Summary
Piezoelectric सर्जरी मानव मैक्सिलोफैशियल और दंत शल्य चिकित्सा में सुधार करने के लिए नेतृत्व किया गया है । हम चूहों में कपाल खिड़की सर्जरी के लिए piezoelectric सर्जरी का अनुकूलन करने के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित किया है ।
Abstract
Multiphoton माइक्रोस्कोपी vivo मेंइमेजिंग न्यूरॉन्स के लिए व्यापक रूप से अनुकूलित किया गया है. दोहराया इमेजिंग एक कपाल खिड़की के आरोपण या खोपड़ी के thinning दोहराया की आवश्यकता है । कपाल खिड़की सर्जरी आमतौर पर एक उच्च गति रोटरी ड्रिल के साथ प्रदर्शन किया है, और कई जांचकर्ताओं यह नाजुक बाडी और रक्त वाहिकाओं को नुकसान पहुंचाने से ड्रिल को रोकने के लिए चुनौतीपूर्ण लगता है । व्यापक प्रशिक्षण और अभ्यास अंतर्निहित ऊतक को नुकसान के बिना हड्डी को दूर करने के लिए आवश्यक है और इस प्रकार कपाल खिड़की सर्जरी मुश्किल हो सकता है, समय लेने वाली, और ऊतक क्षति का उत्पादन. Piezoelectric सर्जरी, जो बड़े पैमाने पर मैक्सिलोफैशियल और दंत शल्य चिकित्सा के लिए प्रयोग किया जाता है, अल्ट्रासोनिक कंपन का इस्तेमाल कोमल ऊतकों को नुकसान पहुंचाए बिना हड्डी को दूर करने के लिए । हम एक piezoelectric सर्जरी लागू करने के लिए multiphoton इमेजिंग के लिए तैयार करने में चूहों में कपाल खिड़की सर्जरी में सुधार विधि विकसित की है । हमारी प्रयोगशाला के भीतर तुलना पता है कि विधि कम सर्जरी समय की आवश्यकता है और एक रोटरी ड्रिल के साथ कपाल खिड़की सर्जरी से खून बह रहा ड्युल के कारण जटिलताओं की एक कम औसत दर है ।
Introduction
multiphoton इमेजिंग के लिए कुतर तैयार करने के लिए कपाल खिड़की सर्जरी vivo में तंत्रिका विज्ञान में एक महत्वपूर्ण तकनीक बन गया है । हटाने या हड्डी के thinning एक multiphoton माइक्रोस्कोप के साथ ऑप्टिकल इमेजिंग के लिए माउस को तैयार करने के लिए आवश्यक है । इस सर्जरी या तो पूरी तरह से हड्डी के एक क्षेत्र को हटाने के लिए अंतर्निहित बाडी1, या पूर्ण हटाने के बिना हड्डी के एक क्षेत्र से thinning द्वारा किया जाता है2बाडी । पतली खोपड़ी दृष्टिकोण कम सूजन और microglia के सक्रियण का उत्पादन कर सकते हैं3 लेकिन इमेजिंग की एक उथले गहराई, एक छोटे इमेजिंग विंडो आकार (२०० µm) और एक सीमित समय अवधि के दौरान जो खिड़की की हड्डी regrowth 2 के कारण छवि हो सकता है प्रदान करता है . एक पॉलिश और प्रबलित ग्लास विंडो (बंदरगाहों) के अलावा इमेजिंग आकार और इमेजिंग अवधि में वृद्धि कर सकते हैं, लेकिन4प्रदर्शन करने के लिए मुश्किल है ।
दोनों मौजूदा सर्जरी पतली या खोपड़ी से हड्डी को दूर करने के लिए एक उच्च गति रोटरी ड्रिल का उपयोग करें । पतली खोपड़ी तकनीक भी ड्रिल के बाद एक स्केलपेल का उपयोग करता है और आगे पतली हड्डी2। बंदरगाहों तकनीक4धैर्य के साथ उच्च गति चमकाने के अतिरिक्त कदम की आवश्यकता है । एक उच्च गति रोटरी ड्रिल में, एक हवा संचालित टरबाइन या विद्युत मोटर एक उच्च वेग पर स्पिन करने के लिए ड्रिल बिट का कारण बनता है । के रूप में रोटरी ड्रिल खंड दोनों हड्डी और कोमल ऊतक, वहां बाडी और अंतर्निहित रक्त वाहिकाओं को नुकसान का खतरा है । सर्जरी की सफलता सर्जन के कौशल पर निर्भर करता है । यांत्रिक शल्य चिकित्सा पद्धतियों के साथ तैयार इन खिड़कियों के अलावा, ऑप्टिकली अलग समाधान के साथ खोपड़ी समाशोधन की एक रासायनिक विधि5,6विकसित किया गया है । हालांकि, चूंकि piezoelectric सर्जरी सर्जरी की एक यांत्रिक पद्धति है, हमारी तुलना यहां अंय यांत्रिक तरीकों तक ही सीमित होगी ।
