Summary
Her presenterer vi en protokoll for levende bildebehandling av musens sekundære ganefusjon ved hjelp av konfokal mikroskopi. Denne protokollen kan brukes i kombinasjon med en rekke fluorescerende reportermuslinjer, og med banehemmere for mekanistisk innsikt. Denne protokollen kan tilpasses for levende bildebehandling i andre utviklingssystemer.
Abstract
Fusjonen av de sekundære palatalhyllene for å danne den intakte sekundære ganen er en sentral prosess i utvikling av pattedyr, og forstyrrelsen kan føre til spalt sekundær gane, en vanlig medfødt anomali hos mennesker. Sekundær ganefusjon har blitt grundig studert, noe som fører til flere foreslåtte cellulære mekanismer som kan mediere denne prosessen. Imidlertid har disse studiene blitt utført hovedsakelig på faste embryonale vev ved progressive tidspunkter under utvikling eller i faste eksplosive kulturer analysert ved statiske tidspunkter. Statisk analyse er begrenset for analyse av dynamiske morfogenetiske prosesser som en ganefusjon, og hvilke typer dynamisk cellulær oppførsel medierer palatal fusjon er ufullstendig forstått. Her beskriver vi en protokoll for levende bildebehandling av ex vivo sekundær ganefusjon i musembryoer. For å undersøke cellulær oppførsel av ganefusjon ble epitel-spesifikk Keratin14- cre brukt til å merke ganeepitelceller i ROSA26-mTmG flox reporter embryoer. For å visualisere filamentøs actin ble Lifeact-mRFPruby- reportermus brukt. Levende bildebehandling av sekundær ganefusjon ble utført ved å dissekere nylig adhered sekundære palatal hyller av embryonale (E) 14.5 stadium embryoer og dyrking i agaroseholdige medier på en glassbunnskål for å muliggjøre avbildning med et invertert konfokalmikroskop. Ved å bruke denne metoden har vi oppdaget en rekke nye cellulære atferd under sekundær ganefusjon. En forståelse for hvor forskjellig celleatferd er koordinert i rom og tid, bidrar sterkt til vår forståelse av denne dynamiske morfogenetiske prosessen. Denne protokollen kan brukes på mutante muselinjer, eller kulturer behandlet med farmakologiske hemmere for ytterligere å forstå forståelsen av hvordan sekundær ganefusjon styres.
Introduction
Vevsfusjon er et viktig skritt i utviklingen av flere organer. Store menneskelige fødselsdefekter som spalt leppe og gane, spina bifida og misdannelser i hjertet kan skyldes mangler i vevsfusjon 1 . Mus sekundær gane fusjon har blitt grundig studert for å identifisere de cellulære og molekylære mekanismer som styrer vev fusjon i utvikling 2 , 3 , 4 . I musen begynner sekundær ganeutvikling på rundt E11.5 med utvækst av en sekundær palatal hylle fra hver av de bilaterale maksillære prosessene. Den første veksten av palatalhyllene foregår vertikalt langs tungen, til omtrent E14.0, på den tiden blir palatalhyllene løftet horisontalt over tungen. Medialt rettet vekst resulterer i fysisk kontakt mellom den appellerende epitel av de to palatale hyllene, som danner midtre epitheliAl seam (MES) på E14.5. Den mellomliggende MES må fjernes fra de sekundære palatale hyllene for å tillate mesenkymal sammenfylling og utviklingen av en intakt, fullstendig smeltet sekundær gane ved E15.5 3 .
Hvordan et felles epithelial MES-cellelag dannes mellom to separate palatale hyller, og deretter fjernet for å oppnå mesenkymal konfluens, har vært et sentralt spørsmål i ganeutvikling. Basert på mus histologiske og elektronmikroskopi (EM) studier, eksplante kulturstudier og funksjonelle musegenetiske eksperimenter, har flere grunnleggende celleatferd vært involvert i denne prosessen. Filopodi-lignende fremspring fra medialkantenepitelet MEE av hver palatal hylle muliggjør første kontakt 5 , 6 , etterfulgt av interkalering av disse epitelceller til en delt enkelt MES 6 , 7 . Fjerning av den resulterende delte MESHar blitt foreslått å fortsette med tre ikke-eksklusive mekanismer. Tidlige studier med histologisk observasjon og ex vivo linjesporing med vitale farger indikerte at MES kan fjernes ved epitel til mesenchymal overgang (EMT) av MES-celler 8 , 9 , men nylig har genetisk linjesporing av epitelceller økt usikkerheten om Det langsiktige bidraget fra epitelceller til palatal hylle mesenchym 10 , 11 , 12 . Signifikant antall apoptotiske celler, og en reduksjon av antallet i noen mutanter som ikke klarer å gjennomgå riktig gnagefusion, har ført til ideen om at apoptose kan være en viktig driver for MES oppløsning 2 , 3 . Til slutt, basert på studier med epitelmerking og statisk observasjon ved progressive tidspunkter, MES-cellerBle foreslått å migrere i oronasale og anteroposterior dimensjonene 11 , 13 , men slike dynamiske celleatferdigheter var i utgangspunktet ubekreftet på grunn av manglende evne til å observere dem i levende palatalvev. Nylig var vi i stand til å observere disse oppføringene direkte ved å utvikle en ny levende bildebehandling som kombinerer musegenetiske metoder for fluorescerende merking med konfokal levende bildebehandling av eksplanterte palatalhyller.
