag infiltration i en murin modell av kolit med F4/80-specifika fluorescens-medierad tomografi.
Abstract
Murina modeller av sjukdom är oumbärliga för vetenskaplig forskning. Många diagnostiska verktyg såsom endoskopi eller datortomografisk imaging används dock inte rutinmässigt i djurmodeller. Konventionella experimentella utläsningar förlitar sig ofta på besiktning och ex vivo analyser, som förhindra inom enskilda uppföljande undersökningar och öka antalet studie djur behövs. Fluorescens-medierad datortomografi gör det möjligt för icke-invasiv, repetitiva, kvantitativa, tredimensionella bedömningen av fluorescerande sonder. Det är mycket känsliga och tillåter användning av molekylära beslutsfattare, vilket möjliggör specifika identifiering och karakterisering av olika molekylära mål. Särskilt representerar riktade sonder ett innovativt verktyg för att analysera aktivering och protein genuttryck i inflammation, autoimmun sjukdom, infektion, kärlsjukdom, cellmigration, tumourigenesis, etc. I denna artikel tillhandahåller vi stegvisa instruktioner på denna sofistikerade bildteknik för i vivo upptäckt och karakterisering av inflammation (dvs F4/80-positiva makrofag infiltration) i en allmänt använd murina modell av tarminflammation. Denna teknik kan också användas inom andra områden, såsom immun cell eller stem cell tracking.
Introduction
Djurmodeller används allmänt i vetenskaplig forskning och många icke-invasiva förfaranden finns för att övervaka sjukdomsaktivitet och vitalitet, såsom kvantifiering av kroppsvikten eller analys av blod, urin och avföring. Dock är dessa endast indirekt surrogat parametrar som också omfattas av interindividuell variabilitet. De måste ofta kompletteras med obduktion analyser av vävnad exemplar, som förhindrar seriell observation vid repetitiva tidpunkter och direkt observation av fysiologiska eller patologiska processer i vivo. Sofistikerade små djur bildgivande tekniker har dykt upp, inklusive cross sectional imaging, optisk imaging och endoskopi, som möjliggör direkt visualisering av dessa processer och tillåter också för upprepade analyser av samma djur1 , 2 , 3. Dessutom möjligheten att upprepande övervaka olika stadier av sjukdomen på samma djur kan minska antalet djur som behövs, vilket kan vara önskvärt ur ett djuretik synvinkel.
Det finns flera olika optisk imaging tekniker för i vivo fluorescens imaging. Ursprungligen anställdes confocal imaging att studera och under markytan fluorescerande händelser4,5. Nyligen har dock har tomografiska system som möjliggör kvantitativa tredimensionella vävnad bedömningar varit utvecklade6. Detta har åstadkommits genom utveckling av fluorescerande sonder som avger ljus i det nära infraröda (NIR) spektrumet, erbjuder låg absorption, känsliga detektorer och monokromatiskt ljus källor7. Medan traditionella cross-sectioning avbildningstekniker, såsom datortomografi (CT), magnetkamera (MRI) eller ultraljud (USA), främst förlitar sig på fysiska parametrar och visualisera morfologi, kan optisk imaging ge ytterligare information på underliggande molekylära processer sonder med hjälp av endogena eller exogena fluorescerande8.
Framstegen inom molekylärbiologi har bidragit till att underlätta genereringen av smart och riktade fluorescerande molekylära sonder för ett ökande antal mål. Till exempel kan receptormedierad upptag och distribution i en given målområdet visualiseras med hjälp av carbocyanine derivat-märkt antikroppar9. Överflödet av tillgängliga antikroppar, som kan vara märkt för att fungera som specifika spårämnen i annars otillgängliga områden av kroppen, ger oöverträffad insikter molekylära och cellulära processer i modeller av uppkomst och neurodegenerativa, hjärt-, immunologiska och inflammatoriska sjukdomar7.
