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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

बढ़ाता मानव Monocyte Chemotaxis इन विट्रो और Murine लिम्फोसाइट ्े में Vivo

Published: October 30, 2017 doi: 10.3791/56218
Automatic Translation
1, 1, 1
1Laboratory of Biochemical Genetics and Metabolism, The Rockefeller University

Summary

लिम्फोसाइट chemotaxis और माइग्रेशन के मात्रात्मक आकलन के लिए प्रोटोकॉल इम्यूनोलॉजी अनुसंधान के लिए महत्वपूर्ण उपकरण हैं । यहां, एक इन विट्रो प्रोटोकॉल का वर्णन है कि वास्तविक समय, सेल प्रवास के मल्टीप्लेक्स मूल्यांकन, साथ ही vivo तकनीक में एक पूरक तिल्ली के लिए देशी कोशिकाओं की ट्रैकिंग को सक्षम करने के लिए अनुमति देता है ।

Abstract

Chemotaxis एक विशिष्ट रासायनिक ग्रैडिएंट1के साथ माइग्रेशन है । Chemokines chemotactic साइटोकिंस है कि शारीरिक और लौकिक विशिष्टता2के साथ सेलुलर तस्करी को बढ़ावा देने के हैं । Chemotaxis लिम्फोसाइटों और अंय प्रतिरक्षा कोशिकाओं है कि मात्रात्मक इन विट्रो मेंमूल्यांकन किया जा सकता है की एक महत्वपूर्ण कार्य है । इस पांडुलिपि का वर्णन विधियों कि chemotaxis के मूल्यांकन की अनुमति, दोनों विट्रो में और vivo में, सेल लाइनों और देशी कोशिकाओं सहित विविध प्रकार के सेल के लिए । इन विट्रोमें, प्लेट आधारित प्रारूप वास्तविक समय में एक साथ कई शर्तों की तुलना परमिट, और 1-4 एच के भीतर पूरा किया जा सकता है इन विट्रो परख शर्तों में एगोनिस्ट और विरोधी परिचय करने के लिए हेरफेर किया जा सकता है, साथ ही chemokinesis से chemotaxis अंतर है, जो यादृच्छिक आंदोलन है । के लिए vivo में तस्करी आकलन, प्रतिरक्षा कोशिकाओं को कई फ्लोरोसेंट रंगों के साथ लेबल और adoption हस्तांतरण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । कोशिकाओं की अवकलन लेबलिंग एक ही जानवर में पेश किया जा करने के लिए मिश्रित कोशिका आबादी के लिए अनुमति देता है, जिससे विचरण कम और एक पर्याप्त रूप से संचालित प्रयोग के लिए आवश्यक जानवरों की संख्या को कम करने. लसीकावत् ऊतक में प्रवास के रूप में छोटे रूप में 1 ज में होता है, और कई ऊतक डिब्बों का नमूना लिया जा सकता है । फ्लो cytometry निंनलिखित ऊतक फसल के कई प्रकार के सेल के प्रवासी पैटर्न के एक तेजी से और मात्रात्मक विश्लेषण के लिए अनुमति देता है ।

Introduction

मजबूत प्रतिरक्षा कक्ष प्रकार के असंख्य के जटिल लौकिक और स्थानिक समंवय की आवश्यकता है ताकि उचित प्रतिक्रिया के लिए चोट, संक्रमण और आत्म सहनशीलता उत्पंन करते हैं । कई दर्जन chemokine रिसेप्टर्स और उनके इसी लाइगैंडों की खोज की गई है और जो विशिष्ट कोशिकाओं को एक विशिष्ट समय में एक विशिष्ट ऊतक में निर्देशित किया जा सकता है आणविक तंत्र प्रदान विशेषता । इस प्रकार, chemotaxis और प्रवास का अध्ययन इम्यूनोलॉजी अनुसंधान का एक अनिवार्य घटक है । दरअसल, इन विट्रो में वर्णित परख हाल ही में एक स्क्रीनिंग उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया गया था एक chemotactic cofactor कि सी की ओर टी कोशिकाओं की chemotaxis में बढ़ौतरी की पहचान सी सी chemokines 19 और 213। यहां वर्णित तरीकों के प्रयोजन के लिए इन विट्रो में और vivo मेंप्रतिरक्षा कोशिका chemotaxis के मात्रात्मक आकलन की अनुमति है ।