Piezoelectric सर्जिकल डिवाइस अंतर्निहित कोमल ऊतकों को नुकसान पहुँचाए बिना खनिज हड्डी को तोड़ने के लिए अल्ट्रासोनिक कंपन का उपयोग, और इस तरह तेजी से पतली हड्डी का एक बड़ा क्षेत्र के लिए एक दृष्टिकोण प्रदान करते हैं । एक piezoelectric सर्जिकल हाथ टुकड़ा में, टरबाइन सिरेमिक डिस्क के ढेर की जगह है और जब वर्तमान लागू किया जाता है, डिस्क अल्ट्रासोनिक आवृत्तियों पर कांपना । कंपन हाथ टुकड़ा के माध्यम से हीरे लेपित युक्तियां के माध्यम से स्थानांतरित कर रहे है कोमल ऊतकों को नुकसान पहुंचाए बिना हड्डी के माध्यम से कटौती, रोटरी अभ्यास पर एक फायदा है कि ऊतक प्रकार के बीच भेदभाव नहीं करते । Piezoelectric सर्जरी मूल रूप से मानव में Tomaso Vercellotti द्वारा उपयोग के लिए विकसित किया गया था और दंत चिकित्सा और cranio-maxilofacial सर्जरी में सुधार करने के लिए एलईडी7,8,9,10,11 .
Piezoelectric सर्जरी Wistar चूहों में एक osteotomy बनाने के लिए इस्तेमाल किया गया है और चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग द्वारा पाया गया था (एमआरआई) और प्रोटोकॉल एक पारंपरिक दंत ड्रिल से काफी कम नुकसान का उत्पादन करने के लिए12. लेखकों ने निष्कर्ष निकाला कि piezoelectric सर्जरी सॉफ्ट ब्रेन टिशू के पास की हड्डी को हटाने के लिए सुरक्षित थी । चूहों, तथापि, एक पतली बाडी है कि अधिक आसानी से क्षतिग्रस्त है, और है कि अध्ययन पुरानी ऑप्टिकल इमेजिंग के लिए खिड़कियां तैयार नहीं किया । क्रोनिक इमेजिंग की आवश्यकता है कि रक्त वाहिकाओं और क्षतिग्रस्त नहीं है कि रक्त के थक्के खिड़की के नीचे फार्म नहीं है । बाडी को नुकसान सूजन की ओर जाता है कि खिड़की बादल के कारण होता है, और सक्रिय microglia और प्रतिक्रियाशील astrocytes के प्रसार । यहां हम चूहों के लिए piezoelectric सर्जरी अनुकूलित किया है दोनों पतली खोपड़ी और पूर्ण हड्डी हटाने कपाल पुरानी इमेजिंग के लिए उपयुक्त खिड़कियां बनाने के लिए । हम कपाल खिड़की सर्जरी एक उच्च गति रोटरी ड्रिल के साथ तैयार करने के लिए इस शल्य चिकित्सा तकनीक की तुलना में ।
Protocol
सभी जानवरों को शामिल प्रक्रियाओं कोलंबिया विश्वविद्यालय चिकित्सा केंद्र संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा निर्धारित मानकों के अनुसार प्रदर्शन किया गया । इच्छामृत्यु ketamine १०० मिलीग्राम/किलो और xylazine के साथ संज्ञाहरण के तहत गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के माध्यम से किया गया था 10 मिलीग्राम/किलोग्राम intraperitoneally इंजेक्शन । सभी शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं एक बाँझ तरीके से प्रदर्शन किया गया (सर्जन सिर टोपी पहने हुए था, चेहरा मुखौटा, बाँझ दस्ताने, और साफ डिस्पोजेबल लैब कोट) और शल्य चिकित्सा उपकरण प्रत्येक उपयोग के बीच autoclaved थे.