For å visualisere dynamisk cellulær oppførsel i ganeepitelceller under ganefusjon genererte vi en epitel-spesifikk reportermus ved å krysse ROSA26-mTmG floxmus med Keratin14-cre mus 14 , 15 . Konfokal levende bildebehandling av ganeeksplanteringskulturen av de resulterende embryoer bekreftet noen tidligere foreslåtte cellulære oppføringer og identifiserte nye hendelser i fusjonsprosessen 6 6 , 16 . Denne avbildningsmetoden kan brukes med andre reporterlinjer; Vi benyttet Lifeact-mRFPruby transgene mus 17 , 18 for å undersøke aktin cytoskeletaldynamikk under fusjonsprosessen. Andre journalister kan også benyttes for å observere andre spesifikke aspekter ved ganefusjon, og denne metoden kan tilpasses enten til laserskanning av konfokal mikroskopi eller spoleplate-konfokal mikroskopi, avhengig av bildebehov og mikroskoptilgjengelighet. Live imaging blir stadig en keystone tilnærming i utviklingsbiologi. PartiCularly, kraniofacial morfogenese er kompleks og menneskelige fødselsskader som påvirker ansiktet er vanlige. Denne konfokale levemodellmetoden vil bidra til å muliggjøre en bedre forståelse av underliggende grunnleggende utviklingsmekanismer, samt opprinnelsen til menneskelige kraniofaciale abnormiteter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med protokollene fra University of California ved San Francisco Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Forberedelse av Live Imaging Media
- Fremstilling av flytende dyrkningsmedier
- Tilsett 20% føtalt bovint serum (FBS), 2 mM L-glutamin, 100 U / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin, 200 μg / ml L-askorbinsyre, 15 mM HEPES til Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) / F12 media.
MERK: Live-bildemedier ble gjort nystekte rett før bildeteksten. Dette mediet inneholder fenol-rødt, noe som kan føre til fototoksisitet over lang tidskurs med levende bildebehandling. Bytte for media uten fenol-rød kan forbedre langsiktig bildebehandling.
- Tilsett 20% føtalt bovint serum (FBS), 2 mM L-glutamin, 100 U / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin, 200 μg / ml L-askorbinsyre, 15 mM HEPES til Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) / F12 media.
- Fremstilling av lavmeltende agaroseoppløsning
- Løs opp 350 mg lavmeltende agarose i 10 ml autoklavert destillert vann for å lage en 3,5% stamløsning.
- Bland agaroseoppløsningen godt og inkuber ved 70 ° C i et vannbad for å oppløse agarosen helt.
- Avkjøl agaroseløsningen i et 37 ° C vannbad før du legger det til levende bildemedia.
- Tilsett 1 ml agarosestamuløsningen til 5 ml av væsken levende bildemedia for å få en endelig konsentrasjon (0,6%).
- Hold mediet med agarose i et 37 ° C vannbad for å forhindre for tidlig størkning.
2. Forberedelse av Palate Explant Culture for Live Imaging
- Disseksjon av nylig adhered E14.5 sekundære palatal hyller
MERK: I vår erfaring krever bildefusjon å starte med et litt adhered par palatal hyller; Denne tilkoblingen forhindrer eksplosjonsbevegelser som hindrer fusjon fra å forekomme under avbildning.- Dissekter E14.5-stadiumsembryoer i 1x fosfatbuffert saltvann (PBS) og velg grønt fluorescerende protein (GFP) -uttrykk (fraK14-cre; ROSA26-mTmG flox ) eller (Rødt fluorescerende protein) RFP-uttrykkende (fra Lifeact-mRFPruby ) positive embryoer ved hjelp av et disseksjonsmikroskop utstyrt med fluorescerende lamper. Overfør vev til forvarmet levende bildekulturmedium uten agarose.