Boyden (सेल प्रवास और आक्रमण) चैंबर परख एक सस्ती, प्रतिलिपि है, और सेल प्रवास का आकलन करने के लिए तेजी से विधि4,5। मानक परख में, ऊपरी कक्ष कोशिकाओं के साथ वरीयता प्राप्त है, और एक निचले कक्ष से एक छिद्रित डालने के द्वारा अलग है, जिसमें कोशिकाओं को स्थानांतरित । वांछित समय पर, कोशिकाओं है कि डालने के नीचे करने के लिए चले गए तय किया जा सकता है और प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा quantitation के लिए दाग । हालांकि, इस तरह के माप आरै डेटा संग्रह के लिए एक अंत बिंदु है, जो गतिशील डेटा संग्रह precludes और विश्लेषण के लिए इष्टतम समय बिंदु निर्धारित करने के लिए व्यापक अनुकूलन की आवश्यकता कर सकते हैं । यहाँ, कई रूपांतरों वर्णन किया गया है कि अनुमति वास्तविक समय, मात्रात्मक और chemotaxis के division माप में इन विट्रो.

के लिए vivo में अध्ययन, एक कार्यात्मक अंत बिंदु उपयोग किया जाता है, अर्थात् एक दिया ऊतक डिब्बे में कोशिकाओं के विशिष्ट संचय । पूर्व लेबल दाता कोशिकाओं को अपनाने के हस्तांतरण के माध्यम से प्राप्तकर्ता पशुओं में पेश कर रहे हैं । इन दाता कोशिकाओं को बाद में प्राप्तकर्ता ऊतक फसल के बाद प्रवाह cytometry द्वारा की पहचान की जा सकती है । भी प्रस्तुत एक सह लेबलिंग रणनीति है कि एक प्राप्तकर्ता जानवर के भीतर विभिंन प्रकार के सेल के तस्करी के निर्धारण के लिए अनुमति देता है । इस विधि सेल इंजेक्शन से अंतर-पशु भिंनता समाप्त, और शारीरिक अंतर पशु परिवर्तनशीलता के लिए खाते ।

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Protocol

< p class = "jove_content" > सभी कार्यविधियों को अनुमोदित किया गया रॉकफेलर University & #39; s संस्थागत पशु परिचर्या और उपयोग समिति. सभी जानवरों को विशिष्ट रोगज़नक़-मुक्त शर्तों के तहत घर में थे ।

