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Chemistry

सममित और असममित समाधान शर्तों के तहत आरोपित बुलबुले के चरण व्यवहार प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ नजर रखी

Published: October 24, 2017 doi: 10.3791/56034
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Max Planck Institute of Colloids and Interfaces

Summary

विशाल unilamellar बुलबुले अलग चरण पर प्रयोग (GUVs) अक्सर उपेक्षा शारीरिक समाधान की स्थिति । इस काम के लिए उच्च लवणता बफर के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए दृष्टिकोण प्रस्तुत multicomponent GUVs में तरल चरण जुदाई ट्रांस झिल्ली समाधान विषमता और तापमान के एक समारोह के रूप में ।

Abstract

चरण-अलग विशालकाय unilamellar बुलबुले (GUVs) के प्रदर्शन के लिए एक सहअस्तित्व तरल-आदेश दिया और तरल-परिक्रमा डोमेन एक आम भौतिक लिपिड बेड़ा परिकल्पना की जांच करने के लिए उपकरण हैं । कई अध्ययनों, तथापि, उपेक्षा शारीरिक समाधान शर्तों के प्रभाव । उस खाते पर, वर्तमान काम dioleylphosphatidylglycerol, अंडा sphingomyelin, और कोलेस्ट्रॉल से बड़े आरोपित GUVs में तरल-तरल चरण जुदाई पर उच्च लवणता बफर और ट्रांस झिल्ली समाधान विषमता का प्रभाव प्रस्तुत करता है । प्रभाव इज़ोटेर्माल और अलग तापमान की स्थिति के तहत अध्ययन किया गया ।

हम उपकरण और प्रयोगात्मक सममित और असममित उच्च लवणता समाधान की स्थिति के तहत आरोपित बुलबुले में एक साथ तरल डोमेन के स्थायित्व की निगरानी के लिए लागू रणनीतियों का वर्णन । यह उच्च तापमान पर उच्च-लवणता बफ़र में आरोपित multicomponent GUVs तैयार करने के लिए एक दृष्टिकोण भी शामिल है । प्रोटोकॉल पुटिका कमजोर पड़ने को कम करते हुए एक सरल कमजोर पड़ने के कदम से बाहरी समाधान के एक आंशिक विनिमय प्रदर्शन करने के लिए विकल्प पर जोर देता है । एक वैकल्पिक दृष्टिकोण एक microfluidic डिवाइस है कि एक पूरा बाहरी समाधान विनिमय के लिए अनुमति देता है का उपयोग प्रस्तुत किया है । चरण पृथक्करण पर समाधान प्रभाव भी अलग तापमान के तहत अध्ययन किया गया । यह अंत करने के लिए, हम बुनियादी डिजाइन और एक घर में निर्मित तापमान नियंत्रण कक्ष के उपयोगिता प्रस्तुत करते हैं । इसके अलावा, हम गुव चरण राज्य, इसके साथ जुड़े नुकसान और कैसे उंहें दरकिनार करने के आकलन पर प्रतिबिंबित ।

Introduction

कभी माइक्रोन के अवलोकन के बाद से तरल-तरल चरण-अलग विशाल unilamellar बुलबुले (GUVs) प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा आकार, GUVs एक मॉडल प्रणाली के रूप में इस्तेमाल किया गया है लिपिड बेड़ा परिकल्पना की जांच करने के लिए1,2 , 3 . अपने मुक्त खड़े bilayer के क्षेत्र के रूप में जैविक कोशिकाओं से है कि की सीमा में निहित है, वे प्लाज्मा की कल्पना की विशेषता बेड़ी के उपयुक्त नकल कर रहे हैं । ऐसे GUVs पर कई अध्ययनों शुद्ध पानी में फैलाया बुलबुले के साथ प्रदर्शन किया गया है, सुक्रोज या कम-लवणता समाधान4,5,6,7,8. इन स्थितियों, तथापि, उच्च-लवणता वातावरण और ट्रांस-झिल्ली समाधान विषमता के लिए शारीरिक रूप से प्रासंगिक प्रभाव को प्रतिबिंबित नहीं कोशिकाओं के लिए शर्तों के रूप में कर रहे हैं ।

इस काम में और हमारे समूह9से पिछले प्रकाशन में, आरोप multicomponent GUVs के चरण राज्यों झिल्ली भर में नमक और समाधान विषमता की उपस्थिति के एक समारोह के रूप में जांच की गई । GUVs dioleoylphosphatidylglycerol (DOPG), अंडा sphingomyelin (eSM), और कोलेस्ट्रॉल (चौल) में या तो सुक्रोज समाधान (osmolarity के साथ २१० mOsm/किग्रा) या उच्च-लवणता बफर (१०० मिमी NaCl, 10 मिमी Tris, पीएच ७.५, २१० के विभिन्न अनुपात के मिश्रण से तैयार किए गए mOsm/ लिपिड विकल्प पहले से ही इस मिश्रण6,8के चरण आरेख पर प्राप्त डेटा द्वारा उचित था ।

GUVs की तैयारी के लिए तरीकों की एक संख्या साहित्य में उपलब्ध है10,11,12 (ध्यान दें कि यहां, हम एक तेल से लिपिड के हस्तांतरण को शामिल उन पर विचार नहीं होगा एक जलीय चरण के आधार पर 13 , 14 क्योंकि शेष तेल झिल्ली जो चरण व्यवहार को प्रभावित कर सकते है में अवशेषों के अंतर्निहित खतरे की) । उच्च लवणता बफर में GUVs की तैयारी विशिष्ट चुनौतियों से जुड़ी है । कम ईओण ताकत के समाधान के लिए, electroformation विधि15,16 एक त्वरित तरीका है थोड़ा दोष10,17के साथ उच्च पैदावार में GUVs तैयार प्रस्तुत करता है । विधि एक प्रवाहकीय सतह पर लिपिड की एक परत जमा पर आधारित है (इलेक्ट्रोड), उन्हें सुखाने, और उन्हें एक जलीय समाधान के साथ हाइड्रेटिंग जबकि एक एसी क्षेत्र लागू. हालांकि, इस विधि के समायोजन की आवश्यकता है यदि नमक जलीय समाधान18,19में मौजूद है । यह माना जाता है कि electroformation द्वारा पुटिका वृद्धि के लिए ड्राइविंग बल electroosmosis16 है जो उच्च conductivities20पर बाधा है । इसलिए, उच्च लवणता समाधान में GUVs के electroswelling एक सीधा दृष्टिकोण नहीं है के रूप में यह सूजन समाधान में मौजूद विभिंन नमक सांद्रता के लिए अनुकूलन की आवश्यकता है । जेल असिस्टेड पुटिका सूजन21,22 भी तेजी से गठन के समय के साथ electroformation के लिए एक संभावित विकल्प है । यह दृष्टिकोण बढ़ाया लिपिड फिल्म जलयोजन पर बनाता है जब एक जेल (agarose या polyvinyl शराब (PVA)) एक सब्सट्रेट के रूप में प्रयोग किया जाता है । इन दृष्टिकोण, तथापि, agarose आधारित सूजन के मामले में झिल्ली संदूषण के जोखिम के साथ आ23 और/या तापमान सीमा के रूप में PVA के मामले में सूजन आधारित है । इसी तरह, एक फाइबर कागज सब्सट्रेट पर GUVs बढ़ने के लिए एक प्रोटोकॉल हाल ही में स्थापित किया गया है24. इस विधि के सामांय मुद्दों सब्सट्रेट पवित्रता पर नियंत्रण की कमी के रूप में के रूप में अच्छी तरह से लिपिड की बड़ी मात्रा के उपयोग कर रहे हैं । इस काम में, हम परिचय और गुव तैयारी के लिए सबसे पारंपरिक विधि के लाभों को पेश करेंगे, अर्थात् सहज सूजन विधि25,26। यह एक lipophobic सब्सट्रेट पर एक लिपिड परत सुखाने के होते हैं, यह पानी भाप वातावरण में हाइड्रेटिंग, और वांछित सूजन समाधान में बाद में सूजन ( चित्रा 1 देखें और प्रोटोकॉल अनुभाग में विवरण). इस विधि पुटिका आकार वितरण पर नियंत्रण प्रदान नहीं करता है और समग्र छोटे बुलबुले में परिणाम के रूप में तरीकों की तुलना में जहां उत्पादन बिजली के क्षेत्र द्वारा सहायता प्रदान की है, बहुलक सब्सट्रेट या microfluidic का मतलब है । हालांकि, पुटिका गुणवत्ता और आकार झिल्ली चरण राज्य की जांच के रूप में यहां तलाशी के लिए उपयुक्त है ।

पुटिका झिल्ली भर में समाधान के बीच विषमता पैदा करने के साथ ही कुछ चुनौतियों के साथ जुड़ा हुआ है । एक सामांय रूप से इस्तेमाल किया दृष्टिकोण वांछित बाह्य समाधान27,28में पुटिका निलंबन के प्रत्यक्ष कमजोर पड़ने है । हालांकि, यह भी पुटिका वितरण घनत्व कम हो जाती है । एक अंय रणनीति के लिए धीरे GUVs चारों ओर एक प्रवाह सेल कि समाधान के लिए अनुमति देता है और भाटा के नीचे बसे बाहरी समाधान विनिमय है । परेशान या यहां तक कि प्रवाह के साथ बुलबुले खोने से बचने के लिए, कम प्रवाह दर लागू कर रहे है8, जो इस दृष्टिकोण समय अक्षम renders । इसके अलावा, इन तरीकों में से न तो पूर्ण बाहरी समाधान विनिमय की गारंटी देता है । एक स्पष्ट समाधान के लिए बुलबुले स्थिर करने के क्रम में उंहें एक बाहरी समाधान विनिमय के दौरान खोने से बचने के लिए है । उदाहरण के लिए, biotinylated GUVs एक streptavidin-लेपित सतह29पर सीमित किया जा सकता है । हालांकि, इस दृष्टिकोण का पालन किया और इसलिए गैर का पालन झिल्ली क्षेत्रों30,31में संरचना रूपांतरों के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । झिल्ली तनाव३२थोपे में बुलबुले जाल करने के लिए चुंबकीय या बिजली के खेतों के आवेदन । एक पुटिका जाल करने के लिए ऑप्टिकल चिमटी को रोजगार एक संलग्न संभाल (यानी एक मनका) की आवश्यकता है, जबकि ऑप्टिकल स्ट्रेचर का उपयोग स्थानीय हीटिंग३३शामिल हो सकते हैं । GUVs की ट्रैपिंग भी अंतिम टुकड़ी३४के बिना उंहें प्लैटिनम तारों पर बढ़ द्वारा पूरा किया जा सकता है । यह हालांकि पैदावार बुलबुले जो अलग नहीं कर रहे है और जो आम तौर पर पतले लिपिड ट्यूब (तार) द्वारा तारों या अंय बुलबुले से जुड़े हैं ।

प्रस्तुत काम aforementioned सीमाओं को दूर करने के लिए रणनीतियों पर प्रकाश डाला गया । हम पहले सहज सूजन विधि का एक विस्तृत विवरण प्रस्तुत अनुकूलित और उच्च लवणता बफ़र्स में GUVs के उत्पादन के लिए अनुकूलित । हम तो कुशलतापूर्वक सरल कमजोर पड़ने या एक microfluidic डिवाइस के उपयोग से असममित समाधान की स्थिति बनाने के लिए दो दृष्टिकोण लागू. क्योंकि हमारा लक्ष्य अलग समाधान की स्थिति में GUVs की झिल्ली चरण राज्य के विश्लेषण है, बाद के वर्गों सफल सांख्यिकीय विश्लेषण और झूठी वर्गीकरण से बचने के लिए वर्तमान संकेतों के लिए मानदंड का वर्णन ।