1. शल्य चिकित्सा कदम
- आटोक्लेव सभी शल्य चिकित्सा उपकरणों को बाँझ सुनिश्चित करने के लिए ।
- Anesthetize C57bl6 चूहों के साथ isoflurane (4% प्रेरण और सर्जरी के लिए 1.5-2% के लिए). हिंद पैर की अंगुली हर 10 मिनट चुटकी संज्ञाहरण की उचित गहराई सुनिश्चित करने के लिए । संज्ञाहरण बढ़ाएं अगर वोकलिज़ेशन या हिंद अंग कर्षण देखा है ।
- आंखों के लिए पशु चिकित्सा नेत्र स्नेहक लागू करने के लिए सुखाने को रोकने ।
- बालों को हटाने जेल के एक 3 मिनट के आवेदन के साथ खोपड़ी पर या एक बिजली के रेजर के साथ शेविंग से बाल निकालें ।
- stereotaxic फ्रेम में एक हीटिंग पैड या नपे पानी विसंचारी कंबल 38 डिग्री सेल्सियस करने के लिए सेट पर माउस प्लेस ।
- शल्य चिकित्सा analgesia प्रदान करने के लिए चमड़े के buprenorphine (०.१ मिलीग्राम/
- तीन chlorhexidine या betadine और ७०% इथेनॉल के एक कपास का उपयोग कर applicator इत्तला दे दी अनुप्रयोगों बारी के साथ खोपड़ी को संक्रमित ।
- स्थानीय संज्ञाहरण प्रदान करने के लिए खोपड़ी के तहत खारा में ५०% पतला bupivacaine के १०० मिलीलीटर सुई ।
2. Piezoelectric कपाल खिड़की सर्जरी
- autoclaved बाँझ शल्य चिकित्सा उपकरणों का उपयोग कर, एक परिपत्र पैटर्न में शल्य कैंची के साथ काटने से खोपड़ी पर खोपड़ी के एक 1 सेमी सर्कल निकालें. खोपड़ी से सिर उठा हड्डी पर periosteum ऊतक उजागर ।
- संदंश की नोक का उपयोग करने के लिए किसी भी शेष periosteum ऊतक के उजागर हड्डी स्पष्ट परिमार्जन । यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि दंत सीमेंट बाद में गिर नहीं होगा ।
- piezoelectric सर्जरी इकाई सेट करने के लिए सबसे कम सेटिंग पर कांपना । उच्च सेटिंग्स तीव्र कंपन के कारण रक्त वाहिकाओं को तोड़ सकता है कि ध्यान दें ।
- बाँझ परिपत्र टिप हाथ टुकड़ा करने के लिए ठीक करें ।
नोट: 4 मिमी परिपत्र टिप अच्छी तरह से सर्जरी के लिए अनुकूल है. बड़ी टिप आकार सर्जरी की गति के लिए योगदान के रूप में पूरी खिड़की एक साथ thinned किया जा सकता है । - बर्फ ठंडा कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (ACSF) के साथ एक 10 मिलीलीटर सिरिंज भरें और हाथ में पकड़ piezoelectric हाथ टुकड़ा नहीं पकड़ो ।
- 1 मिलीलीटर की दर से खोपड़ी पर सिरिंज से ACSF टपकता द्वारा खोपड़ी सिंचाई/वैकल्पिक रूप से, एक सिकुड़नेवाला दूसरे हाथ के उपयोग को मुक्त करने के लिए खोपड़ी पर तैनात पंप का उपयोग करें ।
नोट: शीत ACSF के साथ सिंचाई उच्च आवृत्ति कंपन से घर्षण के कारण overheating को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है । - धीरे एक प्रकाश परिपत्र गति के साथ खोपड़ी के लिए हिल सर्जिकल टिप लागू करें (1 एस प्रति 3 हलकों) और पतली वांछित गहराई करने के लिए एक पतली खोपड़ी की तैयारी करने के लिए हड्डी (5 से 10 मिनट) ।
नोट: यहां, 4 मिमी खिड़कियों कि 20 µm को thinned थे बनाया गया था । हालांकि, विंडो का आकार सर्जिकल टिप के आकार के साथ भिंन होगा । हड्डी की मोटाई वांछित गहराई समय की लंबाई के आधार पर समायोजित किया जा सकता खोपड़ी के लिए टिप लागू बिताया । - धीरे हाथ टुकड़ा के कोण को समायोजित करने और टिप के कोण बदलने के लिए खोपड़ी के लिए एक समान रूप से खोपड़ी पतली करने के लिए दबाव लागू करते हुए ।