- Klipp embryohodet og fjern det øvre hjerneområdet ved å bruke to fine nr. 5 tang ( figur 1 A-C ). Bruk en nr. 5 tanger for å holde embryoen mens den andre nr. 5 tinger for å kutte bort ekstra vev utenfor palatalhyllene.
MERK: Fin saks kan brukes til å kutte embryohode (det første trinnet) i stedet for en nr. 5 tang. Imidlertid vil to nr. 5 fine pincetter gi bedre kontroll for å gjøre presise kutt. - Fjern mandibelen forsiktig uten å skade palatal hyller som vist på figur 1 D og 1E . For å redusere sjansen for å ødelegge ganer, hold tungen gjennom disseksjon av mandibelen, fForårsaket av forsiktig fjerning av tungen.
- Etter å ha fjernet mandibelen og tungen, undersøk den orale siden av den sekundære ganen med et stereomikroskop med fluorescens for å bekrefte sterkt reporter signal i MES ( Figur 1 M ).
- Dissekterer bakre delene, inkludert bakbenet og hjernestammen etter fjerning av mandel og tunge ( Figur 1 F ).
- Fjern begge maxillae med adhered palatal hyller ( figur 1 G ).
- Kutt fremre øvre kjevevev som holder både primær og sekundær gane intakt ( Figur 1 H og I ).
- Fjern neseseptum på nesen av eksplosiv som utsetter MES.
MERK: Disse senere trinnene i disseksjoner trenger nøye oppmerksomhet for ikke å forstyrre kontaktene mellom to sekundære palatalhyller. Fjerning av neseseptum hjelper tilRedusere bakgrunnssignalet fra andre områder og redusere også vertikal vevbevegelse, slik at det blir stabil bildebehandling ( Figur 1 J-L ). - Etter dissekering av palatalhyllene, undersøk midtlinjeporteringssignalet igjen for å sikre at det ikke er skade på epitellaget mellom vevet.
- Sette opp ganeeksplanter i kulturfett med levende bildemedia
- Sett levende bildeformidlingsmedier i 35 mm glassbunnrett.
- Sett dissected palatal hyller muntlig side nedover så nær glassbunnen som mulig for avbildning med et invertert konfokalmikroskop ( Figur 1 N ).
- Plasser tørreispellets på en ledende overflate i nærheten av kultiveringsskålen for å fremskynde agarose-størkning ved å senke temperaturen raskt eller la kulturskålen være ved 4 ° C. En kaldplate, som en som brukes til innfelling av paraffin, kan også brukes på denne stage.
MERK: Når tøris er brukt, må agarose utskifting av media overvåkes nøye for å forhindre frysemiddel.
3. Confocal Time-lapse Imaging of Palate Explant
- Imaging og datainnsamling
- Etter agarose ble halvstivnet, monter kultiveringsretten i et invertert konfokalmikroskop utstyrt med 37 ° C inkubasjonskammer. Bruk et hvitt lys konfokalmikroskop og celleobservatør spin-disk konfokalmikroskop.
MERK: Vi brukte et modifisert media som inneholdt 15 mM HEPES uten CO 2 -gass. - Sett petroleumjell mellom kulturretten og dekselet ved hjelp av en sprøyte for å forhindre fordampning av media ( Figur 1 N ).
MERK: Enkel kondensering på toppen av kulturdekselet etter natten (O / N) -kultur skjer, men volumet av media endres ikke, noe som tyder på at petroleumsglass forhindrer media i å fordampe. - Finn området av interesse med lave forstørrelsesmål (10x) og bruk høyere forstørrelsesmål (20x objektiv med 3x digital zoom eller 40x objektiv med Immersol W) for time-lapse live-bildebehandling.
MERK: Dissected sekundære palatal hyller er ikke flate. Den sekundære ganen er en buet struktur, og dette gjør det vanskelig å bilde hele MES i samme plan. Lav forstørrelse (10x) bildebehandling kan tillate full gane bildebehandling, men 40x mål vil gi bedre bildeoppløsning for å undersøke detaljerte mobilbevegelser i dypere Z posisjoner. Krumningen er høy i midten gane regionen. Forreste og bakre gane er relativt flat i forhold til den midterste gane. Vi viser ofte mot midten av den sekundære ganen for å unngå regioner med størst krølling. - Skann flere Z-stabler med 5 μm hvert trinn i 16-24 timer ved å bruke riktig laserekspitasjon (488 nm for GFP og 532/561 nm for RFP) ( Figur 2 ).