I denna studie beskriver vi användningen av fluorescens-medierad tomografi i en murin modell av kolit. Dextran natriumsulfat (DSS)-inducerad kolit är en standard kemiskt inducerad musmodell av tarminflammation som liknar upphetsande läkt sjukdom (IBD)10. Det är särskilt användbart för utvärdering av bidraget av det medfödda immunsystemet till utvecklingen av tarm inflammation11. Eftersom den rekrytering, aktivering och infiltration av monocyter och makrofager representerar viktiga steg i patogenesen av IBD, är visualisering av deras rekrytering och kineticsen av infiltration viktigt för övervakning, till exempel effekten av potentiella terapeutiska ämnen i en preklinisk inställning12. Vi beskriva induktion av DSS kolit och Visa tomografi-medierad karakterisering av makrofag infiltration i tarmslemhinnan i med hjälp av fluorescens molekylär tomografi för specifika visualisering av monocyt/makrofag markören F4/80 13. Dessutom kan vi illustrera hjälppersonal och kompletterande förfaranden, såsom antikropp märkning. den experimentella setup; och analys och tolkning av erhållna bilderna, i samband med konventionella utläsningar såsom sjukdom aktivitet index, flöde flödescytometri och histologisk analys och immunohistokemi. Vi diskutera begränsningar av denna teknik och jämförelser till andra avbildningsmetoder.
Protocol
Representative Results
Discussion
Även om medicinska bildgivande tekniker har utvecklats snabbt under de senaste åren, är vi fortfarande begränsade i vår förmåga att upptäcka inflammatoriska processer eller tumörer, samt andra sjukdomar, i sina tidigaste utvecklingsstadier. Detta är dock viktigt att förstå tumörtillväxt, invasion, eller metastaser utveckling och cellulära processer i utvecklingen av inflammatoriska sjukdomar och degenerativa, kardiovaskulära och immunologiska sjukdomar. Medan traditionella avbildningstekniker förlitar si…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Ms. Sonja Dufentester, Ms. Elke Weber och Mrs Klaudia Niepagenkämper med utmärkta tekniska bistånd.
Materials
| Reagents | |||
| Alfalfa-free diet | Harlan Laboritories, Madison, USA | 2014 | |
| Bepanthen eye ointment | Bayer, Leverkusen, Germany | 80469764 | |
| Dextran sulphate sodium (DSS) | TdB Consulatancy, Uppsala, Sweden | DB001 | |
| Eosin | Sigma – Aldrich, Deisenhofen, Germany | E 4382 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma – Aldrich, Deisenhofen, Germany | E 9884 | |
| Florene 100V/V | Abbott, Wiesbaden, Germany | B506 | |
| Haematoxylin | Sigma – Aldrich, Deisenhofen, Germany | HHS32-1L | |
| O.C.T. Tissue Tek compound | Sakura, Zoeterwonde, Netherlands | 4583 | fixative for histological analyses |
| Phosphate buffered saline, PBS | Lonza, Verviers, Belgium | 4629 | |
| Sodium Chloride 0,9% | Braun, Melsungen, Germany | 5/12211095/0411 | |
| Sodium bicarbonate powder | Sigma Aldrich Deisenhofen, Germany | S5761 | |
| Standard diet | Altromin, Lage, Germany | 1320 | |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura, Leiden, Netherlands | 4566 | |
| Hemoccult (guaiac paper test) | Beckmann Coulter, Germany | 3060 | |
| Biotin rat-anti-mouse anti-F4/80 antibody | Serotec, Oxford, UK | MCA497B | |
| Biotin rat-anti-mouse anti-GR-1 | BD Pharmingen, Heidelberg Germany | 553125 | |
| Streptavidin-Alexa546 | Molecular Probes, Darmstadt, Germany | S-11225 | excitation/emission maximum: 556/573nm |
| Anti-CD11b rat-anti-mouse antibody TC | Calteg, Burlingame, USA | R2b06 | |
| Purified anti-mouse F4/80 antibody | BioLegend, London, UK | 123102 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | D9542 | |
| FITC-conjugated anti-Ly6C rat-anti-mouse antibody | BD Pharmingen, Heidelberg, Germany | 553104 | |
| FACS buffer | BD Pharmingen, Heidelberg, Germany | 342003 | |
| Cy7 NHS Ester | GE Healthcare Europe, Freiburg, Germany | PA17104 | |
| MPO ELISA | Immundiagnostik AG, Bensheim, Germany | K 6631B | |
| Cy5.5 labeled anti-mouse F4/80 antibody | BioLegend, London, UK | 123127 | ready to use labelled Antibodies (alternative) |