- के पीछे किसी भी पतली हड्डी छोड़ने के बिना एक पूरी हड्डी हटाने प्रदर्शन करने के लिए, पतली दरार तक खिड़की क्षेत्र के आसपास दिखाई दे रहे है हड्डी । अंतर्निहित बाडी को नुकसान पहुंचाए बिना संदंश के साथ पतली हड्डी के बचे हुए गुच्छे को हटा दें ।
- ठंड ACSF में hemostatic कोलेजन फोम का एक 1 मिमी टुकड़ा सोख । संदंश के साथ गीले फोम पकड़ो और यह पतली खोपड़ी पर जगह है । इसके बारे में 30 एस के लिए पतली खोपड़ी पर बैठने के लिए विकासशील से किसी भी सूक्ष्म खून बह रहा है बंद करो ।
- संदंश का प्रयोग करें एक 4 मिमी गिलास coverslip बाद में खिड़की है कि हड्डी में thinned किया गया है पर जगह है ।
- एक छोटे से प्लास्टिक या लकड़ी के कपास की पीठ का प्रयोग करें applicator इत्तला दे दी लगभग १०० µ एल को लागू करने के लिए दंत एक्रिलिक खोपड़ी के लिए जगह में खिड़की पकड़ ।
3. पोस्ट सर्जिकल देखभाल
- शल्य तंत्र से माउस निकालें और यह वसूली के लिए एक गर्म पिंजरे में जगह है । यह लगातार निगरानी जब तक यह पूर्ण चेतना (सामांय गतिशीलता, चाल, और व्यवहार द्वारा मूल्यांकन) फिर से प्राप्त किया है ।
- कम गतिविधि, सौंदर्य, भोजन, और पानी की खपत, गार्ड व्यवहार (जैसे लंगड़ा या एक कूबड़ मुद्रा) या वृद्धि की आक्रामकता सहित बाद शल्य चिकित्सा दर्द की अभिव्यक्ति के लिए तीन दिनों के लिए एक दिन में दो बार जानवरों का आकलन करें । यह पूरी तरह से बरामद किया है जब तक पशु अन्य जानवरों की कंपनी के लिए वापस नहीं करते ।
- Buprenorphine प्रशासन (0.05 – 0.1 मिलीग्राम/) एक एनाल्जेसिक 8-12 घंटे के लिए सर्जरी के बाद 3 दिनों के रूप में । खिड़की के क्षेत्र की निगरानी बारीकी से dehiscence, सूजन, और संक्रमण के लक्षण के लिए सर्जरी के बाद । यदि पशु आधार रेखा खिलाने और व्यवहार को संवारने के लिए वापस नहीं करता है, एक संभव हस्तक्षेप या इच्छामृत्यु के बारे में पशुचिकित्सा परामर्श ।
Representative Results
piezoelectric सर्जरी के साथ आगे बढ़ने से पहले, खोपड़ी से किसी भी अवशिष्ट periosteum निकालें । एक बार खोपड़ी अपारदर्शी और चिकनी है (आंकड़ा 1a), सर्जन piezoelectric सर्जरी शुरू हो सकता है । जब हिल पीजो टिप के साथ हड्डी को हटाने, यह बर्फ ठंड ACSF के साथ खोपड़ी की सिंचाई के लिए महत्वपूर्ण है । ACSF (चित्र 1b) में नीचे 1 मिमी टिप के जलमग्न होने पर उचित सिंचाई प्राप्त होती है । उचित सिंचाई के बिना, हड्डी से ज़्यादा गरम और मस्तिष्क को नुकसान होगा । खोपड़ी सर्जन द्वारा चुना वांछित गहराई को thinned किया गया है के बाद, वहाँ हड्डी में स्थित रक्त वाहिकाओं से कुछ अवशिष्ट रक्तस्राव हो सकता है । आदेश में तेजी से सभी खून बह रहा संघर्ष करने के लिए, एक छोटे से 1 मिमी कोलेजन ACSF में लथपथ खिड़की के क्षेत्र में फोम का टुकड़ा लागू होते हैं । चलो कोलेजन लगभग 30 एस (चित्रा 1c) के लिए खोपड़ी पर बैठते हैं । बाद कोलेजन फोम हटा दिया जाता है, खिड़की पारदर्शी दिखाई देगा, बाडी में रक्त वाहिकाओं के स्पष्ट दृश्य की अनुमति । बाडी को बिना महत्वपूर्ण चोटे के बरकरार रखा जाएगा । (चित्र 1 d) । यदि बाडी लाल और सूजन दिखाई देता है, यह संभावना बहुत अधिक दबाव से टूटी हुई रक्त वाहिकाओं के कारण सर्जरी के दौरान टिप करने के लिए आवेदन किया । नई विंडो की रक्षा और पुरानी इमेजिंग के लिए