MERK: For å redusere potensiell fototoxicitet, bruk minimum laserkraft og eksponeringstid. Dette er viktig, spesielt når det gjelder flerfarget bildebehandling. Bruk 22% av 552 nm laserkraft for membranTomato (mT), 30% av 495 nm laserkraft for membranGFP (mG) og 25% av 561 nm laserkraft for membranRFP. Gjennomsnittlig eksponeringstid var 550 ms. - Bruk bildeanalyseprogramvare til å utføre cellesporing og kvantitativ analyse.
- Etter agarose ble halvstivnet, monter kultiveringsretten i et invertert konfokalmikroskop utstyrt med 37 ° C inkubasjonskammer. Bruk et hvitt lys konfokalmikroskop og celleobservatør spin-disk konfokalmikroskop.
4. Data Image Analysis
MERK: Her ble Imaris brukt. Lignende data analyser kan også utføres med ImageJ eller Volocity programvarepakker.
- Gjenoppretter 3-dimensjonale (3D) overflater fra bildesekvenser.
MERK: Denne delen muliggjør generering av en overflate fra en film generert med et membran-GFP-signal.- Klikk på Rediger | Vis skjermjustering og bruk glidebryteren for å justere signalintensiteten slik at membransignalet er klart gjennomUt lengden på filmen ( figur 3 a ).
- Riktig bleket signal ved å bruke Image Behandling | Dempingskorreksjon . Juster intensitetsfrontens og intensitetsverdiene slik at membransignalet er klart gjennom hele lengden av filmen. Det kan være nødvendig med noen forsøk og feil ved å angi disse verdiene.
MERK: Intensity Back (Dyp Z-posisjon) -verdien vil være mindre enn intensiteten foran (overflate Z-posisjon) på grunn av begrenset laserinntrenging. Disse verdiene kan derfor også endres for å normalisere signalintensiteten i Z-serien. Begge verdiene kan justeres for å oppnå blekingskorreksjon. Dempningskorreksjon kalles også Emissionsdempningskorreksjon 19 . - For å generere en overflate fra membransignalet, velg Surpass | Overflater , velg en kildekanal og Terskeltype (Absolutt intensitet) og under Algoritminnstillinger select Segment kun en region av interesse Og prosessen med hele bildet til slutt , etterfulgt av å klikke på fremoverpilen; Fortsett å skyve fremoverpil (bruk standardinnstillinger, eller angi Surface Area Detail Nivåer og Terskelmetode etter prøve og feil), og kontroller om den genererte overflaten reflekterer fluorescenssignalet. For å angi en region av interesse, velg region og tid (er) som skal gjengis ved å beskjære X, Y, Z posisjoner.
MERK: Velg Prosess av hele bildet til slutt slik at justeringer og terskler vil bli brukt over hele filmen. - Generer en overflate ved å klikke på pilknappen forover igjen. Deretter justerer du terskelen ved å endre histogrammet i filtre for å korrespondere med membransignalet.
- Etter at overflaten er generert, velg overflate i overflater / innstillinger for å visualisere overflatesignalet og fullføre overflategenereringsprosessen ved å trykke på dobbelttrådenArd pilknapp ( figur 3 B ).
- Gå til Surface | Rediger og klikk Mask alle i Maskegenskaper for å generere et maskert kanalbilde.
- Etter å ha klikket ok, åpnes maskeringsvinduet automatisk. Velg GFP-kanalen, sett voxels utenfor overflaten til den maksimale signalintensitetsverdien (funnet i Rediger | Skjermjustering ) og voxels inne i overflaten til minimum GFP intensitetsverdien (finnes også i Rediger | Displayjustering ), i Mask Settings for å generere en maske av membransignalet.
- Når masken på membransignalet vil bli vist i volumvisning , genererer du inverterte bilder ved å bruke bildebehandling Kontrastendring | Inverter ( Figur 3 C ).
- Oppdage flekker fra inverterte overflatebilder.
MERK: Denne delen gjør at midten av hver celle kan væreMerket med et unikt sted og sporet over plass og tid.- Velg Overgå scene | Spots | Opprett ; I Algoritminnstillinger velger du Segment bare en region av interesse , prosess for hele bildet til slutt og sporspots (over tid) .
- Klikk på fremoverpilen og angi en region av interesse; Velg region og tid (er) for å spore flekker; Fortsett å skyve fremoverpilen, velg den maskerte kanalen som kildekanal og fastslå estimert XY-diameter på punkter.
- Når du klikker på pilknappen forover, åpnes automatisk et filtervindu; Juster spotdeteksjonsterskelen ved å endre verdier i histogrammet for å generere enkeltpunkter i midten av hver celle ( figur 3 D ).
