Summary
Hier presenteren we een protocol voor live imaging van muis secundaire paletfusie met behulp van confocale microscopie. Dit protocol kan worden gebruikt in combinatie met een verscheidenheid aan fluorescerende reporter muis lijnen, en met pathway inhibitors voor mechanistisch inzicht. Dit protocol kan aangepast worden voor livebeelden in andere ontwikkelingssystemen.
Abstract
De fusie van de secundaire palatale planken om het intacte secundaire verhemelte te vormen is een belangrijk proces bij zoogdierenontwikkeling en de verstoring ervan kan leiden tot gespleten secundair verhemelte, een gemeenschappelijke aangeboren afwijking bij mensen. Secundaire smaakfusie is uitgebreid bestudeerd, wat leidt tot verschillende voorgestelde cellulaire mechanismen die dit proces kunnen bemiddelen. Deze studies zijn echter meestal uitgevoerd op vaste embryonale weefsels bij progressieve tijdstippen tijdens de ontwikkeling of in vaste explantieve culturen die zijn geanalyseerd op statische tijdstippen. Statische analyse is beperkt voor de analyse van dynamische morfogenetische processen, zoals een gomfusie en welke soorten dynamische cellulaire gedragingen palatal fusie bemiddelen is onvolledig begrepen. Hier beschrijven we een protocol voor livebeelden van ex vivo secundaire paletfusie in muisembryo's. Voor het onderzoeken van cellulaire gedragingen van verhemeltefusie werd epitheliale-specifieke Keratin14- cre gebruikt om palaatepitheliale cellen in ROS te labelenA26-mTmG flox reporter embryo's. Voor het visualiseren van filamenteactine werden Lifeact-mRFPruby- reportermuizen gebruikt. Live beeldvorming van secundaire verhemelingsfusie werd uitgevoerd door dissecteren van recent gehandhaafde secundaire palatale planken van embryonale dag (E) 14.5 stadium embryo's en culturen in agarose bevattende media op een glasbodemschotel om beeldvorming met een omgekeerde confocale microscoop mogelijk te maken. Met behulp van deze methode hebben we een verscheidenheid aan nieuwe cellulaire gedragingen ontdekt tijdens secundaire paletfusie. Een waardering voor het onderscheidend gedrag van de cellen in ruimte en tijd draagt bij aan ons inzicht in dit dynamische morfogenetische proces. Dit protocol kan worden toegepast op mutante muislijnen, of culturen die worden behandeld met farmacologische remmers om verder te begrijpen hoe secundaire paletfusie gecontroleerd wordt.
Introduction
Weefselfusie is een belangrijke stap in de ontwikkeling van meerdere organen. Grote menselijke geboorteafwijkingen zoals gespleten lip en verhemelte, spina bifida en misvormingen van het hart kunnen het gevolg zijn van gebreken in weefselfusie 1 . Muis secundaire palet fusie is uitgebreid bestudeerd om de cellulaire en moleculaire mechanismen die weefselfusie in ontwikkeling 2 , 3 , 4 bepalen, te identificeren. In de muis begint secundaire paletontwikkeling bij ongeveer E11.5 met de uitgroei van een secundaire palatale plank uit elk van de bilaterale maxillaire processen. De initiële groei van de palatale planken vindt verticaal langs de tong plaats, tot ongeveer E14.0, op dat moment worden de palatale planken horizontaal boven de tong verhoogd. Mediaal gerichte groei resulteert in fysiek contact tussen de toepassende epithelia van de twee palatale planken, waardoor de middelste epithelie vormtAl Seam (MES) op E14.5. De tussenliggende MES moet verwijderd worden tussen de secundaire palatale planken om mesenchymale samenvloeiing mogelijk te maken en de ontwikkeling van een intact, volledig gesmolten secundair verhemelte door E15.5 3 te ontwikkelen .
Hoe is een gedeelde epitheliale MES cellaag gevormd tussen twee afzonderlijke palatale planken, en vervolgens verwijderd om mesenchymale samenvloeiing te bereiken, is een centrale vraag in de ontwikkeling van de verhemelte. Gebaseerd op histologische en elektronenmicroscopie (EM) studies, explorante cultuurstudies en functionele muisgenetische experimenten, zijn er in dit proces verschillende fundamentele celgedragen betrokken. Filopodia-achtige projecties van het mediale randepitheel MEE van elke palatale plank vergemakkelijkt het eerste contact 5 , 6 , gevolgd door intercalatie van deze epitheliale cellen naar een gedeelde single MES 6 , 7 . Verwijdering van de resulterende gedeelde MESIs voorgesteld om door drie niet-exclusieve mechanismen te gaan. Vroege studies waarbij histologische observaties en ex vivo lijnsporen met vitale kleurstoffen werden gebruikt, wijzen erop dat het MES kan worden verwijderd door epitheliale tot mesenchymale overgang (EMT) van MES-cellen 8 , 9 , alhoewel recentere genetische afstamming van epitheliale cellen onzekerheid heeft opgedaan met betrekking tot De langetermijnbijdrage van epitheelcellen aan de palatale plank mesenchymme 10 , 11 , 12 . Significante aantallen apoptotische cellen, en een vermindering van hun aantal in sommige mutanten die geen goede palatefusie ondergaan, heeft geleid tot het idee dat apoptose een belangrijke aandrijving van MES-oplossing 2 , 3 kan zijn . Ten slotte, oorspronkelijk gebaseerd op studies met epitheliale etikettering en statische observatie bij progressieve tijdpunten, MES-cellenWerden voorgesteld om te migreren in de oronasale en anteroposterior afmetingen 11 , 13 , maar dergelijke dynamische celgedragen waren aanvankelijk onbevestigd doordat ze niet in staat waren om ze in levend palatale weefsel te observeren. Onlangs waren we in staat om deze gedragingen direct te observeren door een nieuwe live imaging methodologie te ontwikkelen die muisgenetische methoden van fluorescerende etikettering combineert met confocale livebeelden van explanted palatale planken.
