Summary
淋巴细胞趋化和迁移定量评估的协议是免疫学研究的重要工具。在这里, 一个体外协议的描述, 允许 real-time, 多路复用的细胞迁移评估, 以及一个互补的体内技术, 使本机细胞跟踪脾脏。
Abstract
趋化是沿着特定的化学渐变1进行迁移。趋化因子是趋细胞素, 促进细胞贩运的解剖和时间特异性2。趋化性是淋巴细胞和其他免疫细胞的重要功能, 可以定量评估体外。这份手稿描述的方法, 允许评价的趋化性, 无论是体外和在体内, 不同的细胞类型, 包括细胞株和本机细胞。体外, plate - based 格式允许在 real - time 中同时进行多个条件的比较 , 并且可以在 1 - 4 小时内完成 .体外化验条件可以纵引入激动剂和拮抗药 , 以及区分趋化与 chemokinesis, 这是随机运动。对于体内的贩运评估, 免疫细胞可以用多种荧光染料标记, 并用于过继转移。细胞的差别标记允许混合细胞的人口被引入到相同的动物, 从而减少方差和减少动物的数量, 需要一个充分的动力实验。迁移到淋巴组织发生在1小时, 和多个组织隔间可以取样。组织收获后的流式细胞术可以快速定量分析多种细胞类型的迁移模式。
Introduction
强健的免疫力需要复杂的时间和空间协调的各种细胞类型, 以适当的反应, 以伤害, 感染和产生发生。发现了几十种趋化因子受体及其相应的配体, 并提供了分子机制, 使特定的细胞能够在特定的时间内被定向到特定的组织中。因此, 研究趋化和迁移是免疫学研究的一个不可缺少的组成部分。事实上, 所描述的体外检测方法最近被用作筛选工具, 用于识别趋因子, 加速 T 细胞向 c-c 趋化因子19和 213的趋性。这里描述的方法的目的是允许定量评估免疫细胞趋化性在体外和在体内。
博伊登 (细胞迁移和侵入) 室检测是一种廉价, 可重现, 快速评估细胞迁移的方法4,5。在标准的化验中, 上部的腔室与细胞一起播种, 并由较低腔内的多孔插入物隔开, 细胞迁移到其中。在所需时间, 迁移到插入的底部的细胞可以固定和染色的光显微镜定量。但是, 此类测量将数据收集限制在单个端点, 这就排除了动态数据收集, 并且需要进行广泛的优化以确定最佳的分析时间点。在这里, 一些适应的描述, 允许 real-time, 定量和多路测量的趋化性在体外。
对于在体内的研究, 使用一个功能终点, 即特定组织室中细胞的具体积累。预标记的供体细胞通过过继转移引入受体动物。这些供体细胞随后可以通过流式细胞术在受体组织收获后进行识别。还提出了一个 co-labeling 的战略, 允许确定在单一受体动物的不同细胞类型的贩运。这种方法消除了细胞注射的 inter-animal 变异, 并解释了生理 inter-animal 变异性。
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Protocol
所有程序均由洛克菲勒大学和 #39 的机构动物保育和使用委员会批准。所有动物都在特定的无病原体条件下居住.
1. 体外 趋化
- 区域性 THP-1 单元格 6 在罗斯威尔公园纪念学院 1640 (RPMI 1640) 补充10% 胎牛血清 (FBS) 和 4-(2-羟乙基)-1-piperazineethanesulfonic 酸 (HEPES; 25 毫米) (完整介质), 保持密度介于 0.5-1.0 x 10 6 单元格/mL 之间.
- 在35毫米细胞培养皿中, 标签 3.5 x 10 5 THP-1 细胞每条件与素乙酰 (素-AM; 2.5 和 #181; M) 或其他合适的荧光染料在完整的媒体37和 #176; C 为 30 min.
注意: 染料必须是细胞膜渗透性和与活细胞标签兼容. - 预热一个平板阅读器到37和 #176; C.