विश्लेषण के रूप में अच्छी तरह के रूप में अलग तापमान के तहत इज़ोटेर्माल शर्तों के तहत प्रदर्शन किया गया । जबकि तापमान सीontrol आमतौर पर कार्यरत है, प्रयोगात्मक तापमान नियंत्रण कक्षों के बारे में विवरण शायद ही कभी वर्णित हैं । यहां, एक में घर बनाया सेटअप विभिंन तापमान शर्तों पर GUVs निरीक्षण प्रस्तुत किया है ।

Protocol

< p class = "jove_title" > 1. GUVs की सहज सूजन

< p class = "jove_content" > नोट: क्लोरोफॉर्म एक हानिकारक पदार्थ है, जो अत्यधिक अस्थिर है. एक धुएं हुड के तहत क्लोरोफॉर्म शामिल सभी आपरेशनों प्रदर्शन करते हैं । क्लोरोफॉर्म समाधानों के अंतरण और/या स्टोरेज के लिए प्लास्टिक labware जैसे पिपेट टिप्स या प्लास्टिक कंटेनर का उपयोग न करें । क्लोरोफॉर्म प्लास्टिक भंग करता है, जो समाधान को दूषित करता है । इसके बजाय ग्लास सिरिंज और ग्लास कंटेनर का इस्तेमाल करें । इसके अलावा, के रूप में वे झिल्ली के साथ बातचीत कर सकते है अशुद्धियों का परिचय से बचने के लिए संभव के रूप में साफ काम करते हैं । ध्यान दें कि अंतिम गुव तैयारी में ठेठ लिपिड सांद्रता micromolar रेंज में हैं, इस प्रकार है कि एकाग्रता रेंज में दोष झिल्ली व्यवहार पर मजबूत प्रभाव हो सकता है ।

  1. इसके अलावा बुनियादी उपकरणों से, निम्नलिखित मदों के लिए तैयार है.
    1. एक polytetrafluorethylene तैयार (PTFE, सामांयतः Teflon के रूप में जाना जाता है) आकार के लिपिड जमाव के लिए थाली ~ १.५ cm x १.५ cm और उपयुक्त मोटाई । एक तरफ Roughen की प्लेट ठीक सैड है.
      नोट: PTFE lipophobic है और अगर चिकनी क्लोरोफॉर्म समाधान द्वारा गीला नहीं किया जाएगा । PTFE प्लेट के दोनों ओर लिपिड जमाव के लिए सही पक्ष के बारे में भ्रम की स्थिति से बचने के लिए roughened किया जा सकता है । प्लेट मोटाई आसान हैंडलिंग के लिए चुना जाना चाहिए, जैसे कि यह बहुत लचीला नहीं है और आसानी से हाइड्रेट समाधान द्वारा कवर किया जा सकता है (देखें < सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा १ ). यहां हम ~ 2 मिमी मोटाई की प्लेटों का इस्तेमाल किया । एक बार roughened, PTFE प्लेट उचित सफाई (१.३ कदम) के बाद नए प्रयोगों के लिए reused किया जा सकता है ।
    2. उचित मात्रा (~ 15 एमएल) के अंतिम लिपिड फिल्म जलयोजन और पुटिका विकास के लिए एक सील कांच की शीशी तैयार करते हैं ।
    3. एक सील कांच कंटेनर जो ~ 15 मिलीलीटर कांच की शीशी में फिट बैठता है तैयार; यह लिपिड फिल्म पूर्व सूजन के लिए एक पानी संतृप्त वातावरण बनाने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा, < मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 1 .
  2. 1 के वांछित अनुपात में 4 मिमी लिपिड स्टॉक्स तैयार, 2-dioleoyl- sn -glycero-3-phospho-(1 & #39;-आरएसी-ग्लिसरॉल) (सोडियम नमक) (DOPG), अंडा sphingomyelin (eSM), और कोलेस्ट्रॉल (चौल), अतिरिक्त ०.१ मॉल के साथ% 1, 1 & #8242;-dioctadecyl-3 , 3, 3 & #8242;, 3 & #8242;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiIC 18 ) को कुल लिपिड एकाग्रता 4 मिमी. एक विलायक के रूप में क्लोरोफॉर्म का प्रयोग करें । सामग्री की तालिका देखें .
  3. अच्छी तरह से PTFE प्लेट और वाणिज्यिक dishwashing डिटर्जेंट, इथेनॉल के साथ ग्लास कंटेनर कुल्ला, और उस क्रम में क्लोरोफॉर्म और अंत में उंहें सूखी ।
  4. एक ग्लास सिरिंज, जमा और समान रूप से फैल 10-15 & #181; PTFE प्लेट के roughened पक्ष पर लिपिड शेयर के एल एक समान लिपिड फिल्म बनाने के लिए । अगर जरूरत हो तो समाधान फैलाने के लिए सिरिंज की सुई का प्रयोग करें ।
  5. PTFE प्लेट को एक साफ सतह पर रखें और desiccate 2 ज के लिए जमा लिपिड फिल्म के साथ मिलकर इसे ६० & #176; C को क्लोरोफॉर्म से दूर करें । सुविधा की खातिर, सुखाना के दौरान प्लेट को जरुर और अनसील 15 मिलीलीटर ग्लास कंटेनर में जमा कर दें ।
    नोट: उच्च तापमान सुनिश्चित करता है कि लिपिड फिल्म में एक सजातीय एकल तरल राज्य में है और यह सब बाद के चरणों ।
  6. के बाद सुखाना, एक स्तर है कि उछाल पर दस्तक करने के लिए नहीं की अनुमति नहीं है करने के लिए ऊपर पानी के साथ पूर्व सूजन ग्लास कंटेनर को भरने ~ 15 मिलीलीटर कांच की शीशी (~ 1 सेमी), देखें < मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 1 .
  7. कंटेनर में PTFE प्लेट के साथ ~ 15 मिलीलीटर कांच की शीशी डाल कर उसे ढक दें ताकि पानी से संतृप्त वातावरण उभर सके, < सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा 1b .
    नोट: भीतरी कंटेनर दीवारों पर गाढ़ा पानी सफल पानी वाष्प संतृप्ति के लिए एक अच्छा संकेत देता है ।
  8. चलो जमा लिपिड फिल्म पूर्व में बंद ग्लास कंटेनर के अंदर गज़ब ६० & #176; C for 4 h. इस समय अवधि के भीतर वांछित सूजन समाधान तैयार करते हैं ।
    नोट: पुटिका तैयारी जो कम तापमान पर आयोजित किया जा सकता के लिए, इस समय बहुत छोटा किया जा सकता है-कुछ मिनट के लिए नीचे-अगर गर्म पानी संतृप्त नाइट्रोजन या आर्गन पूर्व के बजाय सूजन के लिए प्रयोग किया जाता है ।
    1. तैयार २०० मिमी सुक्रोज या १०० मिमी NaCl, 10 मिमी Tris, पीएच ७.५ एचसीएल के साथ समायोजित और ६० & #176; सी करने के लिए सूजन समाधान बनाने के लिए.
  9. पूर्व की सूजन के बाद, कंटेनर के बाहर PTFE प्लेट के साथ ~ 15 मिलीलीटर गिलास ले लो । एक ०.४५ से जुड़े सिरिंज के साथ & #181; एम फ़िल्टर, जोड़ ~ 5 मिलीलीटर में सूजन समाधान की 4 मिलीलीटर गिलास शीशी में हाइड्रेट करने के लिए लिपिड फिल्म ।
    नोट: फिल्टर करने के लिए एक सुई फिक्सिंग सूजन समाधान की प्रविष्टि को आसान बनाता है । पूर्व-वार्मिंग सिरिंज और फिल्टर सूजन समाधान जोड़ते हुए लिपिड फिल्म के एक एकल तरल चरण राज्य को सुनिश्चित करने के लिए उचित हो सकता है । समाधान फ़िल्टरिंग को छोटा करता है (में-) जीवाणु या नमक का जैविक संदूषण हाला etc.
  10. सील the ~ 15 मिलीलीटर कांच की शीशी PTFE प्लेट पर हाइड्रेटेड लिपिड फिल्म धारण वाष्पीकरण को कम करने के लिए । यदि आवश्यकता हो तो सीलिंग बढ़ाने के लिए आयल फिल्म का प्रयोग करें । ६० & #176 पर हाइड्रेटेड लिपिड फिल्म छोड़ अंतिम गुव सूजन के लिए रात भर सी ।
< p class = "jove_title" > 2. हार्वेस्टिंग GUVs

< p class = "jove_content" > नोट: GUVs का एकत्रीकरण सूजन और PTFE सब्सट्रेट से अलग परिणाम में एक छोटे (~ 1 मिमी) बादल की तरह आंख से दिखाई देता है. कोई प्रतिदीप्ति डाई इस्तेमाल किया जाता है जब यह सफेद दिखाई देता है । अंयथा, यह fluorophore अवशोषण स्पेक्ट्रम के अनुसार रंग का है । DiIC 18 के अलावा मेघ गुलाबी को रेंडर करता है (< सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्रा 2 ) देखें । बुलबुले कुल में केंद्रित कर रहे है और कटाई यह पुटिका उपज अधिकतम ।

  1. नीचे कमरे के तापमान को बुलबुले के भीतर शांत ~ 1 h. कट ~ 1/10 क्लस्टर या बुलबुले के कुल के लिए एक पिस्टन पिपेट प्लास्टिक टिप के नुकीले छोर से छिद्र के माध्यम से फिट करने के लिए ।
    नोट: ठंडा दर विशेष रूप से महत्वपूर्ण है अगर ठोस तरल चरण जुदाई की उंमीद है क्योंकि यह ठोस डोमेन के आकार बदल जाता है । यहां, ठंडा करने के लिए नीचे, हम संपर्क में आकार के एक धातु ब्लॉक के साथ नमूना रखा 5 सेमी x ९.५ cm x ७.५ cm (एच एक्स एल एक्स डब्ल्यू) है कि कमरे के तापमान के भीतर ठंडा करने के लिए नीचे 1 h.
  2. पिपेट अप क्लस्टर एक साथ सूजन समाधान की एक उपयुक्त मात्रा के साथ (< मजबूत वर्ग देखें = "xfig" > चित्रा 2 ). फिर से सूजन समाधान में कुल को निलंबित सममित समाधान की स्थिति, या किसी भी वांछित आईएसओ परासरणी समाधान असममित समाधान शर्तों बनाने के लिए बनाने के लिए ।
    नोट: मात्रा की निचली सीमा पूरी तरह से काटी जाने वाली कुल के आकार तक सीमित है । बाहरी समाधान पतला है और क्रम में सटीक एकाग्रता का आकलन करने के लिए, पुटिका समाधान की मात्रा को ध्यान में रखा जाना है ।
< p class = "jove_title" > 3. चरण राज्य मूल्यांकन के लिए GUVs का अवलोकन प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर

< p class = "jove_content" > नोट: GUVs DiIC 18 के साथ एक फ्लोरोसेंट मार्कर के रूप में मैगनीज थे । यह fluorophore रूप में तरल-आदेश (Ld) चरण में विभाजन । यह GUVs में चरण जुदाई से उत्पंन डोमेन के प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी अवलोकन के लिए अनुमति देता है । हम महामारी-प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ चरण राज्य मूल्यांकन प्रदर्शन किया । सिद्धांत रूप में, इन टिप्पणियों भी व्यावहारिक फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी (CLSM) है, जो भी संकेत ठहराव ( जैसे झिल्ली unilamellarity निर्धारित करने के लिए अनुमति देता है) का उपयोग कर रहे हैं । हालांकि, CLSM अधिक परिष्कृत उपकरणों की आवश्यकता है और (आमतौर पर) महामारी-प्रतिदीप्ति टिप्पणियों स्कैनिंग से पहले किसी भी मामले में सहायक होते हैं ।

