외 인 항 원 십자가-프레 젠 테이 션에의 바인딩과 그물 관련 성능 저하 막 구획의 정화

Summary

여기에 설명 된 메서드는 exogenous 항 바인딩과 그물 관련 저하 크로스-프레 젠 테이 션에 의해 처리 됩니다 세포질 구획의 정화에 대 한 수 있는 새로운 소포 격리 프로토콜입니다.

Abstract

수지상 세포 (Dc)는 고도의 처리 및 중요 한 조직 적합성 클래스 (MHC)에 따라 내 면된 외 인 항 원 제시의 나 분자 라고 크로스-프레 젠 테이 션 (CP). CP는 중요 한 역할 뿐만 아니라 순진한 CD8 자극⁺ T 세포와 CD8 메모리⁺ T 세포에 대 한 감염 및 self-acting의 비활성화에 뿐만 아니라 종양 면역 naïve T 세포 T 세포 아 또는 T 셀 삭제. CP의 중요 한 분자 메커니즘 해명 될 남아, 비록 축적 증거가 나타냅니다 exogenous 항 저하를 통해 떠다니고 그물 관련 (ERAD) 비 클래식에서 수출 후 endocytic 처리 됩니다. 구획입니다. 최근까지, 외 인 항 원 이외의 아무 특정 분자 마커 있었기 때문에 이러한 endocytic 구획의 characterizations을 제한 했다. 여기에 설명 된 메서드는 이러한 endocytic 구획의 정화에 대 한 수 있는 새로운 소포 격리 프로토콜입니다. 이 순화 microsome 사용 하 여, 우리 재구성 ERAD 같은 전송, ubiquitination, 및 처리는 외 인 항 원에 체 외에, 유비퀴틴-프로테아좀 시스템 수출이 후 외 인 항 원 처리 제안 세포질 구획입니다. 이 프로토콜은 CP의 분자 메커니즘을 명확 하 게 다른 세포 유형에 더 적용할 수 있습니다.

Introduction

MHC I 분자 cytosol¹에서 유비퀴틴-프로테아좀 시스템에 의해 처리 되는 내 인 성 항에서 파생 하는 짧은 항 원 펩 티 드와 모든 nucleated 세포의 표면에 표현 된다. 처리 후, 항 원 펩 티 드 펩 티 드 운송업 자 탭에 의해 바인딩과 그물 (응급실) 루멘으로 이송 됩니다. ER의 루멘에서 일련의 특정 보호자 펩 티 드 로드 하 고 올바른 접는 MHC의 나 복잡 한 지원 합니다. 분자의이 시리즈는 펩 티 드 로드 복잡 한 (PLC), 응급실 펩 티 드 나²MHC에 적재에 대 한 중앙 구획을 나타내는 이라고 합니다. 후에 펩 티 드, 로드는 MHC I 분자 세포 표면에 수송 하 고 핵심적인 역할을 담당할 적응 면역 시스템에 자기 마커, 그리고 수는 CD8⁺ 세포 독성 T 세포 (Ctl) 암 세포 또는 전염 성 요원을 항 원에 의해 ³비 각자 단백질 펩 티 드.

항 원 제시 세포 (APC), 외 인 항에서 항 원 펩 티 드에서는 또한 내가^4,5,6,,78 통해 CP, 주로 수행 MHC 시 제시 의해 Dc^9,,1011. CP는 필수⁺ T 순진한 CD8의 활성화를 위한 둘 다 세포와 CD8 메모리⁺ T 세포의 비활성화에 의해 안티 전염 성 및 안티-종양 Ctl^12,13, 그리고 면역 관용의 유지 보수에 자기 행동 naïve T 세포^14,15. 그러나 CP CP의 분자 기계 장치는 아직 자세히 설명 될 적합 한 면역 계통에 많은 중요 한 역할을 재생 합니다. CP의 이전 연구 밝혔다 exogenous 항 모두 응급실에는 endosome 현지 했다 ERAD, ERAD 같은 처리 및 펩 티 드^{16 로드에 대 한 응급실에 외 인 항 원은 endosome에서 이송은 제안 처리} . 그러나, 축적 증거가 나타냅니다 응급실에서 아닙니다 그러나 오히려 응급실 (그림 1)^{17,18의 독특한 기능을가지고 아닌 클래식 endocytic 구획 밖으로 CP의 펩 티 드 로드 수행 ,19,,2021}. Aminopeptidase의 높은 활동에 의해 항 원 펩 티 드 선구자의 저하를 방지 하려면²² cytosol, 처리 및 CP에서 로드 하는 펩 티 드에이 아닌 클래식 endocytic 구획 (그림 1)의 인접 지역에서 발생 합니다. 이러한 endocytic 구획의 characterizations 논란이 있지만, 이외에 외 인 항 원이이 구획에 없는 기존 특정 분자 있다.

ERAD는 세포질 통로, 특히 응급실에서 misfolded 단백질을 제거 하는. ERAD 경로에 misfolded 단백질 retrogradely ER 막 세포질을 통해 운반 되며 유비퀴틴-프로테아좀 시스템^23,,2425처리. 큰 분자, 단백질, 등 지질 bilayer를 통해 수송 된다,이 분자를 통과에 복잡 한 복잡 한 Sec61 및 Derlin ER²⁶, 그리고 복잡 한 톰에 복잡 한 팀 같은 translocon 라는 분자 장치는 미토 콘 드리 아²⁷ 것 추가 항 ER 막 통해 수송 된다, 그들은 translocons, Sec61 복합 등으로 복잡 한 지질 bilayer를 관통 하 게 해야 합니다. 여기 설명 하는 방법을 endocytic 구획에 대 한 표식으로이 막 관통 분자를 이용 하 여 타겟된 기를 정화.

여기에 설명 된 방법은 외 인 항 원으로는 DC 같은 셀 선 DC2.4²⁸ 와 biotinylated ovalbumin (bOVA)를 사용 하 여 새로운 기 정화 프로토콜입니다. Endocytic 구획 streptavidin (SA)에 의해 순화 되었다-자석 구슬 메이커로 막 관통 bOVA를 사용 하 여. 이 순화 microsome 일부 것 추가 bOVA 여전히 막 분수에 보존 되었다 하지만 microsome, 및 다음 ubiquitinated의 외부에 이송 되었고 처리²⁹ 생체 외에서. 이 순화 microsome endocytic 구획 특정 단백질 뿐만 아니라 ER-상주 단백질 ERAD 및 펩 티 드 복잡 한; 로드 포함 세포질 구획 CP²⁹에 대 한 예비 endocytic 구획 제안. 이 프로토콜은 exogenous 항 원의 종류에 따라 그리고 다른 DC 하위 집합 및 다른 세포 유형, 대 식 세포, B 세포, 내 피 세포, 등 실력 CP에 대 한 Dc의 정확한 분자 메커니즘을 명확 하 게 적용 됩니다.

Protocol

1. 성장 세포와 외 인 항 원 추가 biotin 단백질 라벨을 사용 하 여 준비 bOVA 키트 제조 업체에 따라 ' s 프로토콜. 참고: 일반적으로, bOVA 포함 2 M biotin 1 M OVA 당 평균. 성장 DC2.4 셀 RPMI-1640 2mm L-글루타민, 1mm 나트륨 pyruvate, 0.1 m m 불필요 한 아미노산, 100 U/mL 페니실린-스, 55 m m 2-mercaptoethanol, 10 mM HEPES (pH 7.5), 및 5에서 37 ° C에서 10% 태아 종 아리 혈 청 (여기서 부터는 RPMI)와 보충 습?…

Representative Results

CP의 분자 메커니즘을 명료 하 게 그것은 exogenous 항 ERAD와 같은 전송 및 처리를 받아야 세포질 구획을 식별 하는 데 필요한. Immunofluorescent 현미경 또는 전자 현미경 관찰 어디 외 인 항 원16,,1718,19, 축적 된 세포질 구획을 확인 하는 동안 3…

Discussion

CP의 이전 연구에서 통합된 외 인 항 원 immunofluorescent 현미경 검사 법^16,30,,3132에 의해 늦은 endosome 또는 응급실의 제한 된 영역에서 축적 된. 세포질 구획은 자당 또는 iodixanol 조밀도 기온 변화도 원심 분리를 사용 하 여 식별 되는 ERAD와 같은 전송 및 외 인 항 원 처리 수행 됩니다 응급실 또는 늦은 endoso…

Materials

RPMI 1640	gibco by life technologies	11875-093
Fetal bovine serum	Equitech bio	SFB30
Sodium pyruvate	gibco by life technologies	11360-070
MEM non-essential amino acids	gibco by life technologies	11140-050
HEPES	gibco by life technologies	15630-080
2-mercaptoethanol	gibco by life technologies	21985-023
L-glutamine	gibco by life technologies	25030-164
Penisicillin-Sreptomycin	gibco by life technologies	15140-122
DMEM	gibco by life technologies	12100-46
OVA	SIGMA	A5503
Biotin-protein labelling kit	Thermo Fisher Scientific	F6347
MG-132	Santa Cruz Biotechnology	201270
lactacystin	SIGMA	L6785
Dounce homogenizer	IUCHI	131703
protease inhibitor cocktails	SIGMA	P8340
iodixanol	Cosmo bio	1114542
SA-magnetic beads	New England Biolabs	201270
control magnetic beads	Chemagen	M-PVA012
magnetic stand	BD Biosciences	552311
BCA protein assay kit	Thermo Fisher Scientific	23225
silver staining kits	Cosmo bio	423413
Reticulocyte Lysate	Promega	1730714
Flag-tagged ubiquitin	SIGMA	U5382
anti-ovalbumin (OVA,mouse)	Antibody Shop	HYB 094-06
ant-multi-ubiquitin (mouse)	MBL	D058−3
anti-Flag (mouse)	SIGMA	F3165
trypsin	SIGMA	85450C