Ten eerste, voor het visualiseren van dynamisch cellulair gedrag in gomepitheelcellen tijdens de gomfusie , genereren we een epitheliale-specifieke reportermuis door ROSA26-mTmG floxmuizen met Keratin14-cre muizen 14 , 15 te oversteken. Confocale levende beeldvorming van de verhemelte-explorante cultuur van de resulterende embryo's bevestigde een aantal eerder voorgestelde cellulaire gedragingen en geïdentificeerde nieuwe gebeurtenissen in het fusieproces 6 6 , 16 te beheren. Deze beeldvormingsmethode kan gebruikt worden bij andere reporterlijnen; We hebben Lifeact-mRFPruby transgene muizen 17 , 18 gebruikt om actin cytoskeletale dynamiek te onderzoeken tijdens het fusieproces. Andere verslaggevers kunnen ook worden gebruikt om andere specifieke aspecten van verhemeltefusie te observeren en deze methode kan worden aangepast aan laserscanning-confocal microscopie of draaibare confocal microscopie, afhankelijk van beeldbehoeften en beschikbaarheid van microscoop. Live imaging wordt steeds meer een keystone-aanpak in ontwikkelingsbiologie. PartiCulariofaciale morfogenese is complex en menselijke geboorteafwijkingen die het gezicht beïnvloeden zijn gebruikelijk. Deze confocal live imaging methode zal bijdragen tot een beter inzicht in onderliggende basisontwikkelingsmechanismen, alsmede de oorsprong van menselijke craniofaciale afwijkingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de protocollen van de Universiteit van Californië bij de Institutional Animal Care and Use Committee van San Francisco.
1. Voorbereiding van Live Imaging Media
- Bereiding van vloeibare kweekmedia
- Voeg 20% foetaal runder serum (FBS), 2 mM L-glutamine, 100 U / ml penicilline, 100 μg / ml streptomycine, 200 μg / ml L-ascorbinezuur, 15 mM HEPES toe aan Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) / F12 media.
OPMERKING: Live imaging media is vers gemaakt direct voor de imaging. Deze media bevat fenol-rood, wat kan leiden tot fototoxiciteit over lange tijdscursussen van livebeeldvorming. Het vervangen van media zonder fenol-rood kan de langetermijnbeelden verbeteren.
- Voeg 20% foetaal runder serum (FBS), 2 mM L-glutamine, 100 U / ml penicilline, 100 μg / ml streptomycine, 200 μg / ml L-ascorbinezuur, 15 mM HEPES toe aan Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) / F12 media.
- Bereiding van laagsmeltende agarose oplossing
- Los 350 mg laagsmeltende agarose op in 10 ml geautoclaafdestilleerd water om een 3,5% voorraadoplossing te maken.
- Meng de agarose oplossing goed en incubeer bij 70 ° C in een waterbad om de agarose volledig op te lossen.
- Afkoel de agarose-oplossing in een waterbad van 37 ° C voordat u hem aan de livebeeldvorming plaatst.
- Voeg 1 ml van de agarose voorraadoplossing toe aan 5 ml van de vloeibare levende beeldvormende media om een uiteindelijke concentratie (0,6%) te maken.
- Bewaar de media met agarose in een waterbad van 37 ° C om te voorkomen dat het voortijdig wordt gestollificeerd.
2. Bereiding van Palate Explant Cultuur voor Live Imaging
- Dissectie van recent gehandhaafde E14.5 secundaire palatale planken
OPMERKING: In onze ervaring vereist beeldvormende fusie dat het begint met een licht gehandhaafde paar palatale planken; Deze aanhechting voorkomt explantieve bewegingen die voorkomen dat fusie tijdens het imaging optreedt.- Dissect E14.5-stadium embryo's in 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en kies groen fluorescerend eiwit (GFP) -expressie (vanK14-cre; ROSA26-mTmG flox ) of (Rood fluorescerend eiwit) RFP-expressie (van Lifeact-mRFPruby ) positieve embryo's met behulp van een dissectiemicroscoop uitgerust met fluorescerende lampen. Overdracht weefsel naar voorverwarmd live imaging culture media zonder agarose.