  1. एक उद्देश्य पर फैसला ( जैसे एक ०.६ संख्यात्मक एपर्चर (एनए) के साथ 40X आवर्धन जैसे यहां इस्तेमाल किया) के लिए GUVs का पालन करें और यह लगातार उपयोग करते है जब अलग solutio में एक ही रचना के चरण राज्यों की तुलनाn शर्तें । उपयोग fluorophore के साथ प्रतिदीप्ति टिप्पणियों को सक्षम करने के लिए उपयुक्त उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य फिल्टर का प्रयोग करें ( जैसे उत्तेजना पर ५६० & #177; ४० एनएम और ६३० & #177; ७५ के बीच में एक ५८५ एनएम बीम अलगानेवाला के साथ DiIC 18 के लिए इस्तेमाल के रूप में) ।
    नोट: एक चरण आरेख के भीतर चरण राज्य सीमाओं संकल्प पर निर्भर करता है कि उद्देश्य प्राप्त के रूप में यह सूक्ष्म डोमेन के ंयूनतम आकार को परिभाषित करता है पता लगाया जाएगा ।
  2. विश्लेषण के लिए, केवल GUVs जो निम्न गुणवत्ता मापदंड को पूरा का चयन करें ।
    1. विभिन्न बुलबुले के दृश्य अवलोकन द्वारा गुव झिल्ली के unilamellarity सुनिश्चित करने और उनकी तीव्रता की तुलना; सबसे कम प्रतिदीप्ति उत्सर्जन की तीव्रता के साथ बुलबुले unilamellar
      . नोट: सहज सूजन पुटिका बैचों उपज सकता है जहां विशाल बुलबुले का एक बड़ा अंश unilamellar.
      2. नहीं कर रहे है
    2. माना जाता है कि unilamellar विशाल बुलबुले के प्रतिदीप्ति उत्सर्जन तीव्रता को बढ़ाता है और आबादी के भीतर बिखरने के लिए इसी संकेत की जांच करके एक अतिरिक्त जांच करते हैं । यदि विभिंन GUVs के बीच कोई पूर्णांक मतभेद मनाया जाता है, उन सभी को unilamellar होने की संभावना है ।
      नोट: यदि बुलबुले पारंपरिक लिपिड से तैयार कर रहे है जैसे कि सहज सूजन के रूप में एक स्थापित विधि का उपयोग कर, unilamellar बुलबुले का पता लगाने के लिए ऊपर वर्णित दृष्टिकोण पर्याप्त है । यदि एक नया गुव तैयारी प्रोटोकॉल की स्थापना या अपरंपरागत लिपिड का उपयोग कर, और अधिक विस्तृत अध्ययन unilamellarity पुष्टि करने के लिए आवश्यक हो जाएगा । उदाहरण के लिए, एक नए प्रोटोकॉल द्वारा तैयार बला बुलबुले के झिल्ली प्रतिदीप्ति संकेतों एक स्थापित विधि द्वारा तैयार GUVs की तुलना में किया जा सकता है; या झिल्ली पोरे प्रोटीन & #945;-hemolysin पुटिका झिल्ली में डाला जा सकता है < सुप वर्ग = "xref" > २४ . डाई बुलबुले के बाहर करने के लिए जोड़ा तो उनके इंटीरियर में प्रवेश करेंगे या नहीं, विश्वविद्यालय की उपस्थिति पर निर्भर करता है-या multilamellar बुलबुले, क्रमशः.
    3. सुनिश्चित करें कि गुव डोमेन के लिए एक उचित ंयूनतम व्यास है अभी भी पहचानने योग्य हो ।
    4. सुनिश्चित करें कि गुव (लगभग) फैलाया या पालन भागों या आंतरिक संरचनाओं के रूप में कोई दोष नहीं है ।
  3. एक माइक्रोस्कोप स्लाइड पर गुव निलंबन के एक aliquot हस्तांतरण और इसे ठीक से सील । एक अवलोकन चैंबर तैयार करें.
  4. माइक्रोस्कोप स्लाइड पर नमूना जमा । एक केंद्रीय परिपत्र कटआउट के साथ एक सिलिकॉन स्पेसर द्वारा इसे चारों ओर । संदूषण से बचने के लिए, सुनिश्चित करें कि स्पेसर नमूना के साथ संपर्क में नहीं है । सिलिकॉन स्पेसर के शीर्ष पर एक कवर पर्ची रखकर इंटीरियर सील.
    नोट: के बजाय सिलिकॉन स्पेसर एक सिलिकॉन तेल या घर का बना polydimethysiloxane (PDMS) स्पेसर्स का उपयोग कर सकते हैं । चैंबर सील नमूना के ंयूनतम वाष्पीकरण सुनिश्चित करता है और आईएसओ-osmolar शर्तों का कहना है ।
  5. के लिए ~ 5 मिनट के लिए नमूना छोड़ दो संभव डोमेन के equilibration ।
    नोट: pipetting से यांत्रिक तनाव झिल्ली डोमेन मिश्रण है, जो सुधार के लिए समय की जरूरत हो सकती है ।
  6. खुर्दबीन स्टेज पर नमूना के साथ माइक्रोस्कोप स्लाइड जगह और एक सांख्यिकीय दृष्टिकोण में गुव बैच के चरण राज्य का विश्लेषण. प्रति बैच 30 से अधिक GUVs का निरीक्षण करें और उनके चरण राज्य निर्धारित करें गुव चरण राज्य के मूल्यांकन के लिए निम्नलिखित मानदंडों के अनुसार DiIC 18 (< सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा 3 ).
    नोट: उनके विकास के बाद, बुलबुले (उदाहरण के लिए) बंद या नैनोट्यूब के माध्यम से झिल्ली सामग्री के आदान प्रदान नवोदित डोमेन के कारण उनके व्यक्तिगत रचनाओं बदल सकते हैं । GUVs इसलिए एक ही बैच के भीतर संरचना रूपांतरों का प्रदर्शन < सुप वर्ग = "xref" > ३५ .
    1. एकल तरल चरण या तो तरल-आदेश दिया जा रहा है (लो) या तरल-आदेश दिया (Ld): सुनिश्चित करें कि समग्र गुव आकार गोलाकार और चिकनी है और DiIC 18 झिल्ली में वितरित homogeneously है (में ऊपरी और नीचे पैनलों में पहली छवियां < सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा ३ ).
    2. दो चरण लो + Ld सह-अस्तित्व राज्य: सुनिश्चित करें कि बुलबुले प्रदर्शन डोमेन है कि चिकनी सीमाओं के साथ परिपत्र दिखाई देते हैं; DiIC 18 विभाजन व्यवहार डोमेन के अनुसार चमकदार लाल (Ld) या गहरे लाल/काले (लो) (दूसरा छवियां ऊपरी और < मजबूत वर्ग में नीचे पैनलों = "xfig" > चित्रा 3 , झूठे रंग में). जाँच करें कि डोमेन पुटिका सतह पर फैलाना करने के लिए स्वतंत्र हैं और आपस में जुड़ सकते हैं.
    3. दो चरण ठोस (s) + तरल (s + Lo या s + Ld) सह-अस्तित्व राज्य: सुनिश्चित करें कि डोमेन प्रकट हो सकता है उंगली की तरह या गोलाकार लेकिन कोणीय सीमाओं के साथ (< मजबूत वर्ग में ऊपरी और निचले पैनलों में तीसरी छवियों = "xfig" > चित्रा 3 ). एक ठोस (काला) पृष्ठभूमि है कि प्रसार प्रदर्शित नहीं करेगा पर तरल डोमेन (लाल) का निरीक्षण करें । इसके विपरीत, ठोस (काला) डोमेन के लिए एक तरल पृष्ठभूमि (लाल) पर फैलाना मुक्त हो जाएगा ।
    4. तीन चरण S + Lo + Ld सह-अस्तित्व: प्रदर्शित डोमेन के तीन प्रकार के निरीक्षण: (i) कोणीय काले डोमेन (ओं), (द्वितीय) मंद (लो) और (iii) उज्ज्वल (Ld) लाल डोमेन में एंबेडेड ।
  7. परमशॆवर की जनसंख्या के लिए चरण राज्य है कि एक यादृच्छिक नमूने के बीच प्रमुख होना निर्धारित किया गया है, के रूप में निंनलिखित उदाहरणों में: GUVs
      यदि 20 एकल तरल
    1. और 15 लो + Ld GUVs मनाया जाता है, पर विचार करने के लिए बैच एक एकल तरल चरण.
    2. अगर 10 एस + एल GUVs, 30 लो + ld GUVs, और 25 एकल तरल GUVs मनाया जाता है, एक लो + Ld होने के लिए बैच पर विचार करें ।
< p class = "jove_title" > 4. Microfluidic डिवाइस में गुव अवलोकन

< p class = "jove_content" > नोट: पहले Microfluidic डिवाइस बनाना; Microfluidic डिवाइस डिज़ाइन और असेंबली का विवरण कहीं और दिया गया है < सुप वर्ग = "xref" > ३६ , < सुप वर्ग = "xref" > ३७ ; see < सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्र ४ संक्षिप्त वर्णन.