- Når du klikker på pilknappen fremover, åpnes algoritmvinduet ., Velg Autoregressiv bevegelsessporingsmodell 20 og angi maksimal sporing diHoldning og maksimum gap størrelse for å koble spor som blir diskontinuerlig i en kort periode.
- Når du klikker på pilknappen forover igjen, åpnes vinduet Filtre, angi lengdegrensen for spor ved å justere histogrammet slik at hver celle blir sporet. Hvis du klikker på den dobbelte pilknappen for fremover, avsluttes spotdetektering.
- For å korrigere vevdrift, klikk på Spots | Track Editor og velg Correct Drift . Et algoritme- vindu åpnes automatisk; Velg velg Translational drift, Inkluder hele resultatet , og korrigér objekter posisjoner .
- Generere utsiktsområder for kvantitativ analyse.
MERK: Programmets Scatterplot er et verktøy for å generere flerdimensjonale (X, Y, Z, Color and Scale) grafer med flere objekter. Disse tomtene er nyttige for å se trender av mange cellebevegelser over tid.- Lag 2D eller 3D plott av celleoppsporingsdata ved hjelp avVantage-Add New Vantage Plot-meny ( Figur 3 E og 3F ).
- Velg Volum eller Spots og velg Opprett / Kategori og Plot Type
- Juster Plot-verdier for å generere forskjellige Vantage-grafer.
- Eksporter grafer ved hjelp av stillbildefunksjonen .
MERK: Statistiske data kan også eksporteres som regneark for ytterligere kvantitativ analyse ved å klikke Plot Numbers Area | Lagre .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Levende avbildning av ganeeksplanteringskulturen avslørte flere cellulære prosesser som mediterer ganefusjon 6 . Initielle kontakter mellom to epitelceller er laget av membranfremspring ( Figur 2 B-2E ). Når to epitel lag møtes, danner de en flerkellet lagdelt MES etterfulgt av interkalering for å lage et integrert enkeltcellelag MES gjennom epitelial konvergens ( Figur 2 A-2E og Figur 2 K-2O ). Epitelceller i dypere Z-nivåer blir også gradvis forskjøvet til den orale siden av MES som bidrar til epithelial konvergensprosessen ( Figur 2 K ). Posterior-rettet cellemigrasjon ble observert i midtgomate MES ( Figur 2 F-2J ). I tillegg fant vi epithelial celle extRusjonshendelser under ganefusjon som antyder at epitelceller i MES kan fjernes ved denne aktive prosessen ( Figur 2 Q, 2T ). Den integrerte epithelialsømmen vil til slutt bryte ned for å oppnå mesenkymal konfluens ( Figur 2 S, 2T ).
Lifeact-mRFPruby- gane viste dynamiske actin-cytoskeletale omarrangementer under ganefusjon 6 . Filamentous actin ble beriket ved grensen mellom epitel- og mesenkymområder som danner en kabellignende struktur langs den fremre og bakre akse ( Figur 2 K-2T) . Actomyosin-kontraktilitet dirigerer epitelkonvergens og MES-brudd fordi kjemisk inhibering av enten myosinaktivitet eller aktinpolymerisering blokkerte disse dynamiske prosesser 6 .
Hin-page = "1"> Programvaren ble brukt til å spore cellulær oppførsel under ganefusjon. Den beste metoden for celleoppfølging avhenger av reporterens signal. Hvis en kjernefysisk reportermus brukes, kan programmet spore sentrum av fluorescerende signaler som cellesentre 21 . Kjernefysisk GFP-reportermus som ROSA26 GFP-NLS-lacZ ( GNZ) 22 kan derfor brukes til å merke epitelceller ved hjelp av vevsspesifikke Cre-linjer; I våre hender viste denne spesifikke kjernefysiske reporteren raskere bleking over det lange tidskurset som ble brukt i levende bildebehandling. Derfor benyttet vi membran-GFP-reporteren ( ROSA26-mTmG- flommen ) for å følge epitelcellbevegelser i våre studier. Dette krevde en metode for å identifisere og spore individuelle celler med et membran signal. For å løse dette problemet benyttet vi en modifisert celleoppsporingsmetode ( figur 3 og protokoll 4 ).