< p class = "jove_title" > 1. इन विट्रो Chemotaxis

  1. Culture THP-1 cells < सुप वर्ग = "xref" > 6 in रोसवेल पार्क मेमोरियल इंस्टिट्यूट १६४० (RPMI १६४०) 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 4-(2-hydroxyethyl) के साथ पूरक-1- piperazineethanesulfonic एसिड (HEPES; 25 मिमी) (पूरा मीडिया), 0.5-1.0 x 10 6 कोशिकाओं/एमएल
    2. के बीच घनत्व को बनाए रखने एक ३५ मिमी सेल संस्कृति डिश में
  2. , लेबल ३.५ x 10 5 THP-1 कोशिकाओं के साथ शर्त प्रति calcein acetoxymethyl (calcein-AM; २.५ & #181; M) या अन्य उपयुक्त फ्लोरोसेंट डाई पर पूरा मीडिया में ३७ & #176; C for 30 min.
    नोट: रंजक सेल झिल्ली-पारगंय और लाइव सेल लेबलिंग के साथ संगत होना चाहिए.
  3. प्री-वार्म a प्लेट रीडर ते ३७ & #176; C.
    नोट: तापमान नियंत्रण के अलावा, नीचे पढ़ने की कार्यक्षमता भी आवश्यक है । माइग्रेशन कक्षों के ठहराव के लिए एक प्लेट रीडर के लिए एक विकल्प के लिए चरण 1.10.2 देखें.
  4. जबकि कोशिकाओं लेबल कर रहे हैं, परख थाली और निचले चैंबर तैयार करते हैं ।
    1. एक 24 अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति की थाली का उपयोग करें, प्रति अच्छी तरह से एक शर्त के साथ । तपसिल.
      2. में प्रत्येक शर्त निष्पादित करें
    2. Add ७५० & #181; हांक & #39 के एल; एस बफ़र्ड नमक समाधान (HBSS) 25 मिमी HEPES और ०.१% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) 24-वेल प्लेट के साथ बफर । यह बेसल नियंत्रण शर्त के रूप में कार्य करता है ।
      1. तुलनित्र शर्तों के लिए अन्य कुओं का उपयोग करें, हमेशा कुल मात्रा को बनाए रखने में नीचे चैम्बर में ७५० & #181; L.
        नोट: इस उदाहरण में, मानव monocyte chemoattractant प्रोटीन-1 (एमसीपी-1) chemotaxis < सुप वर्ग = "xref" > 7 के लिए सकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है ।
        1. 25 मिमी HEPES, BSA (०.१%), और एमसीपी-1 (७५ एनजी/एमएल) के साथ HBSS के संयोजन से एजेंट मिश्रण इकट्ठा । अतिरिक्त सकारात्मक नियंत्रण के रूप में एमसीपी-1 के साथ वयस्क गोजातीय सीरम (२.७% v/v) का उपयोग करें ।
          नोट: Chemokine और Chemokine एकाग्रता अध्ययन के तहत chemotactic अक्ष पर निर्भर करेगा । Lyophilized एमसीपी-1 BSA के साथ आसुत जल में reसस्पैंड है (०.१%) ५० के अंतिम एकाग्रता के साथ एक शेयर समाधान बनाने के लिए & #956; g/एमएल । यह 10 & #956; g/एमएल का काम समाधान करने के लिए पानी में पतला किया जा सकता है । इस समाधान के निचले चैम्बर के लिए ५.६ & #956; L जोड़ें.
    3. के बाद नीचे कक्षों की संरचना पूरी हो गई है, एक अच्छी तरह से एक छिद्रित डालें, सुनिश्चित करना है कि डालने के टैब थाली के पायदानों के साथ संरेखित करें ।