- Knip het embryo hoofd en verwijder het bovenste hersengebied door gebruik te maken van twee fijne nr. 5 tang ( Figuur 1 A-C ). Gebruik een nr. 5 pincet om het embryo vast te houden terwijl de andere nr. 5 tikt om extra weefsel buiten de palatale planken af te snijden.
OPMERKING: Met een fijne schaar kunt u het embryo-hoofd (de eerste stap) knippen in plaats van één nr. 5 pincet. Echter, twee nr. 5 fijne tangjes geven betere controle om precieze bezuinigingen te maken. - Verwijder de mandibel zorgvuldig zonder de palatale planken te beschadigen, zoals weergegeven in Figuur 1 D en 1E . Om de kans op beschadiging van palaten te verminderen, houd de tong door dissectie van de mandibel, fVeroorzaakt door voorzichtig verwijderen van de tong.
- Nadat u de mond en de tong hebt verwijderd, controleer u de mondelinge kant van het secundaire verhemelte met een stereomicroscoop met fluorescentie om een sterk verslaggever in het MES te bevestigen ( Figuur 1 M ).
- Dissecter de achterste delen, waaronder de achterhaar en de hersenstam, na het verwijderen van de mandibele en de tong ( Figuur 1 F ).
- Verwijder beide maxillae met gehechte palatale planken ( Figuur 1 G ).
- Snijd het voorste bovenkaakweefsel, zodat zowel het primaire als het secundaire verhemelte intact blijft ( Figuur 1 H en I ).
- Verwijder nasale septum op de nasale kant van de explant die de MES blootstelt.
OPMERKING: Deze latere stappen van dissecties hebben zorgvuldige aandacht nodig om de contacten tussen twee secundaire palatale planken niet te verstoren. Verwijdering van de nasale septum helptVerminder het achtergrondsignaal van andere gebieden en verminder ook de verticale weefselbeweging, waardoor stabiele beeldvorming mogelijk is ( Figuur 1 J-L ). - Nadat u de palatale planken heeft opgesplitst, moet u het middelste reporterssignaal opnieuw onderzoeken om er zeker van te zijn dat de epitheliale laag tussen de weefsels niet wordt beschadigd.
- Palexplanten opstellen in cultuurschotel met live imaging media
- Leg live imaging media in 35 mm glasbodemschotel.
- Zet dissected palatal planken mondelinge kant naar beneden gericht zo dicht bij de glazen bodem mogelijk voor imaging met een omgekeerde confocale microscoop ( Figuur 1 N ).
- Plaats droogijspellets op een geleidend oppervlak in de buurt van de kweekschotel om agaroseversterking te versnellen door snel de temperatuur te verlagen of de kweekschotel bij 4 ° C te zetten. Een koude plaat, zoals die gebruikt kan worden voor de inbouw van paraffine, zou ook bij deze s kunnen worden gebruikttage.
OPMERKING: Wanneer droogijs wordt gebruikt, moet de agarose-mediaverandering zorgvuldig worden gecontroleerd om het bevriezen van media te voorkomen.
3. Confocal Time-lapse Imaging of Palate Explant
- Imaging en Data acquisitie
- Nadat de agarose halfgestolideerd was, monteer de kweekschotel in een omgekeerde confocale microscoop uitgerust met een incubatiekamer van 37 ° C. Gebruik een confocal microscoop van witte licht en de confocal microscope van de waarnemer.
OPMERKING: We gebruikten een gemodificeerd medium dat 15 mM HEPES zonder CO 2 gas bevat. - Breng petroleumjelly tussen de kweekschotel en deksel met behulp van een spuit om de verdamping van de media te vermijden ( Figuur 1 N ).
OPMERKING: sommige condensatie bovenop de kweekschoteldekking na een nacht (O / N) -cultuur komt voor, maar het volume van de media verandert niet, wat suggereert dat de petroleumjess voorkomt dat de media verdampen. - Zoek de regio met belangstelling met lage vergrotingsdoelstellingen (10x) en gebruik de grotere vergrotingsdoelstellingen (20x objectief met 3x digitale zoom of een 40x objectief met Immersol W) voor time-lapse live imaging.
OPMERKING: Dissected secundaire palatale planken zijn niet plat. Het secundaire palet is een gebogen structuur en dit maakt het moeilijk om de gehele MES in hetzelfde vliegtuig te maken. Lage vergroting (10x) beeldvorming kan gehele beeldvorming van de galerij toelaten, maar 40x doelstellingen zorgen voor betere beeldresolutie om gedetailleerde cellulaire bewegingen in dieper Z-posities te onderzoeken. De kromming is hoog in het middenpaleisgebied. Anterior en posterior verhemelte zijn relatief vlak in vergelijking met de middelste verhemelte. We zien vaak naar het midden van de secundaire verhemelte om regio's met de grootste kromming te vermijden. - Scan meerdere Z-stacks met 5 μm elke stap gedurende 16-24 uur met behulp van een goede laser excitatie (488 nm voor GFP en 532/561 nm voor RFP) ( Figuur 2 ).
