बढ़ाता मानव Monocyte Chemotaxis इन विट्रो और Murine लिम्फोसाइट ्े में Vivo
Summary
लिम्फोसाइट chemotaxis और माइग्रेशन के मात्रात्मक आकलन के लिए प्रोटोकॉल इम्यूनोलॉजी अनुसंधान के लिए महत्वपूर्ण उपकरण हैं । यहां, एक इन विट्रो प्रोटोकॉल का वर्णन है कि वास्तविक समय, सेल प्रवास के मल्टीप्लेक्स मूल्यांकन, साथ ही vivo तकनीक में एक पूरक तिल्ली के लिए देशी कोशिकाओं की ट्रैकिंग को सक्षम करने के लिए अनुमति देता है ।
Abstract
Chemotaxis एक विशिष्ट रासायनिक ग्रैडिएंट1के साथ माइग्रेशन है । Chemokines chemotactic साइटोकिंस है कि शारीरिक और लौकिक विशिष्टता2के साथ सेलुलर तस्करी को बढ़ावा देने के हैं । Chemotaxis लिम्फोसाइटों और अंय प्रतिरक्षा कोशिकाओं है कि मात्रात्मक इन विट्रो मेंमूल्यांकन किया जा सकता है की एक महत्वपूर्ण कार्य है । इस पांडुलिपि का वर्णन विधियों कि chemotaxis के मूल्यांकन की अनुमति, दोनों विट्रो में और vivo में, सेल लाइनों और देशी कोशिकाओं सहित विविध प्रकार के सेल के लिए । इन विट्रोमें, प्लेट आधारित प्रारूप वास्तविक समय में एक साथ कई शर्तों की तुलना परमिट, और 1-4 एच के भीतर पूरा किया जा सकता है इन विट्रो परख शर्तों में एगोनिस्ट और विरोधी परिचय करने के लिए हेरफेर किया जा सकता है, साथ ही chemokinesis से chemotaxis अंतर है, जो यादृच्छिक आंदोलन है । के लिए vivo में तस्करी आकलन, प्रतिरक्षा कोशिकाओं को कई फ्लोरोसेंट रंगों के साथ लेबल और adoption हस्तांतरण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । कोशिकाओं की अवकलन लेबलिंग एक ही जानवर में पेश किया जा करने के लिए मिश्रित कोशिका आबादी के लिए अनुमति देता है, जिससे विचरण कम और एक पर्याप्त रूप से संचालित प्रयोग के लिए आवश्यक जानवरों की संख्या को कम करने. लसीकावत् ऊतक में प्रवास के रूप में छोटे रूप में 1 ज में होता है, और कई ऊतक डिब्बों का नमूना लिया जा सकता है । फ्लो cytometry निंनलिखित ऊतक फसल के कई प्रकार के सेल के प्रवासी पैटर्न के एक तेजी से और मात्रात्मक विश्लेषण के लिए अनुमति देता है ।
Introduction
मजबूत प्रतिरक्षा कक्ष प्रकार के असंख्य के जटिल लौकिक और स्थानिक समंवय की आवश्यकता है ताकि उचित प्रतिक्रिया के लिए चोट, संक्रमण और आत्म सहनशीलता उत्पंन करते हैं । कई दर्जन chemokine रिसेप्टर्स और उनके इसी लाइगैंडों की खोज की गई है और जो विशिष्ट कोशिकाओं को एक विशिष्ट समय में एक विशिष्ट ऊतक में निर्देशित किया जा सकता है आणविक तंत्र प्रदान विशेषता । इस प्रकार, chemotaxis और प्रवास का अध्ययन इम्यूनोलॉजी अनुसंधान का एक अनिवार्य घटक है । दरअसल, इन विट्रो में वर्णित परख हाल ही में एक स्क्रीनिंग उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया गया था एक chemotactic cofactor कि सी की ओर टी कोशिकाओं की chemotaxis में बढ़ौतरी की पहचान सी सी chemokines 19 और 213। यहां वर्णित तरीकों के प्रयोजन के लिए इन विट्रो में और vivo मेंप्रतिरक्षा कोशिका chemotaxis के मात्रात्मक आकलन की अनुमति है ।
Boyden (सेल प्रवास और आक्रमण) चैंबर परख एक सस्ती, प्रतिलिपि है, और सेल प्रवास का आकलन करने के लिए तेजी से विधि4,5। मानक परख में, ऊपरी कक्ष कोशिकाओं के साथ वरीयता प्राप्त है, और एक निचले कक्ष से एक छिद्रित डालने के द्वारा अलग है, जिसमें कोशिकाओं को स्थानांतरित । वांछित समय पर, कोशिकाओं है कि डालने के नीचे करने के लिए चले गए तय किया जा सकता है और प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा quantitation के लिए दाग । हालांकि, इस तरह के माप आरै डेटा संग्रह के लिए एक अंत बिंदु है, जो गतिशील डेटा संग्रह precludes और विश्लेषण के लिए इष्टतम समय बिंदु निर्धारित करने के लिए व्यापक अनुकूलन की आवश्यकता कर सकते हैं । यहाँ, कई रूपांतरों वर्णन किया गया है कि अनुमति वास्तविक समय, मात्रात्मक और chemotaxis के division माप में इन विट्रो.