      नोट: आवेषण के लिए उपयुक्त ताकना आकार चुनें । monocytes और लिम्फोसाइटों के लिए, 3 & #956 का आकार ताकना; m अच्छा प्रदर्शन करता है । कुछ कक्ष प्रकार और/या chemokine सिस्टमों के लिए इष्टतम माइग्रेशन मैट्रिक्स-लेपित सतह की आवश्यकता हो सकती है । उदाहरण के लिए, मापने के लिए THP-1 monocyte chemotaxis की ओर एमसीपी-1, fibronectin या कोलेजन-लेपित आवेषण की सिफारिश कर रहे हैं । quantitation के लिए प्लेट रीडर के लिए, insert एक प्रकाश-impermeant कोटिंग, जैसे पॉलीथीन terephthalate, ऊपरी चैंबर में गैर-माइग्रेट कोशिकाओं का पता लगाने को रोकने के लिए होना चाहिए < सुप वर्ग = "xref" > ८ .
  5. calcein के साथ 30 मिनट के लिए गर्मी कोशिकाओं के बाद, एक 15mL शंकु ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण सेल निलंबन कर रहा हूं । 2 मिनट के लिए १,००० x g पर कोशिकाओं के केंद्रापसारक । नेत्रहीन calcein की पुष्टि करने के लिए कोशिकाओं का निरीक्षण-AM (< सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्रा १ ).
  6. सावधानी से एक वैक्यूम aspirator का उपयोग कर supernatant निकालें । धो में लेबल कोशिकाओं सीरम मुक्त RPMI १६४० HEPES के साथ पूरक 25 मिमी. 2 मिनट के लिए १,००० x g पर कोशिकाओं के केंद्रापसारक और supernatant.
    7. त्यागें
  7. सीरम मुक्त RPMI १६४० HEPES 25 मिमी के साथ पूरक में कोशिकाओं reसस्पेंड । कोशिकाओं गिनती और वॉल्यूम समायोजित करें कि कोशिकाओं को एक अंतिम एकाग्रता पर है 1.0-1.5 x 10 6 कोशिकाओं/एमएल
  8. औषधालय २५० & #956; insert (ऊपरी कक्ष) में सेल निलंबन के एल.
  9. के बाद सभी ऊपरी कक्षों भर दिया गया है, धीरे से प्लेट उठा, और हवाई बुलबुले कि प्रवास और पता लगाने के साथ हस्तक्षेप कर सकते है की उपस्थिति के लिए नीचे का निरीक्षण । एक बुलबुला हटाने के लिए, पहले तो फिर से डालने की स्थिति को हटाने का प्रयास करें । यदि असफल हो, बुलबुला पंचर और फिर डालने के लिए फिर से स्थिति के लिए एक 27 जी सुई का उपयोग करें ।
  10. में थाली को जगह पूर्व गर्म ३७ & #176; ग प्लेट रीडर.
    1. 1-3 मिनट के अंतराल पर नीचे से प्रतिदीप्ति रीडिंग प्राप्त करते हैं । calcein-AM का उपयोग करते समय, क्रमशः ४८५ एनएम और ५२० एनएम पर प्रतिदीप्ति उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य सेट करें । कक्ष प्रकार और chemokine सिस्टम के आधार पर, chemotaxis सामांयतया 1-4 h पर होती है (< सशक्त वर्ग = "xfig" > आरेख 2a ).
      2. निरंतर माप के लिए एक विकल्प के रूप में
    2. एक थाली पाठक, छवि एक औंधा फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा बी ) उत्तेजना और प्रकाश का पता लगाने में सक्षम ४८५ एनएम और ५२० एनएम, क्रमशः । insert के नीचे के बहुमत को कैप्चर करने के लिए कम आवर्धन का उपयोग करें । ImageJ या इसी तरह के सॉफ्टवेयर के साथ छवियों को संसाधित करके कोशिकाओं को बढ़ाता है < सुप क्लास = "xref" > ९ .
< p class = "jove_title" > 2. Murine के दत्तक अंतरण लिम्फोसाइटों