  1. तैयार ताजा गुव सूजन समाधान (या तो नमक या सुक्रोज कदम 1.8.1 के अनुसार) और यह एक ०.४५ & #181 के माध्यम से फिल्टर; मी फिल्टर.
    नोट: बहती समाधानों में कोई अशुद्धियों microfluidic डिवाइस को रोकना हो सकता है ।
  2. कट २०० & #181; एल पिस्टन पिपेट प्लास्टिक युक्तियां और उंहें डिवाइस के PDMS भाग में छेद में जगह है । Add १०० & #181; l और 5 & #181; l ताजा और फ़िल्टर्ड सूजन जलाशय के समाधान (देखें < सबल वर्ग = "xfig" > चित्र 5 ) और प्रत्येक कट पिपेट युक्तियाँ, क्रमशः. एक स्विंग रोटर में 10 मिनट के लिए ९०० x g पर पूरे डिवाइस के केंद्रापसारक करने के लिए पहले डिवाइस को भरने और हवा को दूर करने के लिए ।
  3. पूर्व-1 मिलीलीटर ग्लास सिरिंज और सूजन समाधान के साथ संलग्न टयूबिंग भरें और 0 मिलीलीटर के लिए सवार स्थिति चाल.
  4. उपकरण के द्रव आउटलेट में टयूबिंग जगह और सिरिंज पंप में सिरिंज जगह है ।
    नोट: सिरिंज और सिरिंज पंप ब्रांड की पसंद महत्वपूर्ण नहीं है. हालांकि, ग्लास सीरिंज अधिक सटीक होते हैं और पम्प को & #181 में ऑपरेट करने में सक्षम होना चाहिए; L/मिन फ्लो रेंज.
  5. microfluidic नियंत्रण परत के 8 की सुविधा के लिए एक कस्टम दबाव नियंत्रण इकाई कनेक्ट (देखें < मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 5 ). दबाव नियंत्रण इकाई के लिए 3 बार (एयर, नाइट्रोजन या आर्गन) के लिए दबाव सेट, लेकिन बंद स्थिति के लिए microfluidic डिवाइस के लिए वाल्व सेट.
  6. जगह microfluidic डिवाइस, अब सिरिंज पंप और दबाव नियंत्रण इकाई से जुड़े, एक औंधा फोकल माइक्रोस्कोप मंच पर.
    1. एक ही आवर्धन के साथ एक उद्देश्य का उपयोग करें और ना के रूप में थोक टिप्पणियों के दौरान । यदि चरण ३.७ में समझाए गए चरणों के आधार पर नियंत्रण करें यदि एक और उद्देश्य भिंन समाधानों पर आधारित अवलोकन कलाकृतियों से बचने के लिए उपयोग किया जाता है, तो वही बने रहते हैं ।
  7. लोड GUVs ।
    1. पहले, पिपेट सब दूर लेकिन 25 से ५० & #181; ल समाधान का जो जलाशय में रह गया है । Add १५० & #181; गुव सॉल्यूशन के एल (स्टेप 1.8.1 के अनुसार या तो सुक्रोज या नमक में, लेकिन स्टेप ४.१ में डिवाइस को पहले से भरने के लिए इस्तेमाल किए गए सॉल्यूशन से मेल खाती है) जलाशय को और कोमल pipetting से मिक्स कर दीजिये. सिरिंज को 10 & #181 पर सेट करें; L/वापस मोड में लगभग 20 मिनट के लिए या जब तक अधिक से अधिक ९०% जाल के कब्जे में है प्रवाह दर ।
      नोट: जलाशय को सूखा चलाने की अनुमति नहीं दी जानी चाहिए । यदि ऐसा होता है, हवा बुलबुले माइक्रो चैनलों में प्रवेश करेंगे । reservoi में अधिक गुव समाधान जोड़ेंआर लोड करने के दौरान लेकिन डिवाइस में pipetting जब हवा बुलबुले परिचय नहीं करने के लिए ध्यान रखना.
  8. खुला दबाव नियंत्रण इकाई वाल्व के सभी microfluidic अंगूठी बंद करने के लिए-जाल के आसपास वाल्व/GUVs । सिरिंज पंप सेट करने के लिए 0 & #181; L/ 1 घंटे के बाद, GUVs और रिकॉर्ड फोकल छवियों का निरीक्षण । उत्तेजित और fluorophore इस्तेमाल के अनुसार GUVs का पता लगाने ( जैसे उत्तेजना पर ५६१ एनएम और ५८०-६२० एनएम के बीच DiIC 18 के लिए के रूप में पता लगाने) । चरण ३.६ से एक ही चयन मापदंड का उपयोग करें, और ध्यान रखें प्रत्येक गुव के स्थान पर ध्यान दें ( अर्थात स्तंभ और पंक्ति क्रमांक को , देखें < सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा ४ )
  9. आदान-प्रदान समाधान आसपास GUVs
    1. ने सिरिंज पंप सेट को 0 & #181; l/मिन और पिपेट दूर सभी लेकिन 25 से ५० & #181; जलाशय से गुव समाधान के एल. जोड़ १५० & #181; 2 समाधान के एल (सुक्रोज या चरण 1.8.1 के अनुसार नमक में, GUVs के बाहर वांछित समाधान पर निर्भर करता है) जलाशय और कोमल pipetting द्वारा मिश्रण । दूर पिपेट सभी लेकिन 25 से ५० & #181; जलाशय से बफर सॉल्यूशन के एल.
      नोट: यह समाधान ०.४५ & #181; m फ़िल्टर भी का उपयोग कर फ़िल्टर किया जा करने के लिए है ।
  10. जलाशय में समाधान को अच्छी तरह से प्रतिस्थापित करने के लिए पिछले चरण को ंयूनतम 5 बार दोहराएं । सिरिंज को 10 & #181 पर सेट करें; L/सूक्ष्म चैनलों में समाधान को प्रतिस्थापित करने के लिए ~ 10 मिनट के लिए वापस मोड में प्रवाह दर ।
  11. कम करने के लिए प्रवाह दर को 1 & #181; L/न्यूनतम 8 दबाव नियंत्रण यूनिट वाल्व खोलने के लिए 2 एस और फिर बंद (खोलने और microfluidic अंगूठी वाल्व के समापन में जिसके परिणामस्वरूप) । प्रवाह दर को 0 & #181; L/मिनट फिर से सेट करें.
  12. 1 घंटे के बाद, GUVs और रिकॉर्ड फोकल छवियों का पालन करें । फिर, ध्यान रखना करने के लिए कॉलम और माइक्रो चैंबर की पंक्ति जहां प्रत्येक गुव से पहले और बाहरी बफर एक्सचेंज के बाद एक ही गुव की तुलना की अनुमति स्थित है ।
< p class = "jove_title" > 5. डिजाइन और तापमान के अंशांकन-नियंत्रण कक्ष

< p class = "jove_content" > नोट: तापमान नियंत्रण के लिए एक उपयुक्त कक्ष या तो वाणिज्यिक या घर निर्मित प्राप्त किया जा सकता है । तापमान नियंत्रण आमतौर पर एक जल स्नान या एक Peltier तत्व के लिए गुव नमूना के साथ चैंबर के थर्मल युग्मन द्वारा प्राप्त की है । यहाँ, हम एक बाहरी पानी थर्मोस्टेट के साथ एक घर का निर्माण तापमान नियंत्रण कक्ष के डिजाइन और लक्षण वर्णन. ऐसे थर्मोस्टेट कई प्रयोगशालाओं में उपलब्ध हैं या पुराने उपकरणों जैसे पराबैंगनीकिरण या स्पेक्ट्रोमीटर से उबारा जा सकता है.

  1. एक गर्मी प्रवाह चैंबर इकट्ठा, यहां, एक एल्यूमीनियम ब्लॉक से बाहर कर दिया, के रूप में एक जल स्नान के लिए connectors के साथ < मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 6 में दिखाया गया है । शीर्ष और तल पर उद्घाटन सील और ब्लॉक करने के लिए gluing कवर चश्मे से नमूने के उज्ज्वल क्षेत्र अवलोकन सक्षम करें ।
  2. जहां नमूना रखा जाएगा और पिपेट की एक छोटी बूंद के बारे में १०० & #181; L कदम 1.8.1 के अनुसार प्रयोगों में प्रयुक्त समाधान के एल के प्रवाह कक्ष फ्लिप. वैकल्पिक रूप से, एक फाइबर ऑप्टिक तापमान जांच ( उदा FISO FTI-10) डालें या एक उचित एकाग्रता में तापमान के प्रति संवेदनशील डाई जोड़ें, उदा ५०० & #181; M Rhodamine B.
  3. अंगूठी आकार या कुछ अंय स्पेसर (PTFE या रबर) में जमा सिलिकॉन तेल का उपयोग कर गुव अवलोकन चैंबर को इकट्ठा करने और एक ०.१७ & #181; एम कवर ग्लास के साथ सील । सुनिश्चित करें कि ड्रॉप सील एजेंट या स्पेसर के साथ संपर्क में नहीं है अशुद्धियों की शुरूआत से बचने के लिए ।
  4. धीरे विधानसभा उल्टा बारी और यह करने के लिए उपयुक्त टयूबिंग के साथ बाहरी पानी थर्मोस्टेट कनेक्ट । किसी भी पानी के लीक होने पर विशेष ध्यान दें ।
  5. बाहरी पानी थर्मोस्टेट पर सबसे कम वांछित तापमान सेट और जब तक तापमान संवेदक के पढ़ने स्थिर है प्रणाली equilibrate करते हैं; equilibration के लिए आवश्यक समय प्रणाली के ंयूनतम प्रतिक्रिया समय का अनुमान दे देंगे ।
  6. कक्ष का उपयोग करने के लिए प्रारंभ करने से पहले नियंत्रण प्रयोग कम से एक बार करते हैं ।
    1. समाधान तापमान को मापने (एक ग्लास फाइबर जांच के साथ उदा ) और यह ब्याज की तापमान रेंज पर थर्मोस्टेट के पढ़ने के लिए तुलना करें ।
      2. एक ंयूनतम थर्मोस्टेट पढ़ने और मापा तापमान के रैखिकता से ऑफसेट के लिए
    2. की जांच करें ।
    3. अवलोकन चैंबर एक तापमान संवेदनशील डाई का उपयोग कर के अंदर एक तापमान ढाल के लिए जांच करें । नीचे कवर स्लिप से अलग दूरी के लिए प्रतिदीप्ति तीव्रता या प्रतिदीप्ति लाइफटाइम इमेजिंग माइक्रोस्कोपी (FLIM) के माध्यम से समाधान तापमान को मापने < सुप वर्ग = "xref" > ४० . इसके अतिरिक्त जाँच करें यदि गुव अवलोकन के क्षेत्र में कोई तापमान ग्रैडिएंट है, जैसा कि < सबल वर्ग में दिखाया गया है = "xfig" > चित्रा ७ .
< p class = "jove_title" > 6. भिन्न तापमान पर गुव अवलोकन

< p class = "jove_content" > नोट: सामान्यतया, GUVs जिसकी झिल्ली संभावित चरण-अलग है और जो अवलोकन तापमान पर समरूप होने के लिए प्रकट करने के लिए T obs , चरण पृथक्करण होगा टी obs नीचे प्रेरित (कि क्या मनाया जाता है तापमान की जांच की सीमा पर निर्भर करता है) । इसके विपरीत, चरण अलग बुलबुले टी obs से अधिक तापमान पर समरूप बन जाना चाहिए । हालांकि, यह एक विशेष (जटिल) लिपिड संरचना के लिए मामला होने की जरूरत नहीं है और यह हमेशा पूरे सुलभ तापमान रेंज स्कैन करने के लिए दिलचस्प हो सकता है < सुप क्लास = "xref" > ३८ . चरण संक्रमण तापमान के अवलोकन और मूल्यांकन के लिए प्रोटोकॉल तापमान नियंत्रण के लिए उपयोग किए गए विशिष्ट विधि पर निर्भर नहीं करता है ।

  1. तापमान अवलोकन चैंबर धारा 5 के अनुसार इकट्ठा, फाइबर ऑप्टिक तापमान जांच या तापमान के प्रति संवेदनशील fluorophore.
    2. को छोड़
  2. कमरे के तापमान (23 & #176; C) के लिए बाह्य जल स्नान सेट करें और 10-15 min.
    3. के लिए सिस्टम equilibrate दें
  3. चरण ३.६ से मानदंड का उपयोग कर बुलबुले अलग की संख्या गिनती; गुव जनसंख्या के समग्र चरण राज्य प्रणाली के संक्रमण के तापमान के क्षेत्र के बारे में एक संकेत दे देंगे । यदि पुटिका आबादी के पार चरण राज्य बल्कि विषम है सीधे ६.५ कदम के लिए जाओ ।
  4. वृद्धि (यदि बुलबुले के बहुमत चरण अलग कर रहे हैं) या कम (बुलबुले के बहुमत समरूप रहे हैं) मोटे अंतराल में तापमान ( उदा 1-2 & #176; C) और के बारे में 2 मिनट के लिए प्रणाली equilibrate दो । पुनः के चरण राज्य का मूल्यांकन एक यादृच्छिक नमूना के माध्यम से गुव आबादी और पुटिका जनसंख्या एक विषम चरण राज्य से पता चलता है जब तक तापमान बदलती हैं.
  5. एक बार जनसंख्या चरण संक्रमण के बिंदु के पास है ( यानी व्यक्तिगत GUVs के बीच चरण राज्यों के बजाय विषम हैं), तापमान अंतराल घटाएं ( उदा ०.५ & #176; C) संकल्प को बढ़ाने के लिए. चलो प्रणाली equilibrate ~ 2 मिनट के लिए और फिर से एक यादृच्छिक नमूना के माध्यम से गुव जनसंख्या के चरण राज्य का मूल्यांकन ।
  6. एक बार चरण संक्रमण के बिंदु पारित कर दिया है, जब तक सभी GUVs अब समरूप या चरण अलग कर रहे हैं, तापमान अलग रखना क्रमशः ।
    7. equilibration बार पर्याप्त हैं या नहीं, यह मूल्यांकन करने के लिए हिस्टैरिसीस के लिए
  7. जाँच करें ।
    1. तापमान स्कैन की दिशा बदल, i.ई. यदि स्कैन तापमान बढ़ाने के लिए किया गया था, तापमान कम करके स्कैन करें ।
    2. गुव जनसंख्या चरण राज्य अनुपात ( उदा ८०% चरण-अलग) का आकलन करने के लिए तापमान का न्यूनतम एक सबसेट चुनें.
    3. चरण राज्य अनुपात में दोनों दिशाओं के बीच पर्याप्त विचलन हिस्टैरिसीस इंगित करता है, तो तापमान चरण आकार कम और/या ६.४ और ६.५ चरणों में equilibration समय बढ़ाएँ ।
    4. यदि कोई हिस्टैरिसीस समान अनुपात द्वारा इंगित किया गया है, तो चरण आकार और/equilibration समय बढ़ाने पर विचार करें ।
  8. प्लाट का तापमान के मुकाबले चरण राज्य अनुपात । ठहराव के लिए, डेटा को किसी उपयुक्त मॉडल में फ़िट करें (< सशक्त वर्ग = "xfig" > चित्र 8 ).
    नोट: चरण संक्रमण घटता सामांयतः एक sigmoidal पथ सुविधा और sigmoidal लैटिस मॉडल फिटिंग मापदंडों का एक उचित सेट प्रदान करता है:
    < img alt = "समीकरण 1" src = "//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56034/56034eq1v2.jpg"/>
    y : समान के अंश/चरण-पृथक GUVs
    एक १ : प्रारम्भिक अंश मान
    a 2 : अंतिम अंश मान
    t : तापमान
    t mix : तापमान आधा-मैक्सिमा y
    जैसा y का अंश है समरूप GUVs, एक 1 और एक 2 क्रमशः 0 और 1 के लिए तय किया जाना चाहिए । के रूप में miscibility संक्रमण के लिए sigmoidal माना जाता है, एक बार भिंन मान 0 होना करने के लिए मापा जाता है एक निश्चित तापमान पर नीचे तापमान सीमा के सभी अंश मान 0 हो । इसके विपरीत, एक बार अंश मान एक विशेष तापमान पर 1 है, ऊपर तापमान रेंज के सभी अंश मूल्यों 1.
    9. माना जाता है