तैयार करने के लिए, एक गिलास coverslip क्षेत्र पर रखा जाना चाहिए । एक ठीक से लागू ग्लास coverslip धीरे खिड़की के शीर्ष पर बैठ जाएगा और क्षेत्र के लिए किसी भी नुकसान का कारण नहीं होगा । ग् coverslip पूरी विंडो को कवर करना होगा । यदि कांच की coverslip को खोपड़ी पर ठीक से लागू किया गया है, तो खिड़की शीशे के नीचे पारदर्शी बनी रहेगी । बाडी में सभी रक्त वाहिकाएं अभी भी दिखाई देंगी (फिगर 1e) । चिकित्सकीय एक्रिलिक कांच coverslip के आसपास लागू करने के लिए स्थाई रूप से यह खोपड़ी की सतह के लिए पालन करना चाहिए । ग्लास coverslip के किनारों को भी दंत एक्रिलिक में कवर किया जाना चाहिए (चित्रा 1f) ।
हमने पाया है कि piezoelectric सर्जरी आम तौर पर एक पारंपरिक कपाल खिड़की की तुलना में बहुत तेजी से है, सर्जरी के प्रति 10-12 मिनट (चित्र 2a) के आसपास ले । हमने यह भी पाया कि वहां कम बाडी चोट और खून बह रहा है के रूप में नेत्र (चित्रा बी) द्वारा मनाया के कारण जटिलताओं थे । एक ठीक से तैयार खिड़की vivo मेंcortical न्यूरॉन्स में फ्लोरोसेंट संकेतकों के multiphoton इमेजिंग की अनुमति देगा । हम छवि के लिए चुना लाल कैल्शियम संकेतक JRGECO1a परत 4 cortical न्यूरॉन्स के सेल निकायों में (चित्र 3ए-बी). हम phaser का उपयोग तैयार खिड़की के माध्यम से इन सेल निकायों में कैल्शियम यात्रियों का पालन कर सकता है ।
चित्रा 1: Piezoelectric सर्जरी । (क) खोपड़ी के बाद इसे ठीक से phase के लिए तैयार किया गया है. सभी periosteal ऊतक हटा दिया गया है, एक चिकनी और साफ सतह छोड़कर । (ख) प्रगति में phaser की एक प्रतिनिधि छवि । नीचे 1 मिमी हिल सर्जिकल टिप बर्फ ठंड ACSF में जलमग्न है । द्रव 1 मिलीलीटर की दर से खोपड़ी के लिए लागू किया जाता है/ एक प्रकाश परिपत्र गति खोपड़ी के लिए लागू किया जाता है और हड्डी अल्ट्रासोनिक कंपन के माध्यम से thinned है । (ग) के बाद खोपड़ी thinned किया गया है, एक 1 मिमी कोलेजन फोम के परिपत्र टुकड़ा ठंडे ACSF में भिगो दिया है करने के लिए खिड़की पर आराम करने के लिए अनुमति दी है हड्डी से किसी भी सूक्ष्म खून बह रहा है । (घ) एक पारदर्शी बाडी के साथ एक सफल खिड़की बरकरार रक्त वाहिकाओं के सभी प्रदर्शित करता है । मस्तिष्क की सतह के लिए कोई दिखाई क्षति या चोट नहीं है । (ङ) मस्तिष्क की सतह की रक्षा के लिए खिड़की के ऊपर एक काँच का coverslip रखा जाता है. (च) दंत एक्रिलिक खोपड़ी के लिए लागू किया जाता है के लिए स्थाई रूप से खिड़की पर कांच coverslip ठीक । स्केल बार सभी छवियों में 1 मिमी ।
चित्र 2. phaser या दंत चिकित्सा ड्रिल सर्जरी के लिए प्रशिक्षण में सफलता दर की तुलना. (क) शल्यक्रिया के प्रति औसत समय दंत ड्रिल सर्जरी (पी < 0.05, दो पूंछ टी टेस्ट) n = प्रति समूह 30 सर्जरी और प्रति सर्जन औसत 10 सर्जरी से phaser के लिए कम था । (बी) सफल सर्जरी का प्रतिशत (350X ज़ूम करने के लिए सेट उद्देश्य के माध्यम से सर्जन की आंख से मनाया के रूप में कोई खून बह रहा है या दिखाई क्षति के रूप में परिभाषित करने के लिए) (n = 30 प्रत्येक समूह के लिए सर्जरी, एक पुच्छ z परीक्षण) । त्रुटि पट्टियां दिखाएं SD ।