  1. दाता कोशिकाओं की तैयारी
    1. Anesthetize 8-12 सप्ताह-पुराने C57BL/6J संज्ञाहरण (1-3%) एक isoflurane का उपयोग कर के साथ पुरुष दाता चूहों । पैर की अंगुली से संज्ञाहरण के उचित गहराई की पुष्टि करें-चुटकी.
    2. माउस को लापरवाह स्थिति में रखें । एक स्केलपेल के साथ एक midline चीरा बनाओ और ऊपरी बाएँ पेरिटोनियल अंतरिक्ष में तिल्ली का पता लगाने । पूरी तिल्ली और पूरे मीडिया में जगह एक्साइज (RPMI 10% FBS और 25 मिमी HEPES के साथ पूरक; बर्फ पर 1 मिलीलीटर/ decapitation.
      3. द्वारा Euthanize anesthetized दाता पशु
    3. तिल्ली के ऊतकों को धीरे से पीसने के माध्यम से ४० & #181; एम पूर्ण मीडिया में नायलॉन जाल (1 मिलीलीटर/spleen) एक सिरिंज सवार के अंत का उपयोग कर एक एकल सेल निलंबन और एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण करने के लिए.
    4. अमोनियम क्लोराइड पोटेशियम (ले) lysis बफर और लाइसे एरिथ्रोसाइट्स.
      5. करने के लिए कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए मशीन के 4 मात्रा में जोड़ें
    5. कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए १,००० x g पर कोशिकाओं केंद्रापसारक और supernatant त्यागें । यदि एरिथ्रोसाइट्स गोली में रहना, ले lysis बफर में reसस्पेंड, कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए मशीन, 2 मिनट के लिए १,००० x g पर कोशिकाओं केंद्रापसारक और supernatant.
      6. त्याग
    6. 2 की एकाग्रता पर पूरा मीडिया में कोशिकाओं reसस्पैंड-5x10 7 कोशिकाओं/एमएल, फिर तनाव सेल निलंबन के माध्यम से एक ४० & #181; मीटर नायलॉन जाल सेल मलबे को हटाने के लिए ।
    7. लेबल 1 x 10 7 कोशिकाओं/एक फ्लोरोसेंट डाई लाइव कोशिकाओं के साथ संगत के साथ और है कि बाद में निर्धारण पर बनाए रखा जाएगा, जैसे 5-chloromethylfluorescein diacetate (अंतिम एकाग्रता 2 & #956; M) < सुप class = "xref" > 10 . ३७ पर मशीन & #176; ग के लिए 30 min.
      नोट: एक से अधिक सेल जनसंख्या ट्रैक करने के लिए, अतिरिक्त सेल आबादी के साथ अन्य फ्लोरोसेंट रंगों का उपयोग करें. उदाहरण के लिए, दाता कोशिकाओं के एक हिस्से को 5-(और-6) के साथ लेबल किया जा सकता है-(((4-chloromethyl) benzoyl) अमीनो) tetramethylrhodamine (अंतिम एकाग्रता 2 & #956; M) < सुप वर्ग = "xref" > 11 .
    8. के साथ पूरक HBSS 4 संस्करणों जोड़ें 25 मिमी HEPES, तो 2 मिनट के लिए १,००० x g पर केंद्रापसारक और supernatant त्यागें । 1 एक्स 10 8 कोशिकाओं/एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए HEPES 25 मिमी के साथ पूरक HBSS में गोली reसस्पेंड ।
      1. अगर एक से अधिक फ्लोरोसेंट डाई का उपयोग कर, सेल आबादी रखने के तुरंत इंजेक्शन से पहले जब तक अलग ।
      2. एक छोटा aliquot (10 & #956; L) प्रत्येक रंग की कोशिकाओं के एक निर्धारण समाधान (1 एमएल) के लिए अनुवर्ती प्रवाह cytometry क्षतिपूर्ति के लिए स्थानांतरण.
  2. Transfer of लिम्फोसाइटों
    1. Anesthetize 8-12 वीक-ओल्ड C57BL/6J पुरुष प्राप्तकर्ता चूहों isoflurane के साथ (1-3%) एक vaporizer का उपयोग कर; पैर की अंगुली से संज्ञाहरण की गहराई की पुष्टि करें-चुटकी । पशुओं के लिए पशु चिकित्सा मरहम लागू करें & #39; एस आंखें सुखाने को रोकने के लिए ।
    2. संक्षेप भंवर दाता कोशिकाओं (1 एस) और 27 जी, सुई में ०.५ के साथ 1 मिलीलीटर इंजेक्शन सिरिंज को हस्तांतरण, विभेदक लेबल सेल आबादी, यदि लागू हो तो संयोजन ।
      1. एक छोटा सा aliquot (10 & #956; L) एक निर्धारण समाधान (1 एमएल) के लिए मिश्रित कोशिकाओं के बाद के प्रवाह cytometry विश्लेषण के लिए स्थानांतरण ।