Representative Results

गुव सूजन

सहज सूजन दृष्टिकोण यहां वर्णित के साथ, GUVs DOPG, eSM, और चौल से बना २१० मिमी सुक्रोज या १०० मिमी NaCl, 10 मिमी Tris, पीएच ७.५ एक दृश्य कुल बनाने में रातोंरात हो गए थे । कुल संचयन उच्च पुटिका पैदावार सुनिश्चित करता है । सूजन समाधान में resuspension सममित ट्रांस-झिल्ली समाधान परिस्थितियों में हुई । असममित शर्तों बनाने के लिए, कुल एक आईएसओ-osmolar सुक्रोज या उच्च लवणता समाधान में reसस्पैंड कर दिया गया था, क्रमशः (चित्रा 2). परिणामस्वरूप कमजोर पड़ने एक अर्ध बाहरी समाधान मुद्रा के अनुरूप है, जबकि GUVs की संख्या के कमजोर पड़ने को कम करने ।

प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग GUVs के चरण आरेख मानचित्रण

चरण-विशिष्ट DiIC के ०.१ मॉल% की उपस्थिति व्यापक क्षेत्र प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के माध्यम से अपने चरण राज्यों के अवलोकन के लिए अनुमति दी GUVs में18 . बुलबुले का प्रदर्शन एस एल चरण जुदाई एक 63x के माध्यम से मनाया गया/1.2 na ठीक से संरचित उंगली की तरह डोमेन को हल करने में सक्षम हो । शेष सभी मामलों के लिए, 40x/0.6 NA उद्देश्य का उपयोग किया गया था । GUVs के दृश्य निरीक्षण के दौरान कलाकृतियों से बचने के लिए और reproducibility को अधिकतम करने के लिए, कुछ मानदंडों निर्धारित किया गया था कि जो बुलबुले के लिए चरण राज्य विश्लेषण के लिए विचार करने के लिए (प्रोटोकॉल कदम ३.६) ।

GUVs से तैयार त्रिगुट DOPG/eSM/चौल या उच्च सुक्रोज समाधान में सूजन अनुपात की एक विस्तृत श्रृंखला के मिश्रण और कमरे के तापमान पर मनाया लवणता लो या Ld चरणों, लो + Ld, और एस + एल चरण जुदाई, देखें चित्रा 3। चित्रा 9 exemplarily दोषपूर्ण बुलबुले से पता चलता है, जो डेटा विश्लेषण में शामिल नहीं किया जाना चाहिए और यह भी पता चलता है कैसे multilamellar बुलबुले की पहचान करने के लिए ।

उनके अज्ञात इतिहास के कारण, GUVs के भीतर बैच संरचना भिंनता३५प्रदर्शित करने की संभावना है । इसलिए, एक विशेष संरचना के समग्र चरण राज्य एक सांख्यिकीय दृष्टिकोण में निर्धारित किया गया था । एक निश्चित लिपिड संरचना की गुव आबादी चरण राज्य है कि एक यादृच्छिक नमूना (प्रोटोकॉल ३.६ कदम) में प्रमुख होने के लिए मनाया गया था करने के लिए जिंमेदार थे । फिर भी, लो + Ld सह-अस्तित्व क्षेत्र के करीब रचनाओं अक्सर जहां प्रमुख चरण राज्य एक संकीर्ण बहुमत बना बैचों झुकेंगे । इस तरह के अस्पष्ट मामलों के लिए, दृश्य निरीक्षण के कम से तीन स्वतंत्र नमूनों के साथ दोहराया गया था । समान चरण राज्य के साथ बुलबुले के अंश (उदा प्रदर्शन Lo + Ld चरण जुदाई) यादृच्छिक नमूनों के भीतर मौजूद परीक्षण जो अंतिम परिणाम (चित्रा 10) के रूप में लिया गया था की संख्या से अधिक औसत था.

वर्णित प्रोटोकॉल DOPG, eSM, और उच्च लवणता और सुक्रोज समाधान में चौल के विभिंन अनुपात की एक विस्तृत श्रृंखला में पर्याप्त गुव विकास के परिणामस्वरूप । त्रिगुट चरण आरेख के भीतर व्यापक क्षेत्रों सममित के तहत के रूप में अच्छी तरह से असममित उच्च लवणता समाधान की स्थिति (चित्र 11) के तहत मैप किया जा सकता है । भिन्न समाधान शर्तों के तहत स्वीकार्य पुटिका चरण व्यवहार में अंतर9विवरण में कहीं पर चर्चा की गई ।

microfluidic विधि का उपयोग करते हुए पूर्ण बफ़र exchange के बाद चरण व्यवहार की टिप्पणियों

बाहर सूजन समाधान के अवशेषों में कमजोर पड़ने परिणाम द्वारा असममित समाधान की स्थिति का निर्माण । हमारे microfluidic दृष्टिकोण एक पूर्ण बाहरी समाधान विनिमय के लिए अनुमति देता है । चित्र 5 ए microfluidic डिवाइस पूरी तरह से फोकल माइक्रोस्कोपी मंच पर एक साथ द्रव आउटलेट और दबाव नियंत्रण की सुविधा के साथ इकट्ठे से पता चलता है । ट्यूबों ९० ° धातु पाइप के माध्यम से जुड़े हुए है ऊपर से संचारित प्रकाश इमेजिंग के लिए अंतरिक्ष की अनुमति ।

microfluidic डिवाइस के भीतर अवलोकन के लिए, एक 63x/1.2 na पानी विसर्जन उद्देश्य लेंस के साथ एक फोकल माइक्रोस्कोप लागू किया गया था । थोक में पिछले टिप्पणियों के साथ के रूप में, DiIC18 झिल्ली दाग करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । जब डिवाइस में फंसे GUVs के चरण राज्य की टिप्पणियों बनाने, देखभाल के लिए डेटा गलत व्याख्या नहीं लिया जाना चाहिए । पदों के लिए GUVs के करीब निकटता के कारण, उत्तेजना और उत्सर्जन प्रकाश पथ आंशिक रूप से डोमेन के झूठी उपस्थिति के लिए अग्रणी PDMS द्वारा अवरुद्ध हो सकता है (चित्र 12) । यहां, प्रेषित प्रकाश का पता लगाने के पदों पर GUVs की स्थिति के लिए जांच करने के लिए उपयोगी है । इस अवांछित प्रभाव विशेष रूप से कम 10 व्यास में µm के छोटे GUVs के लिए प्रमुख है । इन मामलों में आंकड़ों को खारिज कर दिया गया । चित्रा 13A में फोकल छवि एक planar पुटिका अनुभाग है कि एक लो गुव पुटिका पर मौजूद डोमेन पार दिखाता है । इस मामले में, planar पार अनुभाग और ऊपर या नीचे अनुभाग नीचे स्कैन गुव के उस की तुलना में अपने छोटे आकार के कारण डोमेन नहीं दिखाया जाएगा, यही वजह है कि यह याद किया गया है और पुटिका एक सजातीय चरण राज्य में माना जाता है । इसलिए, पूरे गुव सतह का निरीक्षण करने के लिए एक फोकल z-स्टैक का उपयोग किया जाना चाहिए । व्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोपी के लिए, यह एक मुद्दा नहीं हो सकता है क्योंकि पूरे पुटिका एक बार में imaged किया जा सकता है ।

अंत में, उदाहरण GUVs के पहले और बाहरी समाधान के आदान प्रदान के बाद जहां यह स्पष्ट है क्या झिल्ली के चरण राज्यों रहे है (चित्रा 14) । प्रत्येक डिवाइस (एक एकल गुव जाल करने के लिए पदों की एक जोड़ी के साथ प्रत्येक ६० मंडलों है), उपकरण प्रति दसियों प्रयोगों की अनुमति ( चित्रा 4देखें). हालांकि, कुछ GUVs बाह्य समाधान exchange के दौरान खो हो सकता है । यह निंन चरणों के द्वारा कम किया जा सकता है: 1) पदों पर गुव आसंजन/टूटना को रोकने के लिए गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) कोटिंग का उपयोग करना; कोटिंग ६० मिनट और बाद में काम कर रहे बफर के साथ धोने के लिए 20 मिलीग्राम/एमएल BSA के लिए चैंबर दीवारों को उजागर द्वारा किया जाता है । एक और चिपकने वाला अणु है कि इस्तेमाल किया जा सकता है पाली (एल lysine) है-भ्रष्टाचार-पाली (ईथीलीन ग्लाइकोल)३९। 2) सावधान परासरणी भीतरी और बाहरी समाधान के मिलान झूलता हुआ GUVs, जो पदों के केंद्र या GUVs के फटने के माध्यम से पारित कर सकता से बचने के लिए । 3) गुव तैयारी प्रक्रिया का अनुकूलन से बड़ा बुलबुले प्राप्त करने के लिए ~ 8 व्यास में µm पदों के केंद्र के माध्यम से पारित होने को रोकने के लिए ।

गुव चरण राज्यों के अवलोकन के लिए तापमान नियंत्रित चैंबर के डिजाइन और लक्षण वर्णन

हम बाहरी पानी थर्मोस्टेट (चित्रा 6) के लिए कनेक्शन सुविधाओं जो एक साधारण प्रवाह चैंबर, बनाया. हम प्राप्तएक एल्यूमीनियम ब्लॉक के मिलिंग द्वारा चैंबर । सामान्य तौर पर, कक्ष सामग्री गर्मी प्रवाहकीय होने की जरूरत नहीं है, नमूना के रूप में चित्रा घमण्ड और 6Cमें दिखाया के रूप में निचले कवर ग्लास द्वारा पानी स्नान करने के लिए युग्मित है.