OPMERKING: Gebruik de minimale laservermogen en belichtingstijd om de potentiële fototoxiciteit te verminderen. Dit is vooral belangrijk bij multicolor beeldvorming. Gebruik 22% van 552 nm laservermogen voor membraanTomato (mT), 30% van 495 nm laservermogen voor membraanGFP (mG) en 25% van 561 nm laservermogen voor membraanRFP. De gemiddelde belichtingstijd was 550 ms. - Gebruik beeldanalysesoftware om cijferopsporing en kwantitatieve analyse uit te voeren.
- Nadat de agarose halfgestolideerd was, monteer de kweekschotel in een omgekeerde confocale microscoop uitgerust met een incubatiekamer van 37 ° C. Gebruik een confocal microscoop van witte licht en de confocal microscope van de waarnemer.
4. Data Image Analysis
OPMERKING: Hier werd Imaris gebruikt. Soortgelijke data analyses kunnen ook worden uitgevoerd met ImageJ of Volocity software pakketten.
- 3D-oppervlakken maken van beeldsequenties.
OPMERKING: Dit gedeelte maakt het mogelijk om een oppervlak te genereren vanuit een film die wordt gegenereerd met een membraan GFP-signaal.- Klik op Bewerken | Toon weergave aanpassing en gebruik de schuifregelaar van het histogram om de signaalintensiteit aan te passen, zodat het membraan signaal helder isDe lengte van de film uit ( figuur 3 A ).
- Correct gebleekt signaal met behulp van Image Verwerking | Verzwakking correctie . Stel de intensiteitsintensiteit voor en intensiteit terug, zodat het membraansignaal helemaal over de lengte van de film is. Er kan een fout worden gemaakt bij het instellen van deze waarden.
OPMERKING: De waarde Intensity Back (Dier Z-positie) zal lager zijn dan de intensiteit van de Intensity Front (Oppervlak Z-positie) door beperkte laserpenetratie. Deze waarden kunnen daarom ook worden veranderd om de signaalintensiteit in de Z-serie te normaliseren. Beide waarden kunnen worden aangepast om bleekcorrectie te bereiken. De verzwakkingscorrectie wordt ook genoemd Emissiereductiecorrectie 19 . - Om een oppervlak van het membraansignaal te genereren, selecteer Surpass | Oppervlakken , kies een bronkanaal en Drempeltype (Absolute Intensiteit) en onder de Algoritme InstellingenlECT Segment alleen een regio van belang En proces van volledige afbeelding eindelijk , gevolgd door te klikken op de voorwaartse pijl; Blijf de pijl naar voren bewegen (gebruik standaardinstellingen, of specificeer Oppervlakgebied Detail Niveaus en Drempelmethode door trial and error), controleer of het gegenereerde oppervlak het fluorescentiesignaal weerspiegelt. Om een regio van belang te specificeren, selecteer regio en tijd (en) die worden weergegeven door X, Y, Z posities te bezuinigen.
OPMERKING: Selecteer Proces van volledig beeld uiteindelijk, zodat aanpassingen en drempels over de gehele film worden toegepast. - Genereer een oppervlak door opnieuw op de pijl naar voren te klikken. Zet dan de drempel aan door het histogram in Filters te wijzigen om te corresponderen met het membraansignaal.
- Nadat het oppervlak is gegenereerd, kies het oppervlak in Oppervlakken / Instellingen om het oppervlaksignaal te visualiseren en het oppervlakgeneratieproces te beëindigen door de dubbele voorwaartse druk te drukkenArd pijlknop ( Figuur 3 B ).
- Ga naar Oppervlakte | Bewerk en klik op Masker alles in de Mask eigenschappen om een gemaskerde kanaal afbeelding te genereren.
- Nadat u op OK hebt geklikt, wordt het venster Mask Channel automatisch geopend; Selecteer het GFP-kanaal, stel voxels buiten het oppervlak in op de maximale signaalintensiteitswaarde (gevonden in Edit | Display aanpassing ) en voxels in het oppervlak tot de minimale GFP-intensiteitswaarde (ook gevonden in Bewerken | Display aanpassing ), in Maskerinstellingen om een masker van het membraan signaal te genereren.
- Als het masker van het membraan signaal zal worden getoond in Volume uitzicht, het genereren van beelden omgekeerd met behulp van Image Processing | Contrast Change | Omkeren ( Figuur 3C ).
- Het detecteren van vlekken van omgekeerde oppervlakbeelden.
OPMERKING: In deze sectie kan het midden van elke cel wordenGemarkeerd met een unieke plek en opgespoord over ruimte en tijd.- Selecteer Scène overschrijven | Spots | Creëren ; In algoritminstellingen selecteer Segment alleen een regio van belang , het proces van het volledige beeld eindelijk en track spots (over tijd) .
