Summary

外因性の抗原クロス プレゼンテーション内の小胞体関連分解膜コンパートメントの精製

Published: August 21, 2017
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Summary

ここで説明する方法は、外因性の抗原クロス プレゼンテーションで小胞体関連分解によって処理される細胞コンパートメントの浄化は、新しい小胞の分離プロトコルです。

Abstract

樹状細胞 (Dc) は、主要組織適合抗原 (MHC) クラスに内面化された外因性抗原の提示や画像処理能力が高く、私分子として知られているクロス プレゼンテーション (CP)。CP は+ T ナイーブ CD8 の刺激だけでなく、重要な役割を果たしている細胞とメモリー CD8+ T 細胞の感染と動圧の不活性化にも腫瘍免疫ナイーブ T 細胞、T 細胞アネルギーや T 細胞削除。CP の重要な分子機構になって、蓄積された証拠を示すことが外因性の抗原は小胞体関連分解 (ERAD) 非古典からエクスポート後エンドサイトーシスを介して処理されます。コンパートメント。最近まで、外因性の抗原以外の特定の分子マーカーがなかったので、これらのエンドサイトーシスのコンパートメントの特徴は限られていた。ここで説明する方法は、これらのエンドサイトーシスのコンパートメントの浄化では、新しい小胞の分離プロトコルです。この精製微粒体を使用して、我々 再構成 ERAD のようなトランスポート、ユビキチン化、および外因性抗原の体外、処理ユビキチン-プロテアソーム システムがこれからの輸出後外因性抗原を処理することを示唆しています。細胞内コンパートメント。このプロトコルは、CP の分子機構を明らかにする他の細胞型にさらに適用できます。

Introduction

MHC 私分子すべての有核細胞の表面に細胞質1ユビキチン-プロテアソーム システムによって処理される内因性抗原由来抗原ペプチドを発現しています。処理後、抗原ペプチドは、ペプチド輸送体タップで小胞体 (ER) の内腔に運ばれます。小胞体内腔に特定シャペロンのシリーズは、ペプチドの読み込みと、フォールディング MHC I の複合体を支援します。分子のこのシリーズは、小胞体、ペプチドを MHC に私2の読み込みのため中央のコンパートメントであることを示すペプチド負荷複合体 (PLC) と呼ばれます。読み込み、ペプチッド MHC 後私分子細胞表面に運ばれ、キーとして役割を果たす適応免疫系の自己のマーカー、および CD8 を有効に+細胞傷害性 T リンパ球 (Ctl) がん細胞や感染性病原体を検出する抗原によって3非自己蛋白質由来ペプチド。

抗原提示細胞 (APC)、外因性の抗原の抗原性ペプチドもいる4,5,6,7,8 経由でCP、主に運ばれる私 MHC に提示で Dc9,10,11。CP が不可欠であるナイーブ CD8+ T の活性化のための両方セルとメモリ CD8 の不活化による+ T 細胞の免疫寛容の維持、抗感染症、抗腫瘍 Ctl12,13に自己演技ナイーブ T 細胞14,15。CP は、CP の分子メカニズムがまだ詳細に記載する適応免疫系の多くの重要な役割を果たしています。外因性の抗原が小胞体と、エンドソームの両方にローカライズされ、外因性の抗原がエンドソームから ERAD のような処理とペプチド16 の読み込みの小胞体に輸送されることを示唆している、ERAD で処理された CP の以前の研究で明らかに.しかし、蓄積された証拠は、小胞体ではなく、ER (図 1)17,18 の特徴がまたある非古典的エンドサイトーシス コンパートメントではなく CP のペプチド読み込みの実施を示します ,,1920,21。アミノペプチダーゼの高活性で抗原ペプチド前駆体の劣化を避けるためにこれらの非古典的エンドサイトーシス コンパートメント (図 1) の近位領域に細胞質、処理およびペプチドの CP で読み込みで22が発生します。これらのエンドサイトーシスのコンパートメントのキャラクタリゼーションが物議を醸すが、この区画で外因性の抗原以外の既存の特定の分子があります。