स्वतंत्र रूप से सटीक डिजाइन, चैंबर के प्रदर्शन का मूल्यांकन किया जाना चाहिए । विशेष रूप से हम बाह्य सेट तापमान, किसी भी व्यवस्थित तापमान ऑफसेट, और चैंबर के भीतर एक तापमान ढाल के साथ नमूना तापमान की रैखिकता के लिए जांच की । पहले दो अंक चैंबर के भीतर प्रत्यक्ष तापमान माप द्वारा एक फाइबर ऑप्टिक तापमान जांच (जैसे FISO FTI-10) द्वारा संबोधित किया गया । हम भी गुव निलंबन के भीतर एक तापमान ढाल के लिए जांच की । इस तरह के एक ढाल कक्ष के बाहर करने के लिए गर्मी प्रवाह से स्टेम सकता है । विशेष रूप से हल तापमान माप एक तापमान संवेदनशील fluorophore४०द्वारा प्राप्त किया जा सकता है, चित्रा 7देखें ।

डेटा प्लॉटिंग और चरण-अलग GUVs के टीमिक्स प्राप्त करने के लिए फिटिंग

मनाया तापमान रेंज पर समरूप GUVs के अंश की साजिश रचने एक sigmoidally आकार डेटा बिंदु पथ के परिणामस्वरूप । हम डाटा को लैटिस मॉडल (प्रोटोकॉल सेक्शन ६.८) में फिट करते हैं जिसमें से टीमिक्स मुजे (फिगर 8) हो सकता है ।

Figure 1
चित्रा 1: पुटिका वृद्धि (निचले पैनल) के इसी चरण के साथ सहज सूजन प्रोटोकॉल (शीर्ष पैनल) के दौरान प्रयोगात्मक कदम । (क) एक समरूप लिपिड फिल्म एक roughened PTFE प्लेट पर फैला हुआ है और किसी भी विलायक से सूख गया है । (ख) सूखे लिपिड फिल्म तो पूर्व है पानी के साथ एक बंद कंटेनर के अंदर एक पानी संतृप्त वातावरण में सूजन bilayer जलयोजन की सुविधा के लिए । शून्य काँच की शीशी में PTFE प्लेट होती है और इस जलयोजना चरण के दौरान खुला रहता है. (ग) पूर्व सूजन लिपिड फिल्म अंत में पूरी तरह से वांछित सूजन समाधान के अलावा कांच की शीशी के अंदर लिपिड लेपित PTFE प्लेट पर से हाइड्रेटेड हो जाता है । वाष्पीकरण से बचने के लिए, कांच की शीशी रातोंरात मशीन के दौरान ठीक से सील कर दी जाती है । एक बैच के भीतर रचनात्मक विविधताओं को कम करने के लिए, सभी कदम एक तापमान जहां लिपिड मिश्रण पूरी तरह से मिश्रणीय है पर प्रदर्शन करने की जरूरत है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2: गुव संचयन. (क) DOPG/eSM/चौल से मिलकर 20/60/20 के दाढ़ अनुपात में मिलकर एक जमा लिपिड फिल्म ०.१ के साथ DiIC के लिए18 १०० मिमी लवणता, 10 मिमी NaCl, पीएच ७.५ से बना उच्च Tris बफर में सूजन थी । कांच के कंटेनर के ढक्कन इसके अतिरिक्त आयल फिल्म के साथ सील किया गया था । ब्याज की बढ़ाया क्षेत्र परिणामी गुव समग्र शामिल हैं । इसकी लाल उपस्थिति DiIC18की मौजूदगी का परिणाम है । (B) GUVs को कटा हुआ पिपेट टिप के साथ काटा गया था । इस छवि में, सकल सूजन समाधान है, जो एक ताजा शीशी में स्थानांतरित किया गया के ५० µ एल के साथ एक साथ pipetted था । (ग) असममित ट्रांस-झिल्ली समाधान की स्थिति बनाने के लिए, कुल एक और isotonic बाहरी समाधान में पतला था । यहां, ५० µ एल सूजन समाधान के साथ मिलकर कुल ९५० µ एल सुक्रोज में reसस्पैंड किया गया समाधान सूजन समाधान के एक 20x कमजोर पड़ने के परिणामस्वरूप । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3: गुव इमेजिंग. GUVs के वाइड फील्ड प्रतिदीप्ति छवियों ०.१ मॉल% DiIC18 के साथ मैगनीज तैयार की और सममित नमक या सुक्रोज DOPG, eSM, और चौल के विभिंन अनुपात से मिलकर समाधान में मनाया (नमक बफर में, बाएं से दाएं: 40/20/40; 50/20/30; 30/60/10; में सुक्रोज, बाएं से दाएं: 30/30/40; 20/60/20; 40/50/10) । विभिंन (सहअस्तित्व) चरण प्रोटोकॉल चरण ३.६ में मानदंडों के अनुसार मूल्यांकन राज्यों में GUVs चित्रण छवियों । यहां, बुलबुले एक 40X/0.6 ना उद्देश्य के माध्यम से imaged थे । स्केल बार्स = 5 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: microfluidic चैनल डिजाइन का लेआउट. GUVs एक जलाशय के नीचे प्रवेश के माध्यम से कम तरल पदार्थ परत (रेखांकित चैनल) दर्ज करें । एक फिल्टर डिवाइस से अवांछित मलबे ब्लॉक. वे तो ६० कक्षों की एक सरणी (8 पंक्तियों और 15 कॉलम) एक गुव कब्जा के लिए एक युक्त पदों (डालें देखें) दर्ज करें । प्रत्येक कक्ष द्रव परत के ऊपर एक अंगूठी एक नियंत्रण परत (काले चैनलों से भरा) द्वारा हाथ वाल्व के भीतर अलग किया जा सकता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्र 5: Microfluidic डिवाइस. (क) एक microfluidic डिवाइस के फोटोग्राफ एकल GUVs जाल और पूरी तरह से बाहरी समाधान विनिमय करने के लिए इस्तेमाल किया । लेबल जलाशय समाधान जोड़ने के लिए संकेत मिलता है (1), 8 एक्स दबाव दबाव नियंत्रण इकाई (2) से जुड़े, और सिरिंज और पंप से जुड़े आउटलेट (3) को अनुमति देता है । पैनल (B) microfluidic डिवाइस से कनेक्टेड 1 ट्यूब को विनियमित करने वाले 8 वाल्वों की विशेषता दबाव नियंत्रण इकाई दिखाता है । यहां वाल्व #1 और #2 खुले है और इसलिए इसी अंगूठी वाल्व बंद कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6: तापमान नियंत्रण कक्ष । (क) चैम्बरविधानसभा से पहले । (ख) इकट्ठे चैंबर (ऊपर की ओर का सामना करना पड़ रहा) 2 मिमी कवर ऊपर और नीचे से चिपके चश्मे के साथ । नारंगी रबर स्पेसर ऊंचाई में ०.५ mm उपाय और संलग्न गुव निलंबन के अवलोकन के लिए एक ०.१७ mm कवर स्लिप के साथ बंद है । इस छवि में एक तापमान जांच अंशांकन प्रयोजनों के लिए डाला जाता है (ब्राउन फाइबर सही पर चैंबर से बाहर निकलने) । (ग) तापमान की जांच के बिना एक उल्टे माइक्रोस्कोप के मंच पर अंतिम विधानसभा । ऑरेंज रबड़ स्पेसर अब नीचे की दिशा में आ रहा है । रबर काफी चिपकने वाला है जगह में नमूना पकड़ । ध्यान दें कि प्रकाश दोनों महामारी प्रतिदीप्ति और उज्ज्वल क्षेत्र टिप्पणियों को सक्षम करने के नमूने के माध्यम से प्रेषित किया जा सकता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्रा 7: स्थानिक अवलोकन एक तापमान संवेदनशील डाई के FLIM माप द्वारा प्राप्त चैंबर के अंदर तापमान डेटा हल (यहां: ५०० µ एम Rhodamine बी) ४०. डेटा अंक 0, 10, 30, ३०० और ४०० µm नीचे कवर स्लिप में प्राप्त हुआ । लाल और नीले डेटा बिंदुओं को क्रमशः 30 डिग्री सेल्सियस और 12 डिग्री सेल्सियस पर सेट जल स्नान के तापमान के लिए मापा गया । काले डेटा बिंदुओं को कमरे के तापमान के लिए equilibrate करने के लिए छोड़ दिया पानी स्नान संकेत मिलता है । चैंबर भर में छोटे तापमान रूपांतरों पर मनाया गया, लेकिन ०.५ डिग्री सेल्सियस (ग्रे सलाखों) से नीचे रहे । कुल चैंबर ऊंचाई के बारे में ५०० स्पेसर मोटाई के अनुसार µm है (ऊपर देखें) । त्रुटि पट्टियां मानक विचलन इंगित करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 8
चित्रा 8: miscibility तापमान का पता लगाने. ग्राफ (एकल तरल राज्य) सजातीय के व्यक्तिगत डेटा अंक से पता चलता है एक अनुपात 30/40/30 में DOPG/eSM/चौल से तैयार GUVs के अंश तीन स्वतंत्र यादृच्छिक नमूनों (N = 20-40) से ०.१ मॉल%DiIC 18 के साथ मैगनीज । त्रुटि पट्टियों का अर्थ मानक त्रुटि दर्शाते हैं । डेटा पॉइंट्स चरण ६.८ (निरंतर काली रेखा) में वर्णित लैटिस मॉडल में लगाये गये थे जिसमें से डोमेन मिक्सिंग तापमान टीमिक्स मुजे किया गया था (लाल सतत लाईन का पालन abscissa करने के लिए) sigmoidal की आधी अधिकतम के अनुसार तालमेल पर वक्र (काली रेखा धराशायी) । प्रारंभिक और अंतिम मान (एक1 और2) क्रमशः 0 और 1 के लिए तय किए गए थे । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 9
चित्र 9: दोषपूर्ण बुलबुले । विशाल 20/60/20 DOPG/eSM/चौल से तैयार बुलबुले के उदाहरण और ०.१ मॉल% के साथ मैगनीज अगर DiIC18 है कि चरण ४.२ में स्थापित मानदंडों को पूरा नहीं करते व्यापक क्षेत्र प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा imaged । व्यक्तिगत छवियों की तीव्रता प्रदर्शन पर्वतमाला चित्रित पुटिका के प्रतिदीप्ति तीव्रता के लिए हर बार अनुकूलित किया गया । अतिरिक्त झिल्ली सामग्री की उपस्थिति और छोटे बुलबुले encapsulated के कारण, (एक) में पुटिका के चरण राज्य स्पष्ट रूप से परिभाषित नहीं किया जा सकता है । इस विशाल पुटिका की उपस्थिति lamellarity के लिए किसी भी विश्वसनीय दृश्य निरीक्षण के लिए अनुमति नहीं है । पैनल (ख) एक पुटिका जिसमें से इंटीरियर झिल्ली सामग्री के साथ भीड़ है दर्शाया गया है । एक परिणाम के रूप में, बाहरी पुटिका झिल्ली के प्रतिदीप्ति संकेत अपने आंतरिक संकेत के साथ आरोपित है, lamellarity और संभावित डोमेन असंभव का एक दृश्य प्रतिपादन । (ग) तीन अलग विशालकाय बुलबुले के प्रतिदीप्ति तीव्रता एक ही प्रदर्शन गहनता रेंज के भीतर प्रत्यक्ष तुलना में दिखाया जाता है । इस छवि से पता चलता है कि विशाल multilamellar बुलबुले (1, 2) गुव (3) की तुलना में उनकी वृद्धि हुई प्रतिदीप्ति संकेत द्वारा पहचाना जा सकता है । यहां, multilamellar के रूप में अच्छी तरह के रूप में unilamellar विशाल बुलबुले प्रदर्शन Lo + Ld चरण जुदाई । सभी छवियों में बुलबुले एक 40x/0.6 ना उद्देश्य के माध्यम से imaged थे । स्केल बार्स = 5 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 10
चित्रा 10: लो के अंश + Ld चरण अलग GUVs औसत से कम तीन स्वतंत्र नमूनों पर । बुलबुले के 30/40/30 DOPG/eSM/चौल के लो + Ld सह-अस्तित्व क्षेत्र की सीमा के करीब बना रहे थे । सममित सुक्रोज स्थितियों के लिए त्रुटि सलाखों के बैच के लिए बैच तितर बितर वर्णन । तालमेल के लेबल के अंदर समाधान का वर्णन/ सुक्रोज: २१० mM सुक्रोज; नमक: १०० मिमी NaCl, 10 मिमी Tris, पीएच ७.५; त्रुटि पट्टियां मानक विचलन को इंगित करती हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 11
चित्र 11: DOPG, eSM से तैयार GUVs के चरण आरेख, और चौल २१० mm सुक्रोज (सुक्रोज) और १०० mm NaCl, 10 mm Tris, पीएच ७.५ (नमक) का उपयोग करते हुए विभिंन समाधान स्थितियों के अंतर्गत मैप किया गया है । गुव चरण के राज्यों में सुक्रोज/सुक्रोज (A; ऊपरी खंड), सुक्रोज/नमक (में/बाहर) (एक; कम बहुभुज अनुभाग), नमक/नमक (b; ऊपरी अनुभाग), और नमक/सुक्रोज (b; न्यून बहुभुज अनुभाग) । कार्टून प्रकाश डाला वर्गों और इसी समाधान की स्थिति के भीतर प्रमुख डोमेन पैटर्न को समझाने । पुटिका चरण निचले बहुभुज वर्गों में प्रतिनिधित्व राज्यों 20x गुव कमजोर पड़ने पर असममित समाधान शर्तों के तहत मनाया गया । संदर्भ9से अनुकूलित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 12
चित्र 12: फँसे GUVs में कलाकृतियाँ. एक छोटे गुव का उदाहरण है जहां एक झूठी डोमेन पदों के साथ करीब निकटता के कारण देखा जा सकता है (DOPG/eSM/चौल 60/20/20) । उज्ज्वल क्षेत्र संचारित प्रकाश पोस्ट (जीआर दिखा छविey) गुव (नारंगी) के फोकल प्रतिदीप्ति छवि के साथ मढ़ा है । पदों के लिए उज्ज्वल क्षेत्र छवि में एक हस्तक्षेप पैटर्न बनाने के लिए देखा जाता है । प्रतिदीप्ति संकेत बंद पदों (दाएं) चरण जुदाई की उपस्थिति दे कम है । स्केल बार = 5 µm ।