| Anti-Mouse F4/80 Antigen PerCP-Cyanine5.5 | eBioscience, Waltham, USA | 45-4801-80 | ready to use labelled Antibodies (alternative) |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | 67-68-5 | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | 792632 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | 64-17-5 | |
| Bovine Serum Albumins (BSA) | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | A4612 | |
| Tris Buffered Saline Solution (TBS) | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | SRE0032 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| FACS Calibur Flow Cytometry System | BD Biosciences GmbH, Heidelberg, Germany | ||
| FMT 2000 In Vivo Imaging System | PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA | FMT2000 | |
| True Quant 3.1 Imaging Analysis Software | PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA | included in FMT2000 | |
| Leica DMLB Fluorescent Microscope | Leica, 35578 Wetzlar, Germany | DMLB | |
| Bandelin Sonopuls HD 2070 | Bandelin, 12207 Berlin, Germany | HD 2070 | ultrasonic homogenizer |
| Disposable scalpel No 10 | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | Z692395-10EA | |
| Metzenbaum scissors 14cm | Ehrhardt Medizinprodukte GmbH, Geislingen, Germany | 22398330 | |
| luer lock syringe 5ml | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | Z248010 | |
| syringe needles | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | Z192368 | |
| Falcon Tube 50ml | BD Biosciences, Erembodegem, Belgium | 352070 |
References
- Bruckner, M., et al. Murine endoscopy for in vivo multimodal imaging of carcinogenesis and assessment of intestinal wound healing and inflammation. J Vis Exp. (90), (2014).
- Lewis, J. S., Achilefu, S., Garbow, J. R., Laforest, R., Welch, M. J. Small animal imaging. current technology and perspectives for oncological imaging. Eur J Cancer. 38 (16), 2173-2188 (2002).
- Bettenworth, D., et al. Translational 18F-FDG PET/CT imaging to monitor lesion activity in intestinal inflammation. J Nucl Med. 54 (5), 748-755 (2013).
- Vowinkel, T., et al. Apolipoprotein A-IV inhibits experimental colitis. J Clin Invest. 114 (2), 260-269 (2004).
- Korlach, J., Schwille, P., Webb, W. W., Feigenson, G. W. Characterization of lipid bilayer phases by confocal microscopy and fluorescence correlation spectroscopy. Proc Natl Acad Sci USA. 96 (15), 8461-8466 (1999).
- Ntziachristos, V., Tung, C. H., Bremer, C., Weissleder, R. Fluorescence molecular tomography resolves protease activity in vivo. Nat Med. 8 (7), 757-760 (2002).
- Ntziachristos, V., Bremer, C., Weissleder, R. Fluorescence imaging with near-infrared light: new technological advances that enable in vivo molecular imaging. Eur Radiol. 13 (1), 195-208 (2003).
- Ntziachristos, V., Bremer, C., Graves, E. E., Ripoll, J., Weissleder, R. In vivo tomographic imaging of near-infrared fluorescent probes. Mol Imaging. 1 (2), 82-88 (2002).
- Ballou, B., et al. Tumor labeling in vivo using cyanine-conjugated monoclonal antibodies. Cancer Immunol Immunother. 41 (4), 257-263 (1995).
- Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nat Protoc. 2 (3), 541-546 (2007).
- Kawada, M., Arihiro, A., Mizoguchi, E. Insights from advances in research of chemically induced experimental models of human inflammatory bowel disease. World J Gastroenterol. 13 (42), 5581-5593 (2007).
- Nowacki, T. M., et al. The 5A apolipoprotein A-I (apoA-I) mimetic peptide ameliorates experimental colitis by regulating monocyte infiltration. Br J Pharmacol. 173 (18), 2780-2792 (2016).
- Hansch, A., et al. In vivo imaging of experimental arthritis with near-infrared fluorescence. Arthritis Rheum. 50 (3), 961-967 (2004).
- Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses. J Vis Exp. (113), (2016).
- Diaz-Granados, N., Howe, K., Lu, J., McKay, D. M. Dextran sulfate sodium-induced colonic histopathology, but not altered epithelial ion transport, is reduced by inhibition of phosphodiesterase activity. Am J Pathol. 156 (6), 2169-2177 (2000).
- Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. Investigating intestinal inflammation in DSS-induced model of IBD. J Vis Exp. (60), e3678 (2012).
- Dieleman, L. A., et al. Chronic experimental colitis induced by dextran sulphate sodium (DSS) is characterized by Th1 and Th2 cytokines. Clin Exp Immunol. 114 (3), 385-391 (1998).
- Kojouharoff, G., et al. Neutralization of tumour necrosis factor (TNF) but not of IL-1 reduces inflammation in chronic dextran sulphate sodium-induced colitis in mice. Clin Exp Immunol. 107 (2), 353-358 (1997).
- Sunderkotter, C., et al. Subpopulations of mouse blood monocytes differ in maturation stage and inflammatory response. J Immunol. 172 (7), 4410-4417 (2004).
- Willmann, J. K., van Bruggen, N., Dinkelborg, L. M., Gambhir, S. S. Molecular imaging in drug development. Nat Rev Drug Discov. 7 (7), 591-607 (2008).
- Ntziachristos, V., Ripoll, J., Wang, L. V., Weissleder, R. Looking and listening to light: the evolution of whole-body photonic imaging. Nat Biotechnol. 23 (3), 313-320 (2005).
- Ntziachristos, V. Going deeper than microscopy: the optical imaging frontier in biology. Nat Methods. 7 (8), 603-614 (2010).
- Stuker, F., Ripoll, J., Rudin, M. Fluorescence molecular tomography: principles and potential for pharmaceutical research. Pharmaceutics. 3 (2), 229-274 (2011).
- Beziere, N., Ntziachristos, V. Optoacoustic imaging: an emerging modality for the gastrointestinal tract. Gastroenterology. 141 (6), 1979-1985 (2011).
- Habtezion, A., Nguyen, L. P., Hadeiba, H., Butcher, E. C. Leukocyte Trafficking to the Small Intestine and Colon. Gastroenterology. 150 (2), 340-354 (2016).
- Ungar, B., Kopylov, U. Advances in the development of new biologics in inflammatory bowel disease. Ann Gastroenterol. 29 (3), 243-248 (2016).
- Sandborn, W. J., et al. Vedolizumab as induction and maintenance therapy for Crohn’s disease. N Engl J Med. 369 (8), 711-721 (2013).
- Vermeire, S., et al. Etrolizumab as induction therapy for ulcerative colitis: a randomised, controlled, phase 2 trial. Lancet. 384 (9940), 309-318 (2014).
- Coskun, M., Vermeire, S., Nielsen, O. H. Novel Targeted Therapies for Inflammatory Bowel Disease. Trends Pharmacol Sci. , (2016).
- Vermeire, S., et al. The mucosal addressin cell adhesion molecule antibody PF-00547,659 in ulcerative colitis: a randomised study. Gut. 60 (8), 1068-1075 (2011).
- Terai, T., Nagano, T. Small-molecule fluorophores and fluorescent probes for bioimaging. Pflugers Arch. 465 (3), 347-359 (2013).
- Ren, W., et al. Dynamic Measurement of Tumor Vascular Permeability and Perfusion using a Hybrid System for Simultaneous Magnetic Resonance and Fluorescence Imaging. Mol Imaging Biol. 18 (2), 191-200 (2016).
- Ale, A., Ermolayev, V., Deliolanis, N. C., Ntziachristos, V. Fluorescence background subtraction technique for hybrid fluorescence molecular tomography/x-ray computed tomography imaging of a mouse model of early stage lung cancer. J Biomed Opt. 18 (5), 56006 (2013).
- Chames, P., Van Regenmortel, M., Weiss, E., Baty, D. Therapeutic antibodies: successes, limitations and hopes for the future. Br J Pharmacol. 157 (2), 220-233 (2009).
- Faust, A., Hermann, S., Schafers, M., Holtke, C. Optical imaging probes and their potential contribution to radiotracer development. Nuklearmedizin. 55 (2), 51-62 (2016).
- Mahler, M., et al. Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis. Am J Physiol. 274 (3 Pt 1), G544-G551 (1998).