Innhold "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
Figur 1 : Skjematisk visning av musens sekundære gane-disseksjon. ( A ) Sett fra siden av E14.5 musembryo. For å dissekere palatal hyller ble hodet kuttet langs den første hvite prikkede linjen, # 1. ( B, C ) Den øvre hjernen (over den andre hvite linjen, # 2) ble fjernet. ( D, E ) Oral visning av dissekert hode. Nedre mandible (# 3) ble dissekert og tungen (# 4) ble fjernet. ( F ) Posterior del av hodet langs linjen # 5 ble kuttet ut. ( GI ) Både maxillene (# 6, # 7) og den fremre delen av overkjeven (# 8) ble fjernet. ( JL ) Nasal septum (# 9) ble fjernet ( M ) GFP signaler i MES av dissekert gane fra en K14-cre; ROSA26 mTmG musembryo . ( N ) Live bildebehandling oppsett. Den muntlige siden av palmenSpiste eksplanterte vendt ned for å bli avbildet med invertert konfokalmikroskop. MES er indikert med hvite pilehoder ( FI ). Det avbildede området er angitt med hvite prikkede bokser i L og M. Skalestenger = 2 cm i A, 1 cm i BI, 500 μm i JM. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 : Levende bildebehandling av ganeeksplante kulturer. ( AE ) Live avbildning av den fremre sekundære ganen fra en K14-cre; ROSA26 mTmG eksplantat (5 μm dybde). Den hvite pilen viser et membranprespresjon fra en epitelcelle ( FJ ) Live avbildning av midtgommen fra K14-cre; ROSA26 mTmG eksplantat (5 μm depth). Hvite piler indikerer retningen av cellemigreringer fra den fremre til bakre gane. ( KO ) Levende avbildning av den fremre ganen fra Lifeact-mRFPruby explant (5 μm dybde). Epitelcellerforskyvning (gul pil) til munnoverflaten og konvergens for å danne en integrert MES med kabellignende aktinstrukturer i midtlinjen. ( PT ) Levende avbildning av den fremre ganen fra Lifeact-mRFPruby explant (25 μm dybde). Den røde pilen indikerer en celleekstruderingshendelse ( Q, T ). Fremtidige bruddpunkter på sømmen er angitt med to vertikale hvite piler i S og T. Skalestenger = 20 μm. Alle levende bildedata i denne figuren er hentet fra eksperimenter tidligere publisert i 6 . Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
siders = "en"> 
Figur 3 : Dataanalyse. ( AD ) For å spore epitelceller med membran GFP signaler fra K14-cre; ROSA26 mTmG- ganeeksplanter ( A ), En overflate ble generert ved volumgjennomføring av membran-GFP-signalet ( B ). Inverterte bilder ble generert etter maskering av den opprettede overflaten ( C ). Cellulære sentre ble identifisert fra de omvendte bildene ved hjelp av en spot-detekteringsfunksjon i Imaris ( D ). ( E ) 3D-rekonstruksjoner tillater sporing av cellebevegelser i flere retninger. A: anterior, P: posterior, N: nasal, O: oral ( F ) 2D-analyse genererer et utsiktsdiagram som viser celler som migrerer fra forreste til bakre retning i mellomstore gane MES. Skalestenger = 20 μm i AD, 10 μm i EF.S / ftp_upload / 56041 / 56041fig3large.jpg "target =" _ blank "> Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Video Figur 1: Live bildebehandling av K14-cre; ROSA26-mTmG flox anterior gane (5 μm dybde). Bilder ble fanget hvert 10. minutt (10 min / ramme) i 16 h 20 min, Skalbjelke = 25 μm. Denne videoen er en annen Z-posisjon for en film som tidligere ble publisert i referanse 6 . Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Video Figur 2: Live bildebehandling av K14-cre; ROSA26-mTmG flox Midt gane (5 μm dybde). Bilder ble fanget hvert 15. minutt (15 min / ramme) i 13 h 30 min. Skalbjelke = 25 μm. Denne videoen har tidligere blitt publisert i referanse 6 . Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Video Figur 3: Levende bildebehandling av Lifeact-mRFPruby fremre gane (5 μm dybde).
Bilder ble tatt hver 10 min (10 min / ramme) i 7 timer 50 min. Skalbjelke = 20 μm. Denne videoen har tidligere blitt publisert i referanse 6 . Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Video Figur 4: Live bildebehandling av Lifeact-mRFPruby fremre gane (25 μm dybde).
Bilder ble tatt hver 10 min (10 min / ramme) i 7 timer 50 min. Skalbjelke = 20 μm. Denne videoen er en annen Z-posisjon for en film som tidligere ble publisert i referanse 6 . Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Levende avbildning av vevsmorfogenese med 3D organteksplanteringskultur kan gi detaljert informasjon om cellulære prosesser som ikke kan vises i konvensjonell fargingsanalyse av faste vevseksjoner. Ved å bruke in vitro eksplanterende kultur av musemuskulær sekundær gane, observerte vi flere interessante cellulære oppføringer som førte oss til å foreslå en ny mekanisme av ganefusjon som involverer epitelkonvergens og celleekstrudering.