- Klik op de voorpijl en geef een regio van belangstelling op; Selecteer de regio en tijd (en) om plekken te volgen; Blijf door de voorpijl door te drukken, kies het gemaskeerde kanaal als bronkanaal en bepaal de geschatte XY-diameter van de plekken.
- Als u op de pijl naar voren klikt, wordt automatisch een filtervenster geopend; Pas de spotdetectiedrempel aan door de waarden in het histogram te veranderen om enkele vlekken in het midden van elke cel te genereren ( Figuur 3 D ).
- Als u opnieuw klikt op de pijl naar voren, wordt het venster Algoritme geopend. Kies Autoregressief bewegingsmodel 20 en geef de maximale tracking diHouding en maximale kloofgrootte om tracks die voor een korte periode discontinu zijn, te verbinden.
- Als u op de knop voorwaarts pijltje klikt, verschijnt het venster Filters, stelt u de drempel voor de duur van de track vast door het histogram aan te passen, zodat elke cel wordt gevolgd. Door op de dubbele voorwaartse pijlknop te drukken, wordt de spotdetectie voltooid.
- Om de weefselafwijking te corrigeren klikt u op Spots | Track Editor en selecteer Correct Drift . Een algoritm venster wordt automatisch geopend; Selecteer de optie Translational drift, Include hele resultaat en Correct objectenposities .
- Genereer voordelen voor kwantitatieve analyse.
OPMERKING: De scatterplot van het programma is een tool om multidimensionale grafieken (X, Y, Z, Kleur en Schaal) met meerdere objecten te genereren. Deze plots zijn nuttig om de trends van veel celbewegingen in de loop der tijd te bekijken.- Maak 2D- of 3D-plottingen van celvolgdata met behulp van deVantage-Add New Vantage plot menu ( Afbeelding 3 E en 3F ).
- Selecteer Volume of Spots en kies Create / Category en Plot Type
- Stel plotwaarden aan om verschillende Vantage-grafieken te genereren.
- Grafieken exporteren met de Snapshot- functie.
OPMERKING: Statistische gegevens kunnen ook worden geëxporteerd als een spreadsheet voor verdere kwantitatieve analyse door op Plot Numbers Area te klikken | Opslaan .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Live imaging of palate explant cultuur onthulde meerdere cellulaire processen mediating palate fusion 6 . Initiële contacten tussen twee epitheelcellen worden gemaakt door membraanuitsteeksels ( Figuur 2 B-2E ). Wanneer twee epitheliale lagen elkaar ontmoeten vormen ze een multi-cel gelaagde MES, gevolgd door intercalatie om een geïntegreerde enkele cellaag MES te vormen door epitheliale convergentie ( Figuur 2 A-2E en Figuur 2 K-2O ). Epitheliale cellen in dieper Z-niveaus worden ook progressief verplaatst naar de orale zijde van de MES die bijdragen tot het epitheelconvergentieproces ( Figuur 2 K ). Posterior-gerichte celmigratie werd waargenomen in de middelste verhemelte MES ( Figuur 2 F-2J ). Daarnaast vonden we epitheelcel extRusie gebeurtenissen tijdens de gomfusie, die suggereren dat epitheliale cellen in de MES door dit actieve proces kunnen worden verwijderd ( Figuur 2 Q, 2T ). De geïntegreerde epitheliale naad zal uiteindelijk afbreken om mesenchymale confluentie te bereiken ( Figuur 2 S, 2T ).
Lifeact-mRFPruby- verhemelte vertoonde dynamische actine-cytoskeletale herschiktingen tijdens gomfusie 6 . Filamenteuze actine werd verrijkt aan de grens tussen epitheliale en mesenchymale gebieden die een kabelachtige structuur vormen langs de voorste-achterste as ( Figuur 2 K-2T) . Actomyosin-contractiliteit drijft epitheliale convergentie en MES-breuk omdat chemische remming van ofwel myosine-activiteit of actinpolymerisatie deze dynamische processen 6 blokkeerde.
Hin-page = "1"> Software werd gebruikt om cellulair gedrag tijdens gomfusie te traceren. De beste methode voor het bijhouden van cellen hangt af van het reporterssignaal. Als een nucleaire reportermuis wordt gebruikt, kan het programma het middelpunt van fluorescerende signalen traceren als cellulaire centra 21 . Nucleaire GFP-reportermuis zoals ROSA26 GFP-NLS-lacZ ( GNZ) 22 kan derhalve worden gebruikt om epitheliale cellen te labelen met behulp van weefselspecifieke Cre lijnen; In onze handen vertoonde deze specifieke nucleaire verslaggever sneller bleken over de lange tijd die in livebeeldvorming werd gebruikt. Daarom hebben we gebruik gemaakt van de membraan-GFP reporter ( ROSA26-mTmG flox ) om epitheliale celbewegingen in onze studies te volgen. Dit vereist een methode voor het identificeren en traceren van afzonderlijke cellen door een membraan signaal. Om dit probleem op te lossen, hebben we gebruik gemaakt van een gewijzigde celopsporingsmethode ( afbeelding 3 en protocol sectie 4 ).