चित्र 3. Multiphoton एक कपाल phaser के साथ thinned खिड़की के माध्यम से vivo में इमेजिंग । (एक) कैल्शियम यात्रियों लाल कैल्शियम सूचक JRGECO1a के साथ मनाया vivo मेंmurine मोटर प्रांतस्था में परत 4 पिरामिडीय ंयूरॉंस में imaged थे । स्केल बार = १०० µm. (B) एक ही विंडो लेकिन परत 4 मोटर प्रांतस्था के विभिंन क्षेत्र । Headfixed 3 मिमी खिड़की phaser के साथ तैयार के साथ माउस । स्केल बार = 30 µm. एक multiphoton माइक्रोस्कोप, 40X उद्देश्य, १०४० एनएम उत्तेजना तरंग दैर्ध्य के साथ imaged ।
Discussion
शल्य चिकित्सा टिप बदलकर सर्जरी संशोधित किया जा सकता है । वहां कई टिप के विभिंन आकारों कि हाथ टुकड़ा करने के लिए लागू किया जा सकता है । आकार या टिप के आकार को बदलने के विभिंन आकार खिड़कियों में परिणाम होगा । 4 मिमी टिप के अलावा, हम भी एक 3 मिमी टिप की कोशिश की और यह भी अच्छी तरह से काम किया पाया. यहां तक कि बर्फ ठंड ACSF के साथ सिंचाई के साथ, हम कर रहे थे सुझाव है कि बहुत संकीर्ण थे के साथ अच्छे परिणाम प्राप्त नहीं कर रहे थे (लगभग ०.२५ मिमी) केंद्रित कंपन के कारण बहुत अधिक गर्मी और जलने की हड्डी के लिए अंतर्निहित बाडी को नुकसान के लिए अग्रणी । हम अंय सुझाव है कि उपलब्ध है की भीड़ की कोशिश नहीं की है, और हम पूर्वानुमान है कि अंय प्रयोगशालाओं इन विभिंन युक्तियों के लिए नए आवेदन मिल सकता है । जबकि सर्जरी अपेक्षाकृत सरल है, हमने पाया है कि वहां कई कदम है कि समस्या निवारण की आवश्यकता हो सकती है । पहला यह है कि हिल टिप ACSF में अशांति का एक बहुत पैदा करता है, जो दृश्यता घटता है और सर्जरी के कदम thinning हड्डी के दौरान हड्डी की गहराई का पता लगाने में कठिनाई पैदा करता है । हम अनुशंसा करते हैं कि यदि यह देखना भी मुश्किल है कि कितनी पतली हड्डी है तो हड्डी के किनारे एक बाँझ सूती झाड़ू लगाने से खोपड़ी और खिड़की को सूखने के लिए तोड़ लें । कपास झाड़ू सीधे खिड़की के लिए लागू नहीं है, के बाद से किसी न किसी सतह पतली हड्डी के लिए हानिकारक है । गहराई की जांच करने के बाद, reapply ACSF और सर्जरी के साथ जारी है । हमने यह भी पाया कि अगर बाडी को नुकसान होता है, तो आमतौर पर इसकी वजह सर्जन की नोक पर बहुत ज्यादा दबाव डालना होता है. हाथ टुकड़ा पकड़ और धीरे और कम बल लागू होने की संभावना इस समस्या को ठीक करेंगे । यदि सर्जन हड्डी पर टिप को जबरन नोच रहा है, तो यह पतली हड्डी में एक ब्रेक का कारण बनेगा और खोपड़ी को नुकसान पहुंचाता है । अंत में, अगर हड्डी thinning के बाद, अंतर्निहित बाडी चोट लगती है, यह कंपन से अतिरिक्त गर्मी के कारण की संभावना है । ACSF प्रवाह की दर बढ़ाने से यह समस्या ठीक हो जाएगी ।
phaser की मुख्य सीमा है कि हाथ टुकड़ा हड्डी पतली कर सकते हैं, लेकिन बाडी के ऊपर सभी हड्डी को हटा नहीं सकते । हीरे लेपित टिप छोटे किसी न किसी धक्कों है । खोपड़ी को पतली करने के लिए मलाई की जरूरत होती है और अगर यह सब हड्डी को दूर करने के लिए इस्तेमाल किया गया था abrade बाडी और रक्तस्राव का कारण । इस प्रकार, संदंश का उपयोग शेष पतली परत को दूर करने के लिए आवश्यक है । जबकि वहां पर बहस चल रही है कि क्या एक पतली खोपड़ी के माध्यम से इमेजिंग कम सूजन और microglia और प्रतिक्रियाशील astrocytes के कम प्रसार का उत्पादन, कुछ मामलों में कोई हड्डी शेष के साथ एक खिड़की पसंद है, जैसे, इमेजिंग 3 की एक बड़ी गहराई प्रदान करने के लिए .