के लिए vivo में अध्ययन, एक कार्यात्मक अंत बिंदु उपयोग किया जाता है, अर्थात् एक दिया ऊतक डिब्बे में कोशिकाओं के विशिष्ट संचय । पूर्व लेबल दाता कोशिकाओं को अपनाने के हस्तांतरण के माध्यम से प्राप्तकर्ता पशुओं में पेश कर रहे हैं । इन दाता कोशिकाओं को बाद में प्राप्तकर्ता ऊतक फसल के बाद प्रवाह cytometry द्वारा की पहचान की जा सकती है । भी प्रस्तुत एक सह लेबलिंग रणनीति है कि एक प्राप्तकर्ता जानवर के भीतर विभिंन प्रकार के सेल के तस्करी के निर्धारण के लिए अनुमति देता है । इस विधि सेल इंजेक्शन से अंतर-पशु भिंनता समाप्त, और शारीरिक अंतर पशु परिवर्तनशीलता के लिए खाते ।
Protocol
सभी कार्यविधियों को अनुमोदित किया गया रॉकफेलर University & #39; s संस्थागत पशु परिचर्या और उपयोग समिति. सभी जानवरों को विशिष्ट रोगज़नक़-मुक्त शर्तों के तहत घर में थे ।
1. इन विट्रो Chemotaxis Culture THP-1…
Representative Results
Discussion
प्रतिरक्षा सेल प्रवास के ठहराव सरल और तेजी से दोनों विट्रो में और vivo मेंपरख का उपयोग कर पूरा किया जा सकता है । हम प्रदर्शन एक एमसीपी-1 ढाल और सीरम द्वारा वृद्धि के जवाब में मानव monocytes के इन विट्रो chemota…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम के रॉकफेलर विश्वविद्यालय में चिकित्सक वैज्ञानिकों के लिए बर्नार्ड एल Schwartz कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया था, रॉकफेलर विश्वविद्यालय में Robertson चिकित्सीय विकास निधि, और Sackler में एक चिकित्सा और पोषण अनुसंधान के लिए केंद्र रॉकफेलर विश्वविद्यालय ।
Materials
| RPMI-1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875-093 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630-080 | |
| Fetal Bovine Serum | ATCC | 30-2020 | |
| Cell culture flask | Corning | 353136 | |
| Calcein AM | Thermo Fisher Scientific | C1430 | Excitation: 485nm, Emission: 520nm |
| Cell culture dish | Corning | 1007 | |
| 24 well plate | Corning | 353504 | |
| Fluoroblok Fibronectin Insert | Corning | CB354597 | |
| 15 mL conical tube | Corning | 352097 | |
| Bovine Serum Albumin | Cell Signaling Technology | 9998S | |
| Human Recombinant MCP-1 | Peprotech | 300-04 | |
| Adult bovine Serum | Sigma | B9433 | |
| HBSS with calcium and magnesium; no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
| SpectraMax M2e plate reader | Molecular Devices | ||
| Olympus IX71 inverted fluorescence microscope | Olympus | ||
| Isothesia | Henry Schein animal health | 11695-6776-2 | Isofluorane anesthesia |
| Cell strainer 40um nylon | Falcon Corning | 352340 | |
| ACK lysing buffer | Quality Biological | 118-156-101 | |
| CellTracker Orange CMTMR Dye | Thermo Fisher Scientific | C2927 | Excitation: 541nm, Emission: 565nm |
| CellTracker Green CMFDA Dye | Thermo Fisher Scientific | C2925 | Excitation: 485nm, Emission: 520nm |
| 5ml syringe | BD Syringe | 309646 | |
| 1ml TB syringe | BD Syringe | 309625 | |
| THP-1 cell line | ATCC | TIB-202 | |
| Brilliant Violet 421 anti-mouse CD3 Antibody | Biolegend | 100228 | Excitation: 405nm, Emission: 421nm |
| Brilliant Violet 605 anti-mouse CD19 Antibody | Biolegend | 115540 | Excitation: 405nm, Emission: 603nm |
| 96-well round bottom plate | Corning | 353077 | |
| LSRII | BD Biosciences | Flow cytometer |
References
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