En felles utfordring i studier av denne typen er fotoblekking ved kontinuerlig lasereksplitasjon over en lang tidskurs. I våre studier ble det brukt et hvitt lys-konfokal og et roterende disk-konfokalmikroskop. En viss reduksjon i signalintensiteten over tid kan korrigeres ved blekingskorrigeringer i bildebehandlingsprogrammet (LAS-AF) (protokoll 4.1). Fordi blekekorrigering er begrenset, er det viktig å nøye optimalisere laserstrøm og eksponeringstid i hvert bildesystem. Vi sjekket ogsåAt ganefusjonen skjer normalt i levende bildemedia etter 3 dagers kultur 6 .
Et annet vanlig problem i levende bildebehandling er vevdrift. Det er kritisk å minimere drift for å få konsistente bilder under levende bildebehandling, fordi endringer i fokusplanet kan forveksle forståelse av morfogenetiske endringer over tid. Mens kontroll av termisk drift kan oppnås i mange konfokale mikroskoper (Definitivt fokus i mikroskopet), kan vevets drift i forhold til glassbunnen ikke korrigeres ved disse metodene. Utnyttelse av agarose, samt å plassere eksplanteringen mot glassbunnen, bidrar til å minimere dette, men det må bare tas hensyn til å analysere de filmene som opprettholder en relativt konstant posisjon. Dette kan bestemmes ved å følge flere kontrollpunkter i bildefeltet over tid for å avgjøre om de forblir konstant, flytte med en lignende trend, eller flytte annerledes. I en grad, ved bruk av post-processing fuNksjoner tillater en korreksjon av noe vevdrift i levende bildebehandling (protokoll 4.2).
Lavmeltende agarose ble brukt ved en sluttkonsentrasjon på 0,6% i levende bildemedia for å immobilisere eksplanterte vev. Når vi testet høyere konsentrasjoner av agarose, syntes de å svekke vevsmorfogenese, muligens på grunn av mekanisk begrensning. Det er derfor viktig å bruke riktig agarosekonsentrasjon for å minimere vevdrift mens det ikke forstyrrer morfogenese.
På grunn av konfokal billeddybde, utgjør denne metoden grenser for å undersøke svært dype Z-planer av ganefusjon. Ved hjelp av både WHITE LIGHT og spin-disk-konfokale mikroskoper, kan signal fra 100 μm dybder bli avbildet vellykket, selv om bildet begynte å bli kjedelig og svakt over denne grensen. Fordi ganefusjon er en progressiv prosess i oronasale og anteroposterior-aksene, foreslår vi at imaging flere stillinger effektivt muliggjør bildebehandling av forskjellige deptHs av ganefusjon, men to-foton eller lette konfokalmikroskopi kan brukes i fremtiden for å forbedre dybden av avbildning. I de fleste av våre eksperimenter ble den muntlige siden av ganeeksplantere avbildet. Imaging av nesesiden av ganen explant er vanskelig fordi neseseptum er fusjonert eller svært nær sekundære palatal hyller. I vårt forsøk på å fusere bildet fra nesen, var det også nødvendig å fjerne det ekstra nasale vevet slik at det ikke forstyrret signalet fra ganeepitelet. Imidlertid var det mulig å avbilde nesesiden av ganeeksplanteren fordi disseksjon av neseseptum ofte forårsaket skade på ganeeksplanter.