हम चूहों में multiphoton इमेजिंग के लिए कपाल खिड़की तैयारी अनुकूलित है । phaser, हमारे ज्ञान के लिए है, ऑप्टिकल इमेजिंग के लिए कपाल खिड़की सर्जरी कुतर piezoelectric तकनीक का पहला आवेदन । हम पाते है कि चूहों में piezoelectric सर्जरी के उपयोग की गति में वृद्धि के लाभ और प्रतिकूल घटनाओं में कमी भी मानव में रिपोर्ट7,8,9,10। piezoelectric डिवाइस का उपयोग तेजी से सर्जरी (चित्रा 2a) और एक उच्च गति रोटरी ड्रिल की तुलना में जब रक्तस्राव की कम प्रतिकूल घटनाओं (चित्रा बीसी) में हुई । हम यह भी पाया, हमारे प्रयोगशाला के भीतर, कि phaser आसान था नए सर्जन के लिए कपाल खिड़की सर्जरी के लिए पारंपरिक दृष्टिकोण से जानने के लिए । गति और उपयोग में आसानी के लाभ सर्जन के बीच अलग होने की संभावना है । पतली खोपड़ी की तैयारी आम तौर पर एक ड्रिल और स्केलपेल2के साथ पतली हड्डी के लिए 30-45 मिनट की आवश्यकता होती है, जबकि phaser दृष्टिकोण आम तौर पर आवश्यकता से कम 10 मिनट ।
हमने पाया है कि windows phaser के साथ तैयार हम परत में कैल्शियम यात्रियों की छवि सकता है 4 मोटर प्रांतस्था में हवामहल न्यूरॉन्स कि adeno एसोसिएटेड वायरस के साथ transfected किया गया था कैल्शियम संकेतक JRGECO1a (AAV9. Syn-jRGECO1a WPRE SV40) । हम यह भी पाया कि, एक पतली खोपड़ी कपाल एक रोटरी ड्रिल और स्केलपेल के साथ तैयार की खिड़की की तुलना में, इमेजिंग क्षेत्र बड़ा था, जबकि एक पतली एक रोटरी ड्रिल और स्केलपेल के साथ तैयार खोपड़ी 20 µm व्यास 2 की एक इमेजिंग विंडो है . phaser के साथ, हम जल्दी से 3-4 mm के एक क्षेत्र पतली करने में सक्षम थे । यह4पोर्ट के साथ रिपोर्ट इमेजिंग विंडो के समान है । यह बड़ी खिड़की तेजी से एक दंत ड्रिल और स्केलपेल के साथ तैयार पतली खोपड़ी खिड़कियों के लिए रिपोर्ट इमेजिंग के लाभ बरकरार रखती है । इसके अलावा, phaser के साथ तैयार खिड़की तुरंत imaged किया जा सकता है, के रूप में पारंपरिक हड्डी हटाने खिड़कियां है कि सप्ताह की आवश्यकता को ठीक से पहले खिड़की बेहतर हो सकता है3छवि के लिए विरोध कर सकते हैं ।
इस तकनीक बाडी के तहत जहाजों में रक्त के प्रवाह में परिवर्तन अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है । एक महत्वपूर्ण भविष्य के अध्ययन के लिए कपाल खिड़की के अंय तरीकों के साथ phaser के immunoreactivity तुलना है । यह निर्धारित करने के लिए यदि phaser मौजूदा तरीकों की तुलना में कम सूजन पैदा महत्वपूर्ण होगा । हमें उंमीद है कि piezoelectric सर्जिकल तकनीक यहां प्रलेखित और अधिक प्रयोगशालाओं कपाल खिड़कियां प्रदर्शन और सफलतापूर्वक vivo मेंmultiphoton इमेजिंग का उपयोग करने की अनुमति होगी ।
सुनिश्चित करें कि हाथ टुकड़ा निंनतम सेटिंग पर कंपन करने के लिए सेट है और ACSF एक स्थिर दर पर सिंचित किया जा रहा है । बर्फ ठंडा ACSF लगातार लागू किया जाना चाहिए या यह गर्मी और बाडी को नुकसान होगा । हमने पाया है कि ACSF के एक दर पर लागू किया जाना चाहिए कम 1 मिलीलीटर/या तो एक हाथ में आयोजित सिरिंज का उपयोग करें, या एक सिकुड़नेवाला पंप का उपयोग करें, के बजाय हाथ टुकड़ा में निर्मित सिंचाई । हाथ टुकड़ा में सिंचाई प्रणाली भी जबरदस्ती ACSF बाहर निकालता है और बहुत अशांति है, जो काफी दृश्यता ख़राब करेगा पैदा करता है ।
Disclosures
कोई खुलासे नहीं हो रहे हैं ।
Acknowledgments
टेलर Zeric इस पत्र में multiphoton छवि प्राप्त करने के लिए मदद करने के लिए । मस्तिष्क और व्यवहार, पार्किंसंस और JPB मूलाधार, R01 MH108186 और R01 DA07418 द्वारा समर्थित । F31 फैलोशिप 1F31MH109293-01A1 एस सी के लिए ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Piezosurgery Touch | Mectron | 5120062 | Piezosurgery GP model has the same settings |