Inhoud "voor: keep-together.within-page =" 1 ">
Figuur 1 : Schematische weergave van muis secundaire palet dissectie. ( A ) Zijaanzicht van E14.5 muis embryo. Om palatale planken te ontleden, werd het hoofd gesneden langs de eerste witte stippellijn, # 1. ( B, C ) De bovenste hersenen (boven de tweede witte lijn, # 2) werden verwijderd. ( D, E ) Mondelinge weergave van dissected head. Lower mandible (# 3) werd gedissecteerd en de tong (# 4) werd verwijderd. ( F ) Posterior deel van het hoofd langs de lijn # 5 werd uitgesneden. ( GI ) Beide maxillae (# 6, # 7) en voorste deel van de bovenkaak (# 8) werden verwijderd. ( JL ) Nasale septum (# 9) werd verwijderd ( M ) GFP signalen in de MES van gedissendeerde verhemelte van een K14-cre; ROSA26 mTmG muis embryo. ( N ) Live imaging setup. De mondelinge kant van de palAten explant was naar beneden gericht om te worden afgebeeld met omgekeerde confocale microscoop. MES is aangegeven met witte pijlpunten ( FI ). Het afgebeelde gebied wordt aangeduid met witte stippels in L en M. Schaalstaven = 2 cm in A, 1 cm in BI, 500 μm in JM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2 : Live beeldvorming van palate explant culturen. ( AE ) Live beeldvorming van het voorste secundaire verhemelte van een K14-cre; ROSA26 mTmG explant (5 μm diepte). De witte pijlhoofd toont een membraan uitsteeksel van een epitheliale cel ( FJ ) Live beeldvorming van het middelste verhemelte van K14-cre; ROSA26 mTmG explant (5 μm depth). Witte pijlen geven de richting van celmigraties aan van de voorste naar de achterste verhemelte. ( KO ) Live beeldvorming van de voorpaleis van Lifeact-mRFPruby explant (5 μm diepte). Epitheliale celverplaatsing (gele pijl) naar het mondvlak en convergentie om een geïntegreerde MES te vormen met kabelachtige actinstructuren in de middellijn. ( PT ) Live beeldvorming van de voorste verhemelte van Lifeact-mRFPruby explant (25 μm diepte). De rode pijl geeft een cel extrusie gebeurtenis aan ( Q, T ). Toekomstige breekpunten van de naad worden aangegeven door twee verticale witte pijlen in S en T. Schaalstaven = 20 μm. Alle livebeeldgegevens in deze figuur zijn afgeleid van experimenten die eerder in 6 zijn gepubliceerd . Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
-pagina = "1"> 
Figuur 3 : Data analyse. ( AD ) Epitheelcellen met membraan GFP signalen van K14-cre traceren ; ROSA26 mTmG- gomexplanter ( A ), Een oppervlak werd gegenereerd door volume-weergave van het membraan-GFP-signaal ( B ). Omgekeerde beelden werden gegenereerd na het maskeren van het gecreëerde oppervlak ( C ). Cellulaire centra werden geïdentificeerd uit de omgekeerde beelden met behulp van een spots detectie functie in Imaris ( D ). ( E ) 3D-reconstructies maken de bewegingen van de cellen in meerdere richtingen mogelijk. A: anterior, P: posterior, N: nasaal, O: mondeling ( F ) 2D analyse genereert een uitzichtsplot dat cellen vertoont die zich van voorste naar achterste richting in de middelste verhemelte MES migreren. Schaalstaven = 20 μm in AD, 10 μm in EF.S / ftp_upload / 56041 / 56041fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te zien.
Video Figuur 1: Live beeldvorming van K14-cre; ROSA26-mTmG flox anterior palate (5 μm diepte). Beelden werden elke 10 minuten (10 minuten / frame) gevangen gedurende 16 uur 20 minuten, Schaalbalk = 25 μm. Deze video is een andere Z-positie van een film die eerder in referentie 6 is gepubliceerd . Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Video Figuur 2: Live beeldvorming van K14-cre; ROSA26-mTmG flox Middelste verhemelte (5 μm diepte). Beelden werden elke 15 minuten (15 minuten / frame) gevangen voor 13 uur 30 minuten, Schaalbalk = 25 μm. Deze video is eerder gepubliceerd in referentie 6 . Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Video Afbeelding 3: Live beeldvorming van Lifeact-mRFPruby voorste verhemelte (5 μm diepte).
Beelden werden elke 10 minuten (10 minuten / frame) genomen voor 7 uur 50 minuten. Schaalbalk = 20 μm. Deze video is eerder gepubliceerd in referentie 6 . Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Video Figuur 4: Live beeldvorming van Lifeact-mRFPruby voorste verhemelte (25 μm diepte).