ERAD です具体的には小胞体からタンパク質を除去する細胞経路です。ERAD 経路の誤って折りたたまれたタンパク質は細胞質に小胞体膜を経由、ユビキチン-プロテアソーム システム23,24,25によって処理される逆行性。これらの分子が通過 Sec61 複合体とデルリン26ER と複雑なトムの複雑なティムなど、透過装置を複合体と呼ばれる分子装置、タンパク質などの大きな分子は脂質二重膜を輸送の際、ミトコンドリア27。外追加抗原は、小胞体膜を通じて転送されます、彼らは Sec61 複合体などの translocons との複合体の脂質二重膜を貫通する必要があります。ここで説明する方法は、エンドサイトーシスのコンパートメントのためのマーカーとしてこれらの膜貫通分子を利用してターゲットを絞った小胞を精製しました。

ここで説明する方法は、外因性抗原として DC のような細胞ライン DC2.428とビオチン化アルブミン (bOVA) を使用して新しい小胞浄化プロトコルです。エンドサイトーシスのコンパートメントにより精製されたストレプトアビジン (SA)-磁気ビーズ メーカーとして膜貫通ボーヴァを使用します。この精製のミクロゾームで外因 bOVA 膜画分でまだ維持されたが、ミクロソームとし、ユビキチンの外側に運搬・処理を追加いくつかの in vitro29。この精製ミクロゾーム ERAD とペプチド複合体での読み込みのエンドサイトーシスのコンパートメントに固有のタンパク質だけでなく、小胞体のタンパク質に含まれるCP29将来エンドサイトーシス コンパートメントを細胞内コンパートメントには示唆しています。このプロトコルは、外因性の抗原の種類に依存しない、また他 DC サブセットおよび他の細胞型、マクロファージ、B 細胞、内皮細胞など熟練した CP の Dc の正確な分子機構を明らかにするために適当。

Protocol

1 細胞の成長および外因性抗原添加 ビオチンはタンパク質ラベリングを使用して 準備 bOVA キット次の製造元 ' s プロトコル。 。 注: 通常、bOVA 含まれています 1 M OVA あたり 2 M ビオチン平均します。 55 mM 2-メルカプトエタノール、10 mM HEPES (pH 7.5) と 5 の 37 ° C で 10% ウシ胎仔血清 (以下 RPMI) 100 U/mL ペニシリン-ストレプトマイシン 0.1 mM 必須でないアミノ酸 2 mM L グルタミ…

Representative Results

CP の分子機構を解明するには、外因性の抗原が ERAD のようなトランスポートと処理を受ける細胞のコンパートメントを識別するために必要です。蛍光顕微鏡や電子顕微鏡による観察は、外因性の抗原は累積1918,16,17、、、細胞内コンパートメントを識?…

Discussion

CP の以前の研究で法人の外因性の抗原は蛍光顕微鏡観察16,30,31,32後期エンドソーム小胞体の制限区域に蓄積。ERAD のようなトランスポートおよび外因性抗原の処理は ER または後期エンドソームのこれらの専門分野の運ばれている推定されて細胞内コンパートメントは蔗糖あるいは iodixanol 密度勾配…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品は、高崎保健福祉大学のによってサポートされます。