注意: 除了温度控制之外, 还需要底层读取功能。请参阅步骤 1.10.2, 以了解用于量化迁移单元的平板阅读器的替代方法. - 当细胞标记时, 准备化验板和下腔.
- 使用24个良好的组织培养板, 每个井都有一个条件。每三个条件执行一次.
- 添加750和 #181; 汉克和 #39 的缓冲盐溶液 (HBSS) 以25毫米 HEPES 和0.1% 牛血清白蛋白 (BSA) 缓冲到24井板。这担当基本的控制情况。
- 将其他井用于比较器条件, 始终保持750和 #181 底部腔室的总体积; L.
注: 在这个例子中, 人类单核细胞趋化蛋白 protein-1 (MCP-1) 充当趋化 7 的阳性控制。- 通过将 HBSS 与 25 mM HEPES、BSA (0.1%) 和 MCP-1 (75 ng/毫升) 组合在一起来组装试剂混合物。使用成年牛血清 (2.7% v/v) 与 MCP-1 作为一个额外的阳性对照.
注意: 趋化因子和趋化因子浓度将取决于研究中的趋轴。冻干 MCP-1 是悬浮在蒸馏水与 BSA (0.1%), 使一个股票的解决方案, 最终浓度为50和 #956; 克/毫升。这可以稀释在水中的工作解决方案, 10 和 #956; 克/毫升。添加5.6 和 #956; 我的这个解决方案, 以较低的会议厅.
- 通过将 HBSS 与 25 mM HEPES、BSA (0.1%) 和 MCP-1 (75 ng/毫升) 组合在一起来组装试剂混合物。使用成年牛血清 (2.7% v/v) 与 MCP-1 作为一个额外的阳性对照.
- 将其他井用于比较器条件, 始终保持750和 #181 底部腔室的总体积; L.
- 在底部室的组成完成后, 将一个多孔插入到每个井中, 确保插入的制表符与板的凹槽对齐.
注: 为插入物选择合适的孔径大小。对于单核细胞和淋巴细胞, 孔径大小为3和 #956; m 执行良好。一些细胞类型和/或趋化因子系统可能需要一个基体涂层表面的最佳迁移。例如, 为了测量 THP-1 单核细胞趋化向 MCP-1, 纤维连接蛋白或胶原涂层的刀片推荐。对于平板阅读器的定量, 插入必须有一个 light-impermeant 涂层, 如聚乙烯对苯二甲酸乙酯, 以防止检测的 non-migrating 细胞在上部商会 8 .
- 在将单元格素为30分钟后, 将单元格悬挂转换为15mL 锥形管。离心细胞在 1000 x g, 2 分钟, 视觉检查细胞, 以确认摄取素 AM ( 图 1 ).
- 小心地用真空器去除上清液。在无血清 RPMI 1640 中, 用 HEPES 25 毫米补充标记细胞。离心细胞在 1000 x g 2 分钟, 并丢弃上清液.
- 重细胞在无血清 RPMI 1640 补充与 HEPES 25 毫米。计算单元格并调整音量, 使单元格的最终浓度为 1.0-1.5 x 10 6 单元格/mL.
- 免除250和 #956; L 细胞悬浮入插入物 (上部房间).
- 在所有上部腔都被填满后, 轻轻地抬起板, 检查底部是否存在可能干扰迁移和检测的气泡。要删除气泡, 首先尝试移除定位插入。如果不成功, 使用27克针刺穿气泡, 然后重新插入.
- 将板放入 5ml 37 和 #176; C 板读取器.
- 从底部获取荧光读数, 间隔为1-3 分钟。在使用素时, 分别将荧光激发和发射波长设置为 485 nm 和 520 nm。根据细胞类型和趋化因子系统, 趋性典型地发生 1-4 h ( 图 2A ).