Figure 13
चित्र 13: PDMS पोस्ट द्वारा कैप्चर किए गए दो भिंन GUVs के उदाहरण जहां चरण राज्यों को स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं । (A) Lo + Ld phase सेपरेटेड पुटिका DOPG/eSM/चौल 60/20/20 के बने । (ख) 40/30/30 प्रदर्शन एलडी या लो सिंगल फेज का बना पुटिका । इस बात की पुष्टि करने के लिए कि कोई (आउट-ऑफ-फोकस) डोमेन मौजूद थे, पूरे पुटिका का एक फोकल z-स्टैक जांचा गया । पदों के किनारों छवियों (ग्रे) के दाहिने हाथ की ओर देखा जाता है । स्केल बार = 5 µm ।

Figure 14
चित्रा 14: microfluidic डिवाइस का उपयोग कर एक पूर्ण द्रव विनिमय के बाद परिणामी चरण व्यवहार. एक ही गुव दोनों से पहले और समाधान के बाद विनिमय के लिए दिखाया गया है (A) सममित नमक/नमक (में/सुक्रोज (DOPG/eSM/चौल 60/20/20, स्केल बार 2 µm है) और (B) सममित सुक्रोज/सुक्रोज (में/बाहर) सुक्रोज/नमक (में/DOPG /eSM/Chol 30/40/30, स्केल बार = 3 µm) । संदर्भ9से अनुकूलित ।

Discussion

सममित और असममित उच्च लवणता शर्तों के तहत चरण राज्य टिप्पणियों के लिए GUVs का सफल उत्पादन

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक व्यापक रचनाओं की रेंज पर आरोप लगाया GUVs की झिल्ली चरण राज्य पर उच्च लवणता बफर और समाधान विषमता के प्रभाव का आकलन करने के लिए एक रणनीति का परिचय । इस लक्ष्य को प्राप्त करने की दिशा में प्रमुख चुनौतियों में से एक उच्च लवणता में मुझपर GUVs का उत्पादन किया गया थें.

हम सफलतापूर्वक सुक्रोज समाधान और उच्च खारा बफर में एक सरल सहज सूजन दृष्टिकोण है, जो जमा लिपिड फिल्म के एक पूर्व जलयोजन कदम और पुटिका विकास के लिए एक रात के अंतिम जलयोजन कदम भी शामिल है द्वारा GUVs का उत्पादन किया । यह ध्यान रखें कि लिपिड जमाव एक roughened PTFE प्लेट पर किया जाना चाहिए करने के लिए भी लिपिड unilamellar बुलबुले उपज फैल सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है । इसके अलावा, यह एक तापमान जहां लिपिड फिल्म एक समरूप और द्रव चरण राज्य में है पर पुटिका तैयारी के दौरान हर कदम प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक है । और, पुटिका जनसंख्या संरचना में polydisperse जा सकता है और अंतिम जनसंख्या चरण राज्य विश्लेषण पूर्वाग्रह । GUVs की सहज सूजन के लिए विशिष्ट प्रोटोकॉल एक पुटिका का झुरमुट जो एक हाथ पर संभावना पुनः प्रदान करता है यह छोटी मात्रा में निलंबित करने के लिए उच्च केंद्रित पुटिका फैलाव प्राप्त करने के लिए, और दूसरी ओर असममित समाधान प्रदान करता है झिल्ली भर में स्थिति है जबकि बुलबुले8,28के कमजोर पड़ने को कम । यह आवश्यक है कि पुटिका कमजोर पड़ने या बाहरी समाधान विनिमय के दौरान, अंदर और बाहर के osmolarities के रूप में आकृति विज्ञान परिवर्तन के रूप में मिलान रहना osmolarity बेमेल उत्पन्न हो सकता है या लो + Ld चरण पृथक्करण४१ या, hypotonic के मामले में शर्तों, पुटिका फट करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं ।

यहां, उच्च लवणता समाधान में electroformation प्रोटोकॉल का अनुकूलन करने का प्रयास नहीं GUVs के उत्पादन में हुई, जबकि PVA-असिस्टेड सूजन multilamellar बुलबुले झुकेंगे । हालांकि यह अब तैयारी समय और कम गुणवत्ता के पुटिका बैचों में परिणाम की आवश्यकता है10,17, सहज सूजन से आरोप लगाया बुलबुले के सफल उत्पादन अतिरिक्त लाभ के साथ आता है । यह ंयूनतम प्रयास की मांग करते हुए सांख्यिकीय बैच विश्लेषण के लिए पर्याप्त पैदावार में जिसके परिणामस्वरूप और, electroformation के विपरीत, कोई परिष्कृत उपकरण या अनुकूलन की आवश्यकता थी । इसके अलावा, लिपिड ऑक्सीकरण द्वारा कोई संदूषणों४२,४३मनाया गया है । साहित्य के अनुसार वहाँ बुलबुले की लिपिड रचनाओं और इसी स्टॉक्स के बीच कोई मतभेद नहीं हैं जिनसे वे७,१७हो गए थे. इसके अलावा, एक PTFE सब्सट्रेट पर पुटिका गठन जेल के विपरीत में किसी भी प्रदूषितता के शामिल होने का संकेत नहीं है-सूजन तरीकों जहां विदेशी अणुओं सब्सट्रेट23द्वारा पेश किया जा सकता है सहायता प्रदान की । Electroformation अधिक अत्यधिक पुटिका कमजोर पड़ने से संबंधित कमियां जब असममित समाधान की स्थिति बनाने के साथ आता है । electroformation द्वारा उत्पादित GUVs आमतौर पर एक सजातीय फैलाव के रूप में (एक सहज सूजन के दौरान गठित झुरमुट के रूप में उच्च केंद्रित पुटिका निलंबन के विपरीत में मौजूद हैं) । बाहरी समाधान के किसी भी कमजोर पड़ने काफी बुलबुले की संख्या के रूप में अच्छी तरह से पतला होगा । इसके अलावा, इस काम के दौरान यह देखा गया कि DOPG/eSM/चौल electroformation द्वारा उत्पादित GUVs सुक्रोज में अस्थिर अगर उच्च लवणता बफर में पतला हो गया । खुर्दबीन स्लाइड पर लिपिड पैच से प्रतिदीप्ति संकेत दिया कि बुलबुले उनके दृश्य निरीक्षण से पहले फट जाएगा संभव था । ऐसी अस्थिरता electroformation द्वारा तैयार बुलबुले के एक ऊंचा झिल्ली तनाव को जिंमेदार के रूप में सहज सूजन10द्वारा प्राप्त उन की तुलना में हो सकता है ।

हालांकि पुटिका कमजोर पड़ने के एक आसान और त्वरित दृष्टिकोण असममित गुव समाधान की स्थिति बनाने के लिए है, यह केवल एक आंशिक बाह्य समाधान एक्सचेंज को पूरा, हालांकि एक उच्च अंश (यहां: ९५%, चित्रा 2), के रूप में कमजोर पड़ने पर, के निशान सूजन का समाधान बना रहेगा । बाहरी समाधान विनिमय की डिग्री का चुनाव एक व्यापार है, सूजन समाधान (खंड 2) के साथ एक साथ पुटिका झुरमुट pipetting के बीच बंद और यह बहुत ज्यादा कमजोर नहीं है । इसलिए, हम एक वैकल्पिक microfluidic दृष्टिकोण पेश किया विस्तार से कहीं पर चर्चा की३७ कि गुव चरण राज्य टिप्पणियों के दौरान एक त्वरित और पूर्ण बाहरी समाधान विनिमय के लिए अनुमति देता है चरण राज्य टिप्पणियों के लिए बनाया सत्यापित करने के लिए पतला पीव. चरण राज्य के बदलाव की टिप्पणियों जब सममित से असममित समाधान शर्तों को बदलने वास्तव में समझौते में मनाया गया । इसके अतिरिक्त, दोनों तरीकों असममित समाधान यहां दिखाया शर्तों से उत्पंन कर रहे है तुलना जल्दी (Ref.8तुलना) और स्थानीय संरचना परिवर्तन के कोई ज्ञात जोखिम के साथ आते है (तुलना संदर्भ30,31), झिल्ली तनाव में वृद्धि (संदर्भ की तुलना32), या स्थानीय ताप (संदर्भ३३) की तुलना करें, वैकल्पिक परिचय में चर्चा की विधियों के लिए के रूप में । microfluidic फँसाने के दौरान, पुटिका इंटीरियर और बाहरी के बीच एक परासरणी संतुलन केवल चरण राज्य कलाकृतियों से बचने के लिए आवश्यक नहीं है के रूप में ऊपर उल्लेख किया है लेकिन यह भी hypertonic समाधान की स्थिति के कारण संकुचन फंस GUVs पर्ची के कारण हो सकता है एक बाहरी समाधान एक्सचेंज के बाद पदों के माध्यम से ।