| Circular 4mm flat piezosurgery tip (# OT11) | Mectron | 3370019 | This tip was ideal for our windows but there are many other tips of different sizes availible. |
| Stereotax frame | Kopf | 963 | |
| Mouse adaptor | Stoelting | 51625 | |
| Peristaltic pump for irrigation. | Cole-Parmer | WU-77120-42 | Makes it easier to irrigate and frees up the other hand to provide stability. Irrigation can be performed by hand with a syringe if necessary. |
| Avitene Ultrafoam | Bard-Davol | 1050020 | Important to stop any minor bleeding instantly. |
| C&B Metabond | Parkell | S380 | Much stronger than regular dental acrylic. |
| Artificial cerebro spinal fluid (ACSF) | Tocris | 3525 | |
| Puralube opthalmic ointment | Dechra | 17033-211-38 | |
| Mice | JAX | 664 | |
| Prairie Ultima multiphoton microscope | Bruker | ||
| JRGECO1a (AAV9.Syn.NES-jRGECO1a.WPRE.SV40) | UPENN Vector Core |
References
- Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat Protoc. 4, 1128-1144 (2009).
- Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. Thinned-skull cranial window technique for long term imaging of the cortex in live mice. Nat protoc. 12, 213-220 (2010).
- Dorand, D. R., Barkauskas, D. S., Evans, T. A., Petrosiute, A., Huang, A. Y. Comparison of intravital thinned skull and cranial window approaches to study CNS immunobiology in the mouse cortex. Intravital. 3, e29728-1-e29728-8 (2014).
- Drew, P. J., et al. Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull. Nat Methods. 7, 981-984 (2010).
- Wang, J., Zhang, Y., Xu, T. H., Luo, Q. M., Zhu, D. An innovative transparent cranial window based on skull optical clearing. Laser Physics Letters. 9, (2012).
- Yang, X., et al. Skull Optical Clearing Solution for Enhancing Ultrasonic and Photoacoustic Imaging. IEEE Trans Med Imaging. 35, (2016).
- Vercellotti, T. Piezoelectric surgery in implantology: a case report--a new piezoelectric ridge expansion technique. Int J Periodontics Restorative Dent. 4, 358-365 (2000).
- Vercellotti, T., De Paoli, S., Nevins, M. The piezoelectric bony window osteotomy and sinus membrane elevation: introduction of a new technique for simplification of the sinus augmentation procedure. Int J Periodontics Restorative Dent. 6, 561-567 (2001).
- Vercellotti, T., Podesta, A. Orthodontic microsurgery: a new surgically guided technique for dental movement. Int J Periodontics Restorative Dent. 4, 325-331 (2007).
- Stubinger, S., Stricker, A., Berg, B. I. Piezoelectric surgery in implant dentistry. Clin Cosmet Investig Dent. 7, 115-124 (2015).
- Basheer, S. A., Govind, R. J., Daniel, A., Sam, G., Adarsh, V. J., Rao, A. Comparative Study of Piezoelectric and Rotary Osteotomy Technique for Third Molar Impaction. J Contemp Dent Pract. 18, 60-64 (2017).
- Pavlikova, G., et al. Piezoelectric surgery prevents brain tissue damage: an experimental study on a new rat model. Int J Oral Maxillofac Surg. 40, 840-844 (2011).