Materials

RPMI 1640 gibco by life technologies 11875-093
Fetal bovine serum Equitech bio SFB30
Sodium pyruvate gibco by life technologies 11360-070
MEM non-essential amino acids gibco by life technologies 11140-050
HEPES gibco by life technologies 15630-080
2-mercaptoethanol gibco by life technologies 21985-023
L-glutamine gibco by life technologies 25030-164
Penisicillin-Sreptomycin gibco by life technologies 15140-122
DMEM gibco by life technologies 12100-46
OVA SIGMA A5503
Biotin-protein labelling kit Thermo Fisher Scientific F6347
MG-132  Santa Cruz Biotechnology 201270
lactacystin  SIGMA L6785
Dounce homogenizer IUCHI 131703
protease inhibitor cocktails  SIGMA P8340
iodixanol  Cosmo bio 1114542
SA-magnetic beads  New England Biolabs 201270
control magnetic beads Chemagen M-PVA012
magnetic stand BD Biosciences 552311
BCA protein assay kit Thermo Fisher Scientific 23225
silver staining kits Cosmo bio 423413
Reticulocyte Lysate Promega 1730714
Flag-tagged ubiquitin  SIGMA U5382
anti-ovalbumin (OVA,mouse) Antibody Shop HYB 094-06
ant-multi-ubiquitin (mouse) MBL D058−3
anti-Flag (mouse) SIGMA F3165
trypsin SIGMA 85450C