हालांकि सहज सूजन सफलतापूर्वक एक DOPC/eSM/चौल प्रणाली से uncharged बुलबुले विकसित करने के लिए लागू किया गया है, अंय मामलों में, शुल्क के अभाव के कारण गुव सूजन हो सकता है व्यक्तिगत bilayers ४४ के बीच reलैबोरेटरी के परिणामस्वरूप कमी की वजह से है . पूर्व सूजन अवधि का विस्तार या भारी लिपिड headgroups शुरू करने के लिए इस समस्या का मुकाबला कर सकते हैं४५. इसके अलावा, सूजन के लिए इस्तेमाल एक से अलग समाधान में उनके कमजोर पड़ने के बाद पुटिका स्थिरता अलग लिपिड रचनाओं और कमजोर पड़ने मीडिया, जो हम यहां जांच नहीं की है के लिए भिंन हो सकता है । हम भी तैयारी विधि यहां प्रस्तुत के साथ औसत गुव व्यास ट्यूनिंग की संभावना का पता लगाया नहीं है । लेकिन ऐसे पुटिका संरचना और सूजन समाधान के रूप में मानकों के परिणाम को प्रभावित करने की संभावना है । वैकल्पिक तरीकों के आवेदन४६ लिपिड और यहां इस्तेमाल किया समाधान के लिए बड़ा बुलबुले उपज हो सकता है, तथापि, वे अंय विधि के साथ जुड़े कमियां के साथ आ सकता है । इसके बाद के संस्करण का वर्णन करने के लिए सममित और असममित उच्च लवणता स्थितियों में GUVs उत्पादन दृष्टिकोण अलग लिपिड रचनाओं से बना है और अलग मीडिया में फैलाया बुलबुले के आगे के अध्ययन के लिए एक संभावित उपकरण प्रदान करता है । जैसा कि हम उन संभावनाओं का पता लगाया नहीं है, भविष्य के परीक्षणों दिखाएगा कैसे आम तौर पर गुव तैयारी और कमजोर पड़ने तरीकों लागू किया जा सकता है ।

अलग तापमान पर देख चरण जुदाई

अलग प्रयोगात्मक setups बदलती तापमान पर GUVs अध्ययन करने के लिए उपयुक्त मौजूद है । हालांकि इन setups सामांयतः साहित्य के भीतर विस्तार से वर्णित नहीं हैं, वर्तमान काम एक बुनियादी इस तरह के अध्ययन के लिए लागू विधानसभा प्रस्तुत करता है ।

नियंत्रण माप बताते हैं कि इस घर में डिजाइन और निर्मित चैंबर के तापमान ठीक एक थर्मोस्टेट और कक्ष के अंदर तापमान ढाल द्वारा नियंत्रित किया जाता है प्रयोगात्मक तापमान संकल्प के भीतर कर रहे हैं. यह सुनिश्चित किया जाता है कि प्रयोगात्मक थर्मल शर्तों थर्मोस्टेट के पढ़ने के साथ संगत कर रहे हैं ।

एक व्यापक तापमान रेंज पर गुव चरण राज्यों के आकलन के दौरान, यह महत्वपूर्ण है कि मनाया बुलबुले अच्छी तरह से equilibrated के बाद तापमान बदल दिया गया है । एक संभव तरीका यह सुनिश्चित करने के लिए हिस्टैरिसीस के लिए जांच है । यदि हिस्टैरिसीस मौजूद है, तो तापमान के चरणों में कमी और/equilibration गुना वृद्धि की जानी चाहिए । इस काम में तापमान नियंत्रण के रूप में एक पानी आधारित थर्मोस्टेट द्वारा स्थापित किया गया है, काम कर रहे तापमान की सीमा आदर्श रूप से 0-100 डिग्री सेल्सियस तक सीमित है । इस श्रेणी के तेल के रूप में अंय तापमान नियंत्रण तरल पदार्थ का उपयोग करके या अंय setups के काम द्वारा विस्तारित किया जा सकता है, एक Peltier उपकरण उदा । अभ्यास में, काम कर रहे तापमान भी संभव संघनित्र या वाष्पीकरण द्वारा सीमित है । इसके अलावा, तापमान के लिए अभी तक कमरे के तापमान से दूर, प्रेक्षण कक्ष में एक स्थिर राज्य के तापमान ढाल की घटना और अधिक होने की संभावना हो जाता है । इसके अलावा, इमेजिंग उपकरण चरम तापमान पर नुकसान हो सकता है । ठेठ तापमान के लिए लिपिड पुटिका अध्ययन के लिए उपयुक्त पर्वतमाला (~ 10-50 °c7, 9) अवलोकन उपकरणों के लिए नुकसान पर विचार कियाजानाचाहिए, लेकिन आम तौर पर उम्मीद नहीं है.

पुटिका डोमेन प्रेक्षण कलाकृतियों

व्यापक क्षेत्र प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग अवलोकन कलाकृतियों के लिए सूत्रों के एक नंबर रहे हैं. सबसे पहले, एक पता होना चाहिए कि पुटिका चरण राज्यों के दृश्य निरीक्षण के लिए आवेदन किया वस्तु के अधिकतम संकल्प आर के अनुसार लिपिड डोमेन का पता लगाने की सीमा निर्धारित करता है:
Equation 2
जहां λ उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य है, और ना ही इस उद्देश्य के संख्यात्मक एपर्चर है । एक 40x इज़ाफ़ा और ०.६ जो ५६० एनएम के आसपास हरी उत्सर्जन प्रकाश का पता लगाता है की एक एनए के साथ एक ठेठ उद्देश्य ~ ०.६ µm के एक ऑप्टिकल संकल्प तक पहुंच जाएगा । इसलिए, अध्ययन है कि विभिन्न के बीच विशेष लिपिड मिश्रण से बने बुलबुले के चरण राज्यों की तुलना शर्तों एक ही लिपिड मिश्रण के लिए एक ही उद्देश्य का उपयोग करना चाहिए ।

एक और विरूपण साक्ष्य लिपिड तस्वीर का एक परिणाम के रूप में लिपिड डोमेन की घटना है उत्तेजना प्रकाश४१के लिए एक विस्तारित जोखिम के कारण ऑक्सीकरण । फोटो-नुकसान अनसंतृप्त हाइड्रोकार्बन लिपिड moieties पर होता है । वास्तव में, कुछ लिपिड रचनाओं के लिए, शुरू में सजातीय बुलबुले के इस तरह के डोमेन गठन उत्तेजना प्रकाश जोखिम (~ 30 एस) की एक विस्तारित अवधि के बाद यहां मनाया गया था । उस मुद्दे का मुकाबला करने के लिए, उत्तेजना प्रकाश चरण राज्य के आकलन के लिए केवल कुछ सेकंड के लिए देखने के एक क्षेत्र पर ध्यान केंद्रित रखा गया था. इसलिए, DiIC18 हमारे प्रयोजनों के लिए उपयुक्त था । अंय रंजक, तथापि, और अधिक संवेदनशील हो सकता है और कम उत्तेजना तीव्रता पर संभाला और कम उत्तेजना प्रकाश जोखिम समय के साथ की आवश्यकता हो सकती है ।

बुलबुले के पिपेट हस्तांतरण से यांत्रिक कतरनी तनाव संभावित रूप से डोमेन घोला जा सकता है, जिससे स्पष्ट पुटिका चरण व्यवहार विकृत । कुछ बैचों के लिए, अलग बुलबुले अलग चरण व्यवहार दिखाया 0 मिनट और 5 माइक्रोस्कोप coverslip पर पिपेट हस्तांतरण के बाद मिनट. इसके अलावा कतरनी microfluidic डिवाइस में द्रव प्रवाह द्वारा प्रेरित तनाव डोमेन में परिणाम के लिए दिखाया गया है४७मिश्रण । बुलबुले निरीक्षण से पहले equilibration के लिए समय की एक पर्याप्त राशि के लिए परेशान छोड़ दिया जाना चाहिए । इस अध्ययन के भीतर, microfluidic डिवाइस पर फंसे बुलबुले अवलोकन से पहले पुटिका लोडिंग और समाधान आदान प्रदान के बाद 1 ज के लिए परेशान छोड़ दिया गया ।

उपर्युक्त कठिनाइयों में से कुछ से बचने के साथ ही प्रकाश विवर्तन सीमा द्वारा लगाए गए प्रतिबंध के रूप में, वैकल्पिक तरीकों जैसे परमाणु चुंबकीय अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी४८ या सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी तकनीक४९ कार्यरत हो सके ।

निष्कर्ष और आउटलुक

प्रस्तुत काम के तरीकों का एक सेट है कि उच्च लवणता सममित और झिल्ली चरण जुदाई पर असममित समाधान की स्थिति के प्रभाव के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है दर्शाता है । प्रस्तुत विधियों के सभी अंय अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त हैं । उदाहरण के लिए microfluidic डिवाइस समाधान विषमता की प्रेरण पर डोमेन गठन और पेडों के कैनेटीक्स का अध्ययन करने के लिए एक मंच प्रदान करता है । इसके अलावा, नमक एकाग्रता के एक समारोह के रूप में डोमेन उपस्थिति उस तरह की जांच की जा सकती है । सभी तरीकों को भी ब्याज के किसी भी अंय समाधान का उपयोग कर चरण व्यवहार पर प्रभाव को देखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम MaxSynBio कंसोर्टियम का हिस्सा है, जो संयुक्त रूप से जर्मनी के शिक्षा और अनुसंधान मंत्रालय के संघीय और मैक्स प्लैंक सोसायटी द्वारा वित्त पोषित है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol), sodium salt Avanti Polar Lipids 840475C abbreviated as DOPG in the text
chicken egg sphingomyelin Avanti Polar Lipids 860061 abbreviated as eSM
cholesterol (ovine wool, > 98 %) Avanti Polar Lipids 700000 abbreviated as Chol
1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate Molecular Probes D-282 abbreviated as DiIC18
Chloroform, HPLC grade (≥ 99.8 %) Merck
NaCl (> 99.8 %) Roth
HCl (37 %) Roth
Tris (≥ 99.9 %) Roth
Sucrose (≥ 99.5 %) Sigma Aldrich
Parafilm
Threaded vial 45x27 mm, 15 mL Kimble Soda flat bottom, white screw cap
pH meter Mettler Toledo MP220
Osmometer Gonotec Osmomat030
Epi-fluorescence microscope Zeiss Axio Observer D1
Confocal laser scanning microscope Leica TCS SP5
Objective 40x, 0.6 NA Zeiss LD Achroplan
Objective 40x, 0.75 NA Leica 506174
Objective 63x, 0.9 NA Leica 506148
Microscope slide, 56x26 mm, 0.17 ± 0.01 mm Menzel-Gläser
Cover slip, 22x22 mm, 0.17 ± 0.01 mm Menzel-Gläaser
Parafilm "M" Bremix Flexible Packaging
Syringes, 5 mL, 10 mL Braun
0.45 µm syringe filter GVS North America Cameo 25AS, 1213723 Acetate, sterile

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रसायन विज्ञान अंक १२८ विशाल unilamellar बुलबुले आरोपित झिल्ली सहज सूजन विधि transmembrane समाधान विषमता microfluidics झिल्ली डोमेन तरल परिक्रमा चरण तरल अर्दली चरण चरण सह-अस्तित्व गिब्स त्रिकोण miscibility तापमान प्रतिदीप्ति और फोकल माइक्रोस्कोपी
सममित और असममित समाधान शर्तों के तहत आरोपित बुलबुले के चरण व्यवहार प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ नजर रखी
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Kubsch, B., Robinson, T.,… More

Kubsch, B., Robinson, T., Steinkühler, J., Dimova, R. Phase Behavior of Charged Vesicles Under Symmetric and Asymmetric Solution Conditions Monitored with Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (128), e56034, doi:10.3791/56034 (2017).

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