- 作为使用平板读取器进行连续测量的替代方法, 使用倒置的荧光显微镜 ( 图 2B ) 对油井进行图像处理, 分别能够在 485 nm 和 520 nm 上激发和探测光。使用低放大倍数来捕获插入的底部的大部分。通过使用 ImageJ 或类似软件 9 处理图像来量化单元格.
2。小鼠淋巴细胞的过继转移
- 供体细胞的制备
- 麻醉8-12 周老的 C57BL/6J 雄性供体鼠用异氟醚麻醉 (1-3%) 使用汽化器。用脚趾捏确定适当的麻醉深度.
- 将鼠标置于仰卧位。用手术刀做中线切口, 并在左上腹间隙找到脾脏。把整个脾脏和地方全部切除 (RPMI 补充 10% FBS 和25毫米 HEPES; 1 毫升/脾脏) 在冰上。安乐通过斩首来麻醉供体动物.
- 将脾组织轻轻地通过40和 #181; m 尼龙网入完全媒介 (1 毫升/脾脏) 使用注射器柱塞的末端做一个单细胞悬浮并且转移到15毫升圆锥形管.
- 添加4卷氯化铵钾 (ACK) 裂解缓冲液, 并在室温下孵育5分钟以溶解红细胞.
- 在室温下离心 1000 x g 的细胞2分钟并丢弃上清液。如果红细胞留在颗粒, 重在 ACK 裂解缓冲液, 孵育5分钟的室温, 离心细胞在 1000 x g 2 分钟和丢弃上清.
- 将完整介质中的单元格重为 2-5x10 7 单元/mL, 然后通过40和 #181 将细胞悬浮变形; m 尼龙网格去除细胞碎片.
- 标签 1 x 10 7 与活细胞相容的荧光染料的细胞/受体小鼠, 在随后的固定时将保留, 如 5-chloromethylfluorescein 乙酸酯 (最终浓度2和 #956; M) 10 .孵育在37和 #176; C 为 30 min.
注意: 要跟踪多个细胞的数量, 使用其他的荧光染料与额外的细胞数量。例如, 部分供体细胞可以用 5-(和-6)-(((4-氯甲基) 苯甲酰胺) 甲基 (最终浓度2和 #956; M) 11 . - 添加4卷 HBSS 补充25毫米 HEPES, 然后离心在 1000 x g 为 2 min 和放弃上清液。重颗粒在 HBSS 补充 HEPES 25 毫米到最后浓度 1 x 10 8 细胞/毫升。
- 如果使用多个荧光染料, 请将单元格的数量保持分离, 直到注入之前.
- 将每个颜色的单元格的小分 (10 #956; L) 转换为固定液 (1 毫升), 用于以后的流式细胞术补偿.
- 转移淋巴细胞
- 麻醉8-12 周前的 C57BL/6J 雄性受体小鼠, 使用汽化器 (1-3%); 通过脚趾掐确定麻醉深度。将兽医软膏应用于动物和 #39 的眼睛, 防止干燥.
- 短暂的旋涡供体细胞 (1 s) 和转移到1毫升注射注射器与27克, 0.5 针, 结合差异标记细胞的人口, 如果适用。
- 将混合单元中的小分 (10 #956; L) 转换为固定液 (1 毫升), 用于随后的流式细胞仪分析.
- 将供体动物置于俯卧位置。将轻度的尾侧压力施加到眼部的皮肤背部, 使眼球微微凸出.
- 引导针内侧并注入100和 #181; 供体细胞悬浮液 L 轨道到每个接收鼠标。细胞也可以通过尾静脉注入.
- 逐渐撤回注射针, 并将鼠标单独放在回收笼中。监视动物直到它恢复知觉;一旦完全恢复, 将动物归还给社会住房.
- 收集和分析
- 后1小时, 麻醉接受异氟醚麻醉的小鼠 (1-3%) 使用汽化器; 用脚趾掐确定麻醉深度。收获脾脏 (或其他组织的利益) (步骤 2.1.2) 从每个接收鼠标和地方到完整的媒体 (1 毫升/收件人)。安乐通过斩首来麻醉动物.