    3. जगह दाता पशुओं को प्रवण स्थिति में । आंखों के लिए पृष्ठीय त्वचा के लिए हल्के caudal दबाव लागू करें, गोलक के कारण थोड़ा बहर ।
    4. सुई औसत दर्जे का प्रत्यक्ष और सुई १०० & #181; दाता सेल निलंबन के एल रेट्रो-कक्षा में प्रत्येक प्राप्तकर्ता माउस में । कोशिकाओं को भी पूंछ नस के माध्यम से इंजेक्शन किया जा सकता है ।
    5. धीरे से इंजेक्शन सुई और जगह माउस एक वसूली पिंजरे में अकेले वापस ले लो । पशु मॉनिटर जब तक यह चेतना फिर से आ गया है; एक बार पूरी तरह से सामाजिक आवास के लिए पशु वापस बरामद ।
  3. संग्रह और विश्लेषण
    1. के बाद 1 ज, anesthetize संज्ञाहरण (1-3%) एक isoflurane का उपयोग कर के साथ प्राप्तकर्ता चूहों, पैर की अंगुली चुटकी द्वारा संज्ञाहरण की गहराई की पुष्टि करें । फसल तिल्ली (या ब्याज की अन्य ऊतक) (कदम 2.1.2.) प्रत्येक प्राप्तकर्ता माउस से और पूरा मीडिया में जगह (1 मिलीलीटर/ Euthanize anesthetized पशुओं ने decapitation.
      नोट: ऊतक फसल से पहले लंबे अंतराल से कम 24 घंटे के माध्यम से ऊतक संचय में वृद्धि होगी
    2. तिल्ली ऊतक पीसने के माध्यम से धीरे ४० & #181; एम पूर्ण मीडिया में नायलॉन जाल एक सिरिंज सवार के अंत का उपयोग कर एक एकल सेल निलंबन और 15 एमएल शंकु ट्यूब के लिए स्थानांतरण करने के लिए.
    3. ले lysis बफर और कमरे के तापमान पर 5 मिनट की मशीन के 4 संस्करणों जोड़ें । कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए १,००० x g पर सेल निलंबन केंद्रापसारक और supernatant.
      4. त्यागें
    4. धुंधला बफर में कोशिकाओं reसस्पेंड (फास्फेट-बफर खारा 1% FBS के साथ पूरक) । कोशिकाओं गिनती और 3 x 10 7 कोशिकाओं की एक अंतिम एकाग्रता के लिए समायोजित/ स्थानान्तरण १०० & #181; एक ९६-अच्छी तरह से गोल नीचे प्लेट के लिए सेल निलंबन के एल.
    5. वांछित मार्करों के लिए दाग कोशिकाओं (सामग्री की मेज देखें) के प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण के लिए । fluorophore जोड़ें-संयुग्मित एंटीबॉडी (सामग्री की तालिका देखें) पर वांछित मार्करों और गर्मी के खिलाफ 4 & #176, अंधेरे में 20 मिनट के लिए सी. Add १०० & #181; L धुंधला बफर, 3 मिनट के लिए १,००० x g पर कोशिकाओं केंद्रापसारक और supernatant.
      6. त्यागें
    6. २०० में गोली reसस्पैंड & #181; एल धुंधला बफर, 3 मिनट के लिए १,००० x g पर कोशिकाओं केंद्रापसारक और supernatant.
      7. त्यागें
    7. १२५ में गोली reसस्पैंड & #181; एल धुंधला बफर और अधिग्रहण नमूने मानक प्रक्रियाओं का उपयोग कर cytometer प्रवाह का उपयोग कर ।
      नोट: ग्रीन डाई एक ४८८ एनएम लेजर से उत्साहित है और उत्सर्जन ५०५ और 530/30 dichroic फिल्टर के साथ पता चला है । ऑरेंज डाई एक ५६१ एनएम से उत्साहित है और उत्सर्जन एक 582/15 dichroic फिल्टर द्वारा पता चला है ।
      1. एक फ्लोरोसेंट डाई के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए 2.1.8.2 से बचाया कोशिकाओं का उपयोग करें.
        नोट: उत्तेजना और लेबलिंग रंजक के उत्सर्जन स्पेक्ट्रा मिलान fluorophores के साथ मनका आधारित क्षतिपूर्ति का उपयोग कर इष्टतम मुआवजा में परिणाम होगा.
      2. चरण 2.2.2.1 से सहेजे गए इनपुट कक्षों का उपयोग करें यदि एक से अधिक लेबल की गई जनसंख्या का उपयोग करके विभेदक लेबल किए गए इनपुट कक्षों का अनुपात सही रूप से निर्धारित करने के लिए (< सशक्त वर्ग = "xfig" > आरेख 3 ). लेबल किए गए कक्षों में लेबल के अनुपात पर आधारित ऊतक विशिष्ट माइग्रेशन परिकलित करें (< सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा ४ ).

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Representative Results

calcein डाई का उपयोग करते समय, कोशिकाओं के दृश्य निरीक्षण लेबल के ऊपर की पुष्टि करेगा (चित्रा 1). स्वचालित फ्लोरोसेंट रीडिंग समय के साथ डालने के नीचे पर कोशिकाओं पारगमन के रूप में प्रवास को ट्रैक करेगा । ये डेटा स्पष्ट रूप से एमसीपी-1 की दिशा में सेल माइग्रेशन की एक प्रेरण, साथ ही सीरम (चित्र 2a) द्वारा इस प्रतिक्रिया का एक वृद्धि दिखा. प्रवासी उत्तेजना की ताकत पर निर्भर करता है, वहां कम से कम 15 मिनट के एक अंतराल के संकेत में वृद्धि करने से पहले है । फ्लोरोसेंट संकेत पीक हो सकता है और फिर धीरे-धीरे गिरावट । यह कक्ष के ऊपरी कक्ष से माइग्रेट करने वाले कक्षों की तुलना में तेज़ गति से निचले कक्ष में समाधान में पास करने के रूप में संमिलित करें के नीचे का पालन करने वाले कक्षों की संख्या में एक शुद्ध कमी का प्रतिनिधित्व करता है । मजबूत प्रवासी उत्तेजनाओं आम तौर पर एक में परिणाम) प्रतिदीप्ति मूल्यों में वृद्धि की पूर्व शुरुआत; ख) प्रतिदीप्ति में वृद्धि की तीव्र दर; और ग) उच् च पीक प्रतिदीप्ति मान । औंधा प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा अधिग्रहीत प्रतिनिधि छवियों को भी दिखाया जाता है (चित्रा 2 बी), सेल काउंट्स (चित्रा 2c) के quantitation के साथ.

के लिए vivo अध्ययनों में एक से अधिक फ्लोरोसेंट लेबल का उपयोग, यह महत्वपूर्ण है के लिए इनपुट सामग्री में सेल आबादी के सापेक्ष अनुपात quantitate । इंजेक्शन (चित्रा 3) के लिए सेल आबादी मिश्रण में विचरण के लिए यह खातों. इस मामले में, हरे और नारंगी-फ्लोरोसेंट कोशिकाओं का अनुपात 0.97:1 था । इस प्रकार, इस मामूली असंतुलन के लिए खाते में, हरे-फ्लोरोसेंट कोशिका गिनती ०.९७ द्वारा विभाजित करने के लिए इनपुट सामग्री के अनुपात में उनकी संख्या सूचकांक थे । प्रवाह cytometry द्वारा लेबल कोशिकाओं को बढ़ाता है के बाद, तस्करी बरामद कोशिकाओं की कुल संख्या से विभाजित बरामद लेबल कोशिकाओं की संख्या के रूप में मात्रा जा सकता है ।

ये परिणाम दोहरे रंग रणनीति है, जो अलग इंजेक्शन प्रभावकारिता के प्रभाव को समाप्त का उपयोग करने का लाभ प्रदर्शित; जबकि वहां पशुओं के बीच बरामद कोशिकाओं के काफी विचरण है, किसी भी जानवर के लिए ग्रीन-फ्लोरोसेंट के लिए नारंगी-फ्लोरोसेंट कोशिकाओं के अनुपात लगभग बराबर है (चित्रा 4) । इन परिणामों की उंमीद कर रहे हैं, के रूप में दो सेल आबादी हूबहू इलाज किया गया, लेकिन विभिंन perturbations लिम्फोसाइट डाक पर उनके प्रभाव के लिए परीक्षण किया जा सकता है । पहचान की रेखा से विचलन विशिष्ट कोशिका आबादी के विभिन्न प्रवासी क्षमताओं का संकेत होता. इसके अतिरिक्त, एकाधिक सेल सबसेट वांछित प्रोटीन के लिए बरामद कोशिकाओं दाग द्वारा निर्धारित किया जा सकता है । यहां, टी कोशिकाओं, CD3 धुंधला द्वारा संकेत दिया है, और बी कोशिकाओं, CD19 धुंधला द्वारा संकेत भी हरी के बराबर अनुपात के साथ-नारंगी-फ्लोरोसेंट कोशिकाओं को बरामद कर रहे हैं ।

Figure 1
चित्र 1: कक्ष लेबलिंग. लेबलिंग के बाद सेल गोली के दृश्य निरीक्षण फ्लोरोसेंट डाई के पर्याप्त अग्रिम की पुष्टि (बाएं), इसके विपरीत में लेबल करने से पहले (सही) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2: ठहराव के इन विट्रो माइग्रेशन । (एक) प्रतिनिधि डेटा (± मानक त्रुटि मतलब है) 3 शर्तों की तुलना में एक प्लेट रीडर से वास्तविक समय में अधिग्रहीत: मीडिया (नियंत्रण), chemokine (एमसीपी-1, ७५ एनजी/एमएल) या सीरम के साथ chemokine (एमसीपी-1, ७५ एनजी/एमएल और गोजातीय सीरम, २.७% v/ रीडिंग ४८५ एनएम और ५२० एनएम का पता लगाने के तरंग दैर्ध्य की एक उत्तेजना तरंग दैर्ध्य के साथ थाली हर 3 मिनट के नीचे से प्राप्त कर रहे थे । (B) 1 h पर संमिलित करने के नीचे के 4x आवर्धन पर प्रतिनिधि माइक्रोग्राफ, जो माइग्रेट कक्षों के प्रत्यक्ष विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देता है । स्केल बार्स = ५०० µm (पीला) । (C) ImageJ सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके कम चालित फ़ील्ड (LPF; 4x) प्रति कक्ष संख्या का ठहराव । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3: सना हुआ इनपुट कक्ष. प्रवाह cytometry भूखंड चरण 2.2.2.1 से इंजेक्शन सेल इनपुट में दो अंतर से सना हुआ कोशिका आबादी का अनुपात दिखा । इस भूखंड से निर्धारित अनुपात दो आबादी के प्रारंभिक मिश्रण के दौरान शुरू विचरण के लिए सही करने के लिए कार्य करता है और बहाव डेटा विश्लेषण के दौरान सेल गिना समायोजित करने के लिए प्रयोग किया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: लेबल कोशिकाओं का अनुपात प्राप्तकर्ता जानवरों की तिल्ली से बरामद. ग्रीन फ्लोरोसेंट या नारंगी-फ्लोरोसेंट कोशिकाओं के अनुपात कुल बरामद splenocytes के एक प्रतिशत के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं, प्रत्येक डेटा एक प्राप्तकर्ता जानवर का प्रतिनिधित्व बिंदु के साथ । कुल लेबल किए गए कक्ष (त्रिभुज) दिखाए जाते हैं, साