Purificación del compartimento de la membrana de retículo endoplasmático asociado degradación de antígenos exógenos en presentación cruzada
Summary
El método descrito aquí es un nuevo protocolo de aislamiento de la vesícula, que permite la purificación de los compartimentos celulares donde se procesan los antígenos exógenos por degradación retículo endoplasmático asociado en presentación cruzada.
Abstract
Las células dendríticas (DCs) son altamente capaces de procesar y presentar antígenos exógenos internalizados a clase principal de histocompatibilidad (MHC) las moléculas también conocido como Cruz-presentación (CP). CP desempeña un papel importante no sólo en la estimulación de la ingenua CD8+ T memoria CD8 y células+ T las células infecciosas e inmunidad del tumor sino también en la inactivación de automática ingenuo T células por anergia de células T o células T de supresión. Aunque el mecanismo molecular crítico de CP queda por ser aclarada, acumulando indicios que antígenos exógenos se procesan a través del retículo endoplasmático asociado degradación (ERAD) después de su exportación de no clásicas endocíticas compartimientos. Hasta hace poco, las caracterizaciones de estos compartimentos endocíticos fueron limitadas porque no había marcadores moleculares específicos distintos antígenos exógenos. El método descrito aquí es un nuevo protocolo de aislamiento de la vesícula, que permite la purificación de estos compartimentos endocíticos. Usando esta purificado microsoma, hemos reconstituido la ERAD-como transporte, ubiquitinación y procesamiento de los antígenos exógenos en vitro, sugiriendo que el sistema ubiquitina-proteasoma procesado el antígeno exógeno después de la exportación de este compartimiento celular. Este protocolo se puede aplicar más a otros tipos de células para aclarar el mecanismo molecular de CP.
Introduction
El MHC las moléculas se expresan en la superficie de todas las células nucleadas, con cortos péptidos antigénicos derivados de antígenos endógenos, que son procesados por el sistema ubiquitina-proteasoma en el citosol1. Después de procesar, se transportan péptidos antigénicos en el lumen del retículo endoplásmico (ER) por el transportador de péptidos TAP. En el lumen del re, una serie de chaperonas específicas ayudan a la carga del péptido y el plegamiento correcto del MHC I complejo. Esta serie de moléculas se llama el complejo de carga (PLC), que indica que el ER es un compartimiento central para péptido cargando al MHC y2. Después de la carga, de péptidos del MHC las moléculas son transportadas a la superficie de la célula y juega un papel clave en el sistema inmune adaptativo auto marcadores, como permite el CD8+ los linfocitos T citotóxicos (CTLs) para detectar células cancerosas o agentes infecciosos por antigénica péptidos de las proteínas del mismo3.
En el antígeno que presenta las células (APC), péptidos antigénicos de los antígenos exógenos son también presentados en MHC4,5,6,7,8 a través de CP, que es fundamentalmente por DCs9,10,11. CP es esencial tanto para la activación de ingenuo CD8+ T memoria CD8 y células+ T células antiinfecciosas y anti-tumoral CTLs12,13y en el mantenimiento de la tolerancia inmune mediante la inactivación de autoactuante ingenuo T células14,15. El CP juega un papel importante muchos en el sistema inmune adaptativo, sin embargo, los mecanismos moleculares de CP tienen todavía ser descrito en detalle. Estudios previos de CP revelaron que antígenos exógenos fueron localizados en el retículo endoplasmático y el endosome y fueron procesados por ERAD, lo que sugiere que los antígenos exógenos son transportados desde el endosome a ER para ERAD-como proceso y péptido carga16 . Sin embargo, evidencia acumulada indica que la carga de péptido de CP se realiza no en la sala de emergencia sino en compartimentos endocíticos no clásica, que también tienen características distintivas de la ER (figura 1)17,18 ,19,20,21. Para evitar la degradación de los precursores del péptido antigénico por la alta actividad de aminopeptidasa22 en el citosol, el procesamiento y el péptido carga en CP se produce en la zona proximal de estos compartimentos endocíticos no clásica (figura 1). Aunque las caracterizaciones de estos compartimentos endocíticos son polémicas, hay no hay moléculas específicas existentes distintos antígenos exógenos en este compartimiento.
ERAD es una vía celular, que elimina específicamente proteínas mal plegadas de la ER. En el camino ERAD, proteínas mal plegadas retrogradely son transportadas a través de la membrana del ER al citoplasma y procesadas por el sistema de ubiquitina-proteasoma23,24,25. Cuando las moléculas grandes, como las proteínas, son transportadas a través de la bicapa lipídica, estas moléculas pasan a través de un aparato molecular llamado un translocon, tales como el complejo Sec61 y Derlin complejo en el ER26y el complejo de Tom y Tim complejo en la las mitocondrias27. Cuando exógeno agregado antígenos son transportados a través de la membrana del ER, que deben penetrar la bicapa lipídica en complejo con translocons, como el complejo Sec61. El método descrito aquí purificada la vesícula específica mediante la utilización de estas moléculas de penetración de la membrana como marcadores para los compartimentos endocíticos.
El método descrito aquí es un nuevo protocolo de purificación de vesícula usando el celular de DC como línea DC2.428 y biotinilado ovoalbúmina (bOVA) como un antígeno exógeno. Los compartimentos endocíticos se purificaron por estreptavidina (SA)-granos magnéticos mediante la penetración de la membrana bOVA como fabricante. En esta purificado microsoma, algunos añaden exógenamente bOVA se conservan en fracciones de membrana pero se transporta al exterior del microsoma y entonces ubiquitinated, procesaron en vitro29. Este microsome purificada contiene proteínas específicas del compartimiento endocíticas, sino también proteínas ER residente para ERAD y el péptido carga compleja; lo que sugiere que el compartimiento celular el compartimiento endocítico prospectivo para CP29. Este protocolo no es dependiente en el tipo de antígenos exógenos y también es aplicable para otros subconjuntos de DC y otros tipos de células, como macrófagos, células B y las células endoteliales, para aclarar el mecanismo molecular exacto de DCs para perito CP.
Protocol
Representative Results
Discussion
En estudios previos de CP, los antígenos exógenos incorporados acumulan en el área restricta del último endosome o ER por microscopía inmunofluorescente16,30,31,32. Se estima que ERAD-como transporte y procesamiento de antígenos exógenos se llevan a cabo en estas áreas especializadas de la ER o último endosome, el compartimento celular fue identificado por sacarosa o iodixanol centrifu…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo es apoyado por la Universidad de Takasaki de la salud y el bienestar.
Materials
| RPMI 1640 | gibco by life technologies | 11875-093 | |
| Fetal bovine serum | Equitech bio | SFB30 | |
| Sodium pyruvate | gibco by life technologies | 11360-070 | |
| MEM non-essential amino acids | gibco by life technologies | 11140-050 | |
| HEPES | gibco by life technologies | 15630-080 | |
| 2-mercaptoethanol | gibco by life technologies | 21985-023 | |
| L-glutamine | gibco by life technologies | 25030-164 | |
| Penisicillin-Sreptomycin | gibco by life technologies | 15140-122 | |
| DMEM | gibco by life technologies | 12100-46 | |
| OVA | SIGMA | A5503 | |
| Biotin-protein labelling kit | Thermo Fisher Scientific | F6347 | |
| MG-132 | Santa Cruz Biotechnology | 201270 | |
| lactacystin | SIGMA | L6785 | |
| Dounce homogenizer | IUCHI | 131703 | |
| protease inhibitor cocktails | SIGMA | P8340 | |
| iodixanol | Cosmo bio | 1114542 | |
| SA-magnetic beads | New England Biolabs | 201270 | |
| control magnetic beads | Chemagen | M-PVA012 | |
| magnetic stand | BD Biosciences | 552311 | |
| BCA protein assay kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| silver staining kits | Cosmo bio | 423413 | |
| Reticulocyte Lysate | Promega | 1730714 | |
| Flag-tagged ubiquitin | SIGMA | U5382 | |
| anti-ovalbumin (OVA,mouse) | Antibody Shop | HYB 094-06 | |
| ant-multi-ubiquitin (mouse) | MBL | D058−3 | |
| anti-Flag (mouse) | SIGMA | F3165 | |
| trypsin | SIGMA | 85450C |
References
- van Endert, P. Providing ligands for MHC class I molecules. Cell Mol Life Sci. 68 (9), 1467-1469 (2011).
- Janeway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. . Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. , (2001).
- McDevitt, H. O. Discovering the role of the major histocompatibility complex in the immune response. Annu Rev Immunol. 18 (1), 1-17 (2000).
- Bedoui, S., et al. Cross-presentation of viral and self antigens by skin-derived CD103+ dendritic cells. Nat Immunol. 10 (5), 488-495 (2009).
- Segura, E., Villadangos, J. A. Antigen presentation by dendritic cells in vivo. Curr Opin Immunol. 21 (1), 105-110 (2009).
- Cheong, C., et al. Microbial stimulation fully differentiates monocytes to DC-SIGN/CD209(+) dendritic cells for immune T cell areas. Cell. 143 (3), 416-429 (2010).
- Henri, S., et al. CD207+ CD103+ dermal dendritic cells cross-present keratinocyte-derived antigens irrespective of the presence of Langerhans cells. J Exp Med. 207 (2), 189-206 (2010).
- Shortman, K., Heath, W. R. The CD8+ dendritic cell subset. Immunol. Rev. 234 (1), 18-31 (2010).
- Carbone, F. R., Kurts, C., Bennett, S. R., Miller, J. F., Heath, W. R. Cross-presentation: a general mechanism for CTL immunity and tolerance. Immunol Today. 19 (8), 368-373 (1998).