注: 组织收获前较长的时间间隔将通过至少24小时增加组织积累. - 将脾组织轻轻地通过40和 #181; m 尼龙网状成完整的媒体使用注射器柱塞的结束, 使一个单细胞悬浮和转移到15毫升锥形管.
- 添加4卷的 ACK 裂解缓冲液, 室温孵育5分钟。在室温下离心 1000 x g 的细胞悬浮液2分钟并丢弃上清.
- 重细胞在染色缓冲 (磷酸盐缓冲盐水补充与 1% FBS)。计算单元格并调整到最终浓度 3 x 10 7 单元/毫升。转移100和 #181; L 细胞悬浮到一个96井圆的底板.
- 用流式细胞仪分析所需标记 (参见材料表) 的染色单元。添加荧光共轭抗体 (见材料表) 与所需的标记和孵化在4和 #176; C 为20分钟在黑暗中。添加100和 #181; L 染色缓冲液, 离心 1000 x g 的细胞3分钟, 并丢弃上清.
- 重200和 #181 中的颗粒; L 染色缓冲液, 离心 1000 x g 的细胞3分钟, 并丢弃上清.
- 重125和 #181 中的颗粒; 使用标准程序使用流式细胞仪染色缓冲液和采集样品.
注: 绿色染料是兴奋的 488 nm 激光和发射检测与505和530/30 分色过滤器。橙色染料是兴奋的 561 nm 和排放是检测到的582/15 分色过滤器。- 使用从2.1.8.2 中保存的单元格来补偿每个荧光染料.
注: 使用 bead-based 补偿与荧光匹配的激励和发射光谱的标记染料将导致次优补偿. - 使用来自步骤2.2.2.1 的已保存的输入单元格, 以准确确定在使用多个标记的填充 ( 图 3 ) 时差异标记的输入单元格的比率。根据标记为未标记的单元格的比率来计算组织特定的迁移 ( 图 4 ).
- 使用从2.1.8.2 中保存的单元格来补偿每个荧光染料.
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Representative Results
当使用素染料时, 细胞的视觉检查将确认标签的摄取 (图 1)。自动荧光读数将跟踪迁移, 随着时间的推移, 随着细胞的底部插入。这些数据清楚地显示了诱导细胞迁移向 MCP-1, 以及增加这种反应的血清 (图 2A)。根据迁徙刺激的强度, 在信号增加之前至少有15分钟的滞后。荧光信号可能会峰值, 然后逐渐下降。这代表了附着在插入物底部的细胞数量的净减少, 因为细胞以比从上部腔室迁移的速率更快的速度传入到下腔。更强的迁徙刺激通常会导致早期的荧光值上升;b) 荧光增加速度加快;和 c) 较高的峰值荧光值。还显示了倒置荧光显微镜获得的代表性图像 (图 2B), 具有单元计数的定量 (图 2C)。
对于在体内使用多个荧光标签的研究, 重要的是定量在输入材料中细胞数量的相对比例。这说明了注入混合单元格填充的方差 (图 3)。在这种情况下, 绿色和橙色荧光细胞的比例是0.97:1。因此, 考虑到这种轻微的不平衡, 绿色荧光细胞计数除以 0.97, 以指数他们的数量与输入材料的比例。通过流式细胞仪对标记细胞进行量化后, 可量化为被恢复的细胞总数除以被标记细胞数量。
这些结果说明了采用双色策略的优点, 消除了不同注射效果的影响;虽然在动物之间有很大的差异, 但对于任何特定动物来说, 绿色荧光与橙色荧光细胞的比值大致相等 (图 4)。这些结果是预期的, 因为两个细胞的数量是相同的, 但各种扰动可以测试其对淋巴细胞归巢的影响。偏离标识线将表明特定细胞群的不同迁移能力。此外, 多细胞亚群可以确定通过染色的恢复细胞为所需的蛋白质。在这里, T 细胞, 由 CD3 染色, 和 B 细胞, 表明由 CD19 染色也同样比例的绿-橙-荧光细胞恢复。
图 1: 单元格标记.标记后的细胞颗粒的目视检查证实了荧光染料的充分摄取 (左), 与之前的标签 (右) 相反。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2:体外迁移的量化。从 real-time 中获取的 () 代表性数据 (平均±标准错误) 比较3条件: 培养基 (控制), 趋化因子 (MCP-1, 75 ng/毫升) 或趋化因子与血清 (MCP-1, 75 ng/毫升和牛血清, 2.7% 伏/v 在缓冲液中).读数是从板的底部获得每3分钟的激发波长 485 nm 和探测波长 520 nm。(B) 代表显微在1小时内插入的底部的4X 放大倍数, 允许直接可视化迁移细胞。缩放条形图 = 500 µm (黄色)。