References

  1. van Endert, P. Providing ligands for MHC class I molecules. Cell Mol Life Sci. 68 (9), 1467-1469 (2011).
  2. Janeway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. . Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. , (2001).
  3. McDevitt, H. O. Discovering the role of the major histocompatibility complex in the immune response. Annu Rev Immunol. 18 (1), 1-17 (2000).
  4. Bedoui, S., et al. Cross-presentation of viral and self antigens by skin-derived CD103+ dendritic cells. Nat Immunol. 10 (5), 488-495 (2009).
  5. Segura, E., Villadangos, J. A. Antigen presentation by dendritic cells in vivo. Curr Opin Immunol. 21 (1), 105-110 (2009).
  6. Cheong, C., et al. Microbial stimulation fully differentiates monocytes to DC-SIGN/CD209(+) dendritic cells for immune T cell areas. Cell. 143 (3), 416-429 (2010).
  7. Henri, S., et al. CD207+ CD103+ dermal dendritic cells cross-present keratinocyte-derived antigens irrespective of the presence of Langerhans cells. J Exp Med. 207 (2), 189-206 (2010).
  8. Shortman, K., Heath, W. R. The CD8+ dendritic cell subset. Immunol. Rev. 234 (1), 18-31 (2010).
  9. Carbone, F. R., Kurts, C., Bennett, S. R., Miller, J. F., Heath, W. R. Cross-presentation: a general mechanism for CTL immunity and tolerance. Immunol Today. 19 (8), 368-373 (1998).
  10. Nair-Gupta, P., Blander, J. M. An updated view of the intracellular mechanisms regulating cross-presentation. Front Immunol. , (2013).
  11. Joffre, O. P., Segura, E., Savina, A., Amigorena, S. Cross-presentation by dendritic cells. Nat Rev Immunol. 12 (8), 557-569 (2012).
  12. Kurts, C., et al. Constitutive class I-restricted exogenous presentation of self antigens in vivo. J Exp Med. 184 (3), 923-930 (1996).
  13. Kurts, C., Kosaka, H., Carbone, F. R., Miller, J. F., Heath, W. R. Class I-restricted cross-presentation of exogenous self-antigens leads to deletion of autoreactive CD8(+) T cells. J Exp Med. 186 (2), 239-245 (1997).
  14. Bonifaz, L., et al. Efficient targeting of protein antigen to the dendritic cell receptor DEC-205 in the steady state leads to antigen presentation on major histocompatibility complex class I products and peripheral CD8+ T cell tolerance. J Exp Med. 196 (12), 1627-1638 (2002).
  15. Heath, W. R., Carbone, F. R. Cross-presentation in viral immunity and self-tolerance. Nat Rev Immunol. 1 (2), 126-134 (2001).
  16. Imai, J., Hasegawa, H., Maruya, M., Koyasu, S., Yahara, I. Exogenous antigens are processed through the endoplasmic reticulum-associated degradation (ERAD) in cross-presentation by dendritic cells. Int Immunol. 17 (1), 45-53 (2005).
  17. Houde, M., et al. Phagosomes are competent organelles for antigen cross-presentation. Nature. 425 (6956), 402-406 (2003).
  18. Guermonprez, P., et al. ER-phagosome fusion defines an MHC class I cross-presentation compartment in dendritic cells. Nature. 425 (6956), 397-402 (2003).
  19. Burgdorf, S., Scholz, C., Kautz, A., Tampe, R., Kurts, C. Spatial and mechanistic separation of cross-presentation and endogenous antigen presentation. Nat Immunol. 9 (5), 558-566 (2008).
  20. Lizée, G., et al. Control of dendritic cell cross-presentation by the major histocompatibility complex class I cytoplasmic domain. Nat Immunol. 4 (11), 1065-1073 (2003).
  21. Basha, G., et al. A CD74-dependent MHC class I endolysosomal cross-presentation pathway. Nat Immunol. 13 (3), 237-245 (2012).
  22. Saveanu, L., Carroll, O., Hassainya, Y., van Endert, P. Complexity, contradictions, and conundrums: studying post-proteasomal proteolysis in HLA class I antigen presentation. Immunol Rev. 207 (1), 42-59 (2005).
  23. Wiertz, E. J., et al. Sec61-mediated transfer of a membrane protein from the endoplasmic reticulum to the proteasome for destruction. Nature. 384 (6608), 432-438 (1996).
  24. Hampton, R. Y. ER-associated degradation in protein quality control and cellular regulation. Curr Opin Cell Biol. 14 (4), 476-482 (2002).
  25. Tsai, B., Ye, Y., Rapoport, T. A. Retro-translocation of proteins from the endoplasmic reticulum into the cytosol. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (4), 246-255 (2002).
  26. Nyathi, Y., Wilkinson, B. M., Pool, M. R. Co-translational targeting and translocation of proteins to the endoplasmic reticulum. Biochim Biophys Acta. 1833 (11), 2392-2402 (2013).
  27. Varabyova, A., Stojanovski, D., Chacinska, A. Mitochondrial protein homeostasis. IUBMB Life. 65 (3), 191-201 (2013).
  28. Shen, Z., Reznikoff, G., Dranoff, G., Rock, K. L. Cloned dendritic cells can present exogenous antigens on both MHC class I and class II molecules. J Immunol. 158 (6), 2723-2730 (1997).
  29. Imai, J., Otani, M., Sakai, T., Hatta, S. Purification of the subcellular compartment in which exogenous antigens undergo endoplasmic reticulum-associated degradation from dendritic cells. Heliyon. , (2016).
  30. Kovacsovics-Bankowski, M., Rock, K. L. A phagosome-to-cytosol pathway for exogenous antigens presented on MHC class I molecules. Science. 267 (5195), 243-246 (1995).
  31. Ackerman, A. L., Giodini, A., Cresswell, P. A role for the endoplasmic reticulum protein retro translocation machinery during cross presentation by dendritic cells. Immunity. 25 (4), 607-617 (2006).
  32. Ackerman, A. L., Kyritsis, C., Tampé, R., Cresswell, P. Early phagosomes in dendritic cells form a cellular compartment sufficient for cross presentation of exogenous antigens. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (22), 12889-12894 (2003).
  33. Saveanu, L., et al. IRAP identifies an endosomal compartment required for MHC class I cross-presentation. Science. 325 (5937), 213-217 (2009).
  34. Zehner, M., et al. The translocon protein Sec61 mediates antigen transport from endosomes in the cytosol for cross-presentation to CD8(+) T cells. Immunity. 42 (5), 850-863 (2015).

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Citer Cet Article
Imai, J., Otani, M., Sakai, T., Hatta, S. Purification of the Membrane Compartment for Endoplasmic Reticulum-associated Degradation of Exogenous Antigens in Cross-presentation. J. Vis. Exp. (126), e55949, doi:10.3791/55949 (2017).

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