- Nair-Gupta, P., Blander, J. M. An updated view of the intracellular mechanisms regulating cross-presentation. Front Immunol. , (2013).
- Joffre, O. P., Segura, E., Savina, A., Amigorena, S. Cross-presentation by dendritic cells. Nat Rev Immunol. 12 (8), 557-569 (2012).
- Kurts, C., et al. Constitutive class I-restricted exogenous presentation of self antigens in vivo. J Exp Med. 184 (3), 923-930 (1996).
- Kurts, C., Kosaka, H., Carbone, F. R., Miller, J. F., Heath, W. R. Class I-restricted cross-presentation of exogenous self-antigens leads to deletion of autoreactive CD8(+) T cells. J Exp Med. 186 (2), 239-245 (1997).
- Bonifaz, L., et al. Efficient targeting of protein antigen to the dendritic cell receptor DEC-205 in the steady state leads to antigen presentation on major histocompatibility complex class I products and peripheral CD8+ T cell tolerance. J Exp Med. 196 (12), 1627-1638 (2002).
- Heath, W. R., Carbone, F. R. Cross-presentation in viral immunity and self-tolerance. Nat Rev Immunol. 1 (2), 126-134 (2001).
- Imai, J., Hasegawa, H., Maruya, M., Koyasu, S., Yahara, I. Exogenous antigens are processed through the endoplasmic reticulum-associated degradation (ERAD) in cross-presentation by dendritic cells. Int Immunol. 17 (1), 45-53 (2005).
- Houde, M., et al. Phagosomes are competent organelles for antigen cross-presentation. Nature. 425 (6956), 402-406 (2003).
- Guermonprez, P., et al. ER-phagosome fusion defines an MHC class I cross-presentation compartment in dendritic cells. Nature. 425 (6956), 397-402 (2003).
- Burgdorf, S., Scholz, C., Kautz, A., Tampe, R., Kurts, C. Spatial and mechanistic separation of cross-presentation and endogenous antigen presentation. Nat Immunol. 9 (5), 558-566 (2008).
- Lizée, G., et al. Control of dendritic cell cross-presentation by the major histocompatibility complex class I cytoplasmic domain. Nat Immunol. 4 (11), 1065-1073 (2003).
- Basha, G., et al. A CD74-dependent MHC class I endolysosomal cross-presentation pathway. Nat Immunol. 13 (3), 237-245 (2012).
- Saveanu, L., Carroll, O., Hassainya, Y., van Endert, P. Complexity, contradictions, and conundrums: studying post-proteasomal proteolysis in HLA class I antigen presentation. Immunol Rev. 207 (1), 42-59 (2005).
- Wiertz, E. J., et al. Sec61-mediated transfer of a membrane protein from the endoplasmic reticulum to the proteasome for destruction. Nature. 384 (6608), 432-438 (1996).
- Hampton, R. Y. ER-associated degradation in protein quality control and cellular regulation. Curr Opin Cell Biol. 14 (4), 476-482 (2002).
- Tsai, B., Ye, Y., Rapoport, T. A. Retro-translocation of proteins from the endoplasmic reticulum into the cytosol. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (4), 246-255 (2002).
- Nyathi, Y., Wilkinson, B. M., Pool, M. R. Co-translational targeting and translocation of proteins to the endoplasmic reticulum. Biochim Biophys Acta. 1833 (11), 2392-2402 (2013).
- Varabyova, A., Stojanovski, D., Chacinska, A. Mitochondrial protein homeostasis. IUBMB Life. 65 (3), 191-201 (2013).
- Shen, Z., Reznikoff, G., Dranoff, G., Rock, K. L. Cloned dendritic cells can present exogenous antigens on both MHC class I and class II molecules. J Immunol. 158 (6), 2723-2730 (1997).
- Imai, J., Otani, M., Sakai, T., Hatta, S. Purification of the subcellular compartment in which exogenous antigens undergo endoplasmic reticulum-associated degradation from dendritic cells. Heliyon. , (2016).
- Kovacsovics-Bankowski, M., Rock, K. L. A phagosome-to-cytosol pathway for exogenous antigens presented on MHC class I molecules. Science. 267 (5195), 243-246 (1995).
- Ackerman, A. L., Giodini, A., Cresswell, P. A role for the endoplasmic reticulum protein retro translocation machinery during cross presentation by dendritic cells. Immunity. 25 (4), 607-617 (2006).
- Ackerman, A. L., Kyritsis, C., Tampé, R., Cresswell, P. Early phagosomes in dendritic cells form a cellular compartment sufficient for cross presentation of exogenous antigens. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (22), 12889-12894 (2003).
- Saveanu, L., et al. IRAP identifies an endosomal compartment required for MHC class I cross-presentation. Science. 325 (5937), 213-217 (2009).
- Zehner, M., et al. The translocon protein Sec61 mediates antigen transport from endosomes in the cytosol for cross-presentation to CD8(+) T cells. Immunity. 42 (5), 850-863 (2015).