(C) 使用 ImageJ 软件对每个低字段 (LPF; 4X) 的单元格数进行量化。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 染色的输入单元格.流式细胞仪图显示两个差异染色细胞的比例, 在注入细胞输入从步2.2.2.1。从这一地块确定的比率, 用于纠正在两个种群初始混合时引入的方差, 并用于在下游数据分析期间调整单元计数。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: 从受赠动物的脾脏中恢复的标记细胞的比率.绿色荧光或橙色荧光细胞的比例被显示为总回收脾的百分比, 每个数据点代表单个受体动物。总标记的细胞显示 (三角形), 以及对细胞表面标记 CD19 (方形) 或 CD3 (圆) 染色阳性的子集。虚线是颜色之间的比例等于1的标识行。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
免疫细胞迁移的定量化可以通过简单和快速的检测来实现, 这两种方法都是体外和体内。我们证明了体外对人单核细胞的趋化反应的 MCP-1 梯度和增强血清。在体内, 供体小鼠脾有差异标记和继过继转移后, 从接受动物中回收。
使用平板阅读器的优点是采样几个时间点 (像每年三十年代一样频繁) 和自动化迁移细胞的定量。这省却需要选择一个单一的时间点, 以评估和避免更 labor-intensive 的方法手动计数个别井。此外, 这种方法提供的动态信息比可以通过显微镜收集。在分析过程中, 必须记住, 细胞会脱落插入到底部腔, 并不会导致荧光强度。因此, 在插入物的底面上的细胞数量, 如相对荧光所示, 将是迁移速率和细胞从插入物脱落的速率的函数。
较大的细胞可能需要一个具有较大孔隙的插入物, 并且有8微米的多孔插入。较小的细胞 (包括原生淋巴细胞) 可能不够亮, 不能通过 fluorimeter 可靠的检测, 可能需要通过显微镜进行评估, 特别是对趋化性的小变化。一些细胞类型可能会迅速进入下腔溶液, 而在插入物上没有足够长的停留时间来检测, 从而形成一条平坦的曲线。在这种情况下, 细胞可以通过细胞仪直接从下腔的解决方案, 或矩阵涂层插入可以用来延长运输时间, 除了使用一个小孔插入 (例如1 μ m)。
对这些化验的关键是确定可靠的洄游条件。对于体外研究, 所研究的细胞类型必须能够响应趋化因子, 并且必须考虑必要的因素。在上部腔室中引入的细胞密度可能需要进行优化。一般而言, 较高的密度会产生更强的信号, 但这需要与更高的非特异迁移信号平衡。测试一系列的趋化因子浓度也可以帮助确定合适的时间窗口来捕获迁移。
这种方法也可以适应使用多种颜色。这可以减少变异性, 同时增加单个化验中可包括的条件数。主要考虑的是荧光染料的亮度。素是非常明亮的, 因此很容易通过显微镜和平板阅读器的应用检测。而用于体内的染料的研究不容易被显微镜检测和产生高的背景;据推测, 这也将排除准确的平板读取器检测。
对于体内的研究, 供体细胞的健康对于保持其迁移功能很重要。捐赠细胞的收获应作为 non-survival 手术的一部分, 而不是牺牲捐赠动物, 然后收获细胞, 这增加了缺血和细胞死亡的可能性。在不同细胞数量的实验中, 注射与收获之间的时间是一个重要的考虑因素;细胞数量的差异或相似程度可能随着时间的推移而改变。从捐卵者收获后的处理时间, 直到注射到接收方应尽量减少。此外, 捐助者/受援国的兼容性也很重要。尽管物种异基因细胞在短时间内耐受, 但人类细胞将被老鼠迅速排斥。例如, 我们没有发现迁移细胞与 C57BL/6J 或 balb/c/cJ 捐赠者在1小时内与 C57BL/6J 受体使用的差异。
此体内方法对于评估迁移能力的差异很有用。输入细胞和受体动物都可能受到药理或其他扰动的干扰。同样, 受体动物也可以接触到感染或炎症刺激, 或其他影响淋巴细胞贩运的治疗12。该协议也可以很容易地应用于转基因鼠标线。特别是, 那些表达荧光蛋白的人将无需标记, 并可以增强复用策略。
重要的是要注意, 不同的细胞数量在注射前混合的时间应尽可能减少。只有在接受动物完全麻醉并准备注射时, 才应将差异标记的细胞群混合。在不同种群中存在的染料可以混合, 导致两者之间的分离不清, 用流式细胞仪进行分析。另外, 不同的治疗条件在这时间可能影响未处理的细胞。例如, 绑定到单元格表面的代理可能会转移到未经处理的单元格, 从而混淆了结果。