Beelden werden elke 10 minuten (10 minuten / frame) genomen voor 7 uur 50 minuten. Schaalbalk = 20 μm. Deze video is een andere Z-positie van een film die eerder in referentie 6 is gepubliceerd . Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Live beeldvorming van weefselmorfogenese met 3D-organische explantatiecultuur kan gedetailleerde informatie verschaffen over cellulaire processen die niet kunnen worden aangetoond in conventionele kleuranalyse van vaste weefselsecties. Met behulp van in vitro explant cultuur van muis embryonale secundaire verhemelte, we observeren verschillende interessante cellulaire gedragingen die ons leiden tot een nieuw mechanisme van verhemelte fusie die epitheliale convergentie en cel extrusie omvat.
Een algemene uitdaging bij dergelijke studies is fotobewerking door continue laser excitaties over een lange tijdscursus. In onze studies werd een confocal en white confocal microscope gebruikt. Bepaalde afname in signaalintensiteit in de loop van de tijd kan worden gecorrigeerd door bleken correcties in de beeldsoftware (LAS-AF) (Protocol 4.1). Omdat bleekcorrectie beperkt is, is het belangrijk om laservermogen en belichtingsduur zorgvuldig in elk beeldsysteem te optimaliseren. We hebben ook gecontroleerdDat flauwe fusie normaal voorkomt in de live imaging media na 3 dagen cultuur 6 .
Een tweede veel voorkomend probleem bij livebeeldvorming is weefseldrift. Het is cruciaal om drijf te minimaliseren om consistente beelden te krijgen tijdens livebeeldvorming, omdat veranderingen in het brandpuntsvlak een begrip van morfogenetische veranderingen in de loop van de tijd kunnen verstoren. Terwijl het bestrijden van thermische drift kan worden bereikt in veel confocale microscopen (Bepaalde focus in de microscoop), kan de drijfwerking van het weefsel ten opzichte van de glazen bodem niet worden gecorrigeerd door deze methoden. Gebruik van agarose, evenals het plaatsen van de explant tegen de glazen bodem helpt dit te minimaliseren, maar zorg moet nog steeds worden genomen om de films die een relatief constante positie behouden te analyseren. Dit kan bepaald worden door meerdere controlepunten in het imagingveld over de tijd te volgen om te bepalen of ze constant blijven, met een soortgelijke trend bewegen of anders verschillen. In een mate, met behulp van post-processing fuNecties zorgen voor een correctie van wat weefseldrift in livebeeldvorming (protocol 4.2).
Laagsmeltende agarose werd gebruikt bij een uiteindelijke concentratie van 0,6% in de live beeldvormende media om de explantieve weefsels te immobiliseren. Toen we hogere concentraties agarose testen, bleken ze weefselmorfogenese te beïnvloeden, mogelijk door mechanische beperkingen. Het is daarom belangrijk om de juiste agaroseconcentratie te gebruiken om de weefseldrift te minimaliseren, terwijl de morfogenese niet wordt verstoord.
Vanwege de confocal beelddiepte heeft deze methode beperkingen in het onderzoeken van zeer diepe Z-planen van verhemeltefusie. Met behulp van zowel de WHITE LIGHT als de draaibank-confocale microscopen, kan een signaal van 100 μm dieptes succesvol worden afgebeeld, maar de afbeelding begon te worden saai en zwak boven deze limiet. Omdat paletfusie een progressief proces is in de oronasale en anteroposterior assen, stellen we voor dat beeldvorming meerdere posities effectief beeldvorming van verschillende depten mogelijk maaktHs van flauwfusie, maar in de toekomst kan twee-foton of lichte confocal microscopie worden gebruikt om de diepte van beeldvorming te verbeteren. In de meeste van onze experimenten werd de mondelinge kant van de verhemelte verwerkt. Beeldvorming van de nasale kant van de verhemelte explant is moeilijk omdat de nasale septum gefuseerd of zeer dicht bij de secundaire palatale planken is. In onze pogingen om beeldfusie van de nasale kant te maken, was het ook nodig om het extra nasale weefsel te verwijderen, zodat het het signaal van het palaatepithelium niet interfereerde. Hoewel het mogelijk was om de nasale kant van de verhemelte explant te maken, was het moeilijk omdat dissectie van het nasale septum dikwijls schade aan de verhemelte veroorzaakt.