Levende avbildning av reportermusevævseksplanter er en kraftig metode for å studere cellulære mekanismer av vevsmorfogenese under embryonisk utvikling. Ved hjelp av konfokalmikroskopiteknikker og kvantitativ bildeanalyse kan grunnleggende utviklingsprosesser som sekundær ganefusjon væreUndersøkt på mobilnivå.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker M. Douglas Benson for innledende samtaler om sekundær gane-bildebehandling. Vi anerkjenner også David Castaneda-Castellanos (Leica) og Chris Rieken (Zeiss) for deres hjelp til å justere bildeforhold i konfokal mikroskopi. Vi setter pris på Lynsey Hamilton (Bitplane) for nyttige forslag til kvantitativ bildeanalyse ved hjelp av Imaris-programvare. Dette arbeidet ble finansiert av NIH / NIDCR R01 DE025887.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| DMEM/F12 | Life technology | 11330-032 | |
| Fetal Bovine Serum | Life technology | 16000-044 | |
| L-glutamine | Life technology | 25030-081 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma | A4544-100G | |
| Pennicillin/Streptomycin | Life technology | 15140-122 | |
| Low melting agarose | BioExpress | E-3111-125 | |
| 35 mm glass bottom dish | MatTek | P35G-1.5-10-C | |
| Petrolieum Jelly (Vaseline) | Sigma | 16415-1Kg | |
| Mice | |||
| Keratin14-cre | MGI: J:65294 | Allele = Tg(KRT14-cre)1Amc | |
| ROSA26mTmG | MGI: J:124702 | Allele = Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo | |
| Lifeact-mRFPruby | MGI: J:164274 | Allele = Tg(CAG-mRuby)#Rows | |
| Microscope | |||
| White Light SP5 confocal microscope | Leica Microsystems | ||
| Cell Observer spinning disk confocal microscope | Zeiss Microscopy |
References
- Ray, H. J., Niswander, L. Mechanisms of tissue fusion during development. Dev. Camb. Engl. 139, 1701-1711 (2012).
- Dudas, M., Li, W. -Y., Kim, J., Yang, A., Kaartinen, V. Palatal fusion - where do the midline cells go? A review on cleft palate, a major human birth defect. Acta Histochem. 109, 1-14 (2007).
- Bush, J. O., Jiang, R. Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development. Development. 139, 231-243 (2012).
- Lan, Y., Xu, J., Jiang, R. Cellular and Molecular Mechanisms of Palatogenesis. Curr Top Dev Biol. 115, 59-84 (2015).
- Taya, Y., O'Kane, S., Ferguson, M. W. Pathogenesis of cleft palate in TGF-b3 knockout mice. Development. 126, 3869-3879 (1999).
- Kim, S., et al. Convergence and Extrusion Are Required for Normal Fusion of the Mammalian Secondary Palate. PLOS Biol. 13, 100122 (2015).
- Yoshida, M., et al. Periderm cells covering palatal shelves have tight junctions and their desquamation reduces the polarity of palatal shelf epithelial cells in palatogenesis. Genes Cells. 17, 455-472 (2012).
- Fitchett, J., Hay, E. Medial edge epithelium transforms to mesenchyme after embryonic palatal shelves fuse. Dev. Biol. 131, 455-474 (1989).
- Akira, N., et al. The expression of TGF-beta3 for epithelial-mesenchyme transdifferentiated MEE in palatogenesis. J Mol Hist. 41, 343-355 (2010).
- Sani, F. V., et al. Fate-mapping of the epithelial seam during palatal fusion rules out epithelial-mesenchymal transformation. Dev. Biol. 285, 490-495 (2005).
- Jin, J. -Z., Ding, J. Analysis of cell migration, transdifferentiation and apoptosis during mouse secondary palate fusion. Development. 133, 3341-3347 (2006).
- Xu, X., et al. Cell autonomous requirement for Tgfbr2 in the disappearance of medial edge epithelium during palatal fusion. Dev. Biol. 297, 238-248 (2006).
- Carette, M. J., Ferguson, M. W. The fate of medial edge epithelial cells during palatal fusion in vitro: an analysis by Dil labelling and confocal microscopy. Development. 114, 379-388 (1992).
- Muzumdar, M., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
- Dassule, H., Lewis, P., Bei, M., Mass, R., McMahon, A. Sonic hedgehog regulates growth and morphogenesis of the tooth. Development. 127, 4775-4785 (2000).
- Eisenhoffer, G., et al. Crowding induces live cell extrusion to maintain homeostatic cell numbers in epithelia. Nature. 484, 501-546 (2012).
- Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nat Methods. 5, 605-607 (2008).
- Riedl, J., et al. Lifeact mice for studying F-actin dynamics. Nat Methods. 7, 168-169 (2010).
- Can, A., et al. Attenuation correction in confocal laser microscopes: a novel two-view approach. J Microsc. 211, (2003).
- Veenman, C., Reinders, M., Backer, E. Resolving motion correspondence for densely moving points. IEEE Trans Pattern Anal Mach Intell. 23, 54-72 (2001).
- Udan, R., Piazza, V., Hsu, C., Hadjantonakis, A., Dickinson, M. Quantitative imaging of cell dynamics in mouse embryos using light-sheet microscopy. Development. 141, 4406-4414 (2014).
- Stoller, J., et al. Cre reporter mouse expressing a nuclear localized fusion of GFP and beta-galactosidase reveals new derivatives of Pax3-expressing precursors. Genesis. 46, 200-204 (2008).