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Disclosures
作者没有透露
Acknowledgments
这项工作得到了伯纳德. 施瓦茨计划的支持, 洛克菲勒大学的医生科学家, 洛克菲勒大学的罗伯逊治疗发展基金, 和克生物医学和营养学研究中心在洛克菲勒大学
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875-093 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630-080 | |
| Fetal Bovine Serum | ATCC | 30-2020 | |
| Cell culture flask | Corning | 353136 | |
| Calcein AM | Thermo Fisher Scientific | C1430 | Excitation: 485nm, Emission: 520nm |
| Cell culture dish | Corning | 1007 | |
| 24 well plate | Corning | 353504 | |
| Fluoroblok Fibronectin Insert | Corning | CB354597 | |
| 15 mL conical tube | Corning | 352097 | |
| Bovine Serum Albumin | Cell Signaling Technology | 9998S | |
| Human Recombinant MCP-1 | Peprotech | 300-04 | |
| Adult bovine Serum | Sigma | B9433 | |
| HBSS with calcium and magnesium; no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
| SpectraMax M2e plate reader | Molecular Devices | ||
| Olympus IX71 inverted fluorescence microscope | Olympus | ||
| Isothesia | Henry Schein animal health | 11695-6776-2 | Isofluorane anesthesia |
| Cell strainer 40um nylon | Falcon Corning | 352340 | |
| ACK lysing buffer | Quality Biological | 118-156-101 | |
| CellTracker Orange CMTMR Dye | Thermo Fisher Scientific | C2927 | Excitation: 541nm, Emission: 565nm |
| CellTracker Green CMFDA Dye | Thermo Fisher Scientific | C2925 | Excitation: 485nm, Emission: 520nm |
| 5ml syringe | BD Syringe | 309646 | |
| 1ml TB syringe | BD Syringe | 309625 | |
| THP-1 cell line | ATCC | TIB-202 | |
| Brilliant Violet 421 anti-mouse CD3 Antibody | Biolegend | 100228 | Excitation: 405nm, Emission: 421nm |
| Brilliant Violet 605 anti-mouse CD19 Antibody | Biolegend | 115540 | Excitation: 405nm, Emission: 603nm |
| 96-well round bottom plate | Corning | 353077 | |
| LSRII | BD Biosciences | Flow cytometer |
References
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