Live imaging van reporter muisweefsel explanteren is een krachtige methode om cellulaire mechanismen van weefselmorfogenese tijdens embryonale ontwikkeling te bestuderen. Met behulp van confocale microscopietheorieën en kwantitatieve beeldvormingsanalyse kunnen basisontwikkelingsprocessen zoals secundaire paletfusie zijnOnderzocht op cellulaire niveau.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We bedanken M. Douglas Benson voor de eerste gesprekken over secundaire paletbeelden. We erkennen ook David Castaneda-Castellanos (Leica) en Chris Rieken (Zeiss) voor hun hulp om beeldvormende omstandigheden in confocale microscopie aan te passen. We waarderen Lynsey Hamilton (Bitplane) voor nuttige suggesties voor kwantitatieve beeldanalyse met behulp van Imaris-software. Dit werk werd gefinancierd door NIH / NIDCR R01 DE025887.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| DMEM/F12 | Life technology | 11330-032 | |
| Fetal Bovine Serum | Life technology | 16000-044 | |
| L-glutamine | Life technology | 25030-081 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma | A4544-100G | |
| Pennicillin/Streptomycin | Life technology | 15140-122 | |
| Low melting agarose | BioExpress | E-3111-125 | |
| 35 mm glass bottom dish | MatTek | P35G-1.5-10-C | |
| Petrolieum Jelly (Vaseline) | Sigma | 16415-1Kg | |
| Mice | |||
| Keratin14-cre | MGI: J:65294 | Allele = Tg(KRT14-cre)1Amc | |
| ROSA26mTmG | MGI: J:124702 | Allele = Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo | |
| Lifeact-mRFPruby | MGI: J:164274 | Allele = Tg(CAG-mRuby)#Rows | |
| Microscope | |||
| White Light SP5 confocal microscope | Leica Microsystems | ||
| Cell Observer spinning disk confocal microscope | Zeiss Microscopy |
References
- Ray, H. J., Niswander, L. Mechanisms of tissue fusion during development. Dev. Camb. Engl. 139, 1701-1711 (2012).
- Dudas, M., Li, W. -Y., Kim, J., Yang, A., Kaartinen, V. Palatal fusion - where do the midline cells go? A review on cleft palate, a major human birth defect. Acta Histochem. 109, 1-14 (2007).
- Bush, J. O., Jiang, R. Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development. Development. 139, 231-243 (2012).
- Lan, Y., Xu, J., Jiang, R. Cellular and Molecular Mechanisms of Palatogenesis. Curr Top Dev Biol. 115, 59-84 (2015).
- Taya, Y., O'Kane, S., Ferguson, M. W. Pathogenesis of cleft palate in TGF-b3 knockout mice. Development. 126, 3869-3879 (1999).
- Kim, S., et al. Convergence and Extrusion Are Required for Normal Fusion of the Mammalian Secondary Palate. PLOS Biol. 13, 100122 (2015).
- Yoshida, M., et al. Periderm cells covering palatal shelves have tight junctions and their desquamation reduces the polarity of palatal shelf epithelial cells in palatogenesis. Genes Cells. 17, 455-472 (2012).
- Fitchett, J., Hay, E. Medial edge epithelium transforms to mesenchyme after embryonic palatal shelves fuse. Dev. Biol. 131, 455-474 (1989).
- Akira, N., et al. The expression of TGF-beta3 for epithelial-mesenchyme transdifferentiated MEE in palatogenesis. J Mol Hist. 41, 343-355 (2010).
- Sani, F. V., et al. Fate-mapping of the epithelial seam during palatal fusion rules out epithelial-mesenchymal transformation. Dev. Biol. 285, 490-495 (2005).
- Jin, J. -Z., Ding, J. Analysis of cell migration, transdifferentiation and apoptosis during mouse secondary palate fusion. Development. 133, 3341-3347 (2006).
- Xu, X., et al. Cell autonomous requirement for Tgfbr2 in the disappearance of medial edge epithelium during palatal fusion. Dev. Biol. 297, 238-248 (2006).
- Carette, M. J., Ferguson, M. W. The fate of medial edge epithelial cells during palatal fusion in vitro: an analysis by Dil labelling and confocal microscopy. Development. 114, 379-388 (1992).
- Muzumdar, M., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
- Dassule, H., Lewis, P., Bei, M., Mass, R., McMahon, A. Sonic hedgehog regulates growth and morphogenesis of the tooth. Development. 127, 4775-4785 (2000).
- Eisenhoffer, G., et al. Crowding induces live cell extrusion to maintain homeostatic cell numbers in epithelia. Nature. 484, 501-546 (2012).
- Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nat Methods. 5, 605-607 (2008).
- Riedl, J., et al. Lifeact mice for studying F-actin dynamics. Nat Methods. 7, 168-169 (2010).
- Can, A., et al. Attenuation correction in confocal laser microscopes: a novel two-view approach. J Microsc. 211, (2003).
- Veenman, C., Reinders, M., Backer, E. Resolving motion correspondence for densely moving points. IEEE Trans Pattern Anal Mach Intell. 23, 54-72 (2001).
- Udan, R., Piazza, V., Hsu, C., Hadjantonakis, A., Dickinson, M. Quantitative imaging of cell dynamics in mouse embryos using light-sheet microscopy. Development. 141, 4406-4414 (2014).
- Stoller, J., et al. Cre reporter mouse expressing a nuclear localized fusion of GFP and beta-galactosidase reveals new derivatives of Pax3-expressing precursors. Genesis. 46, 200-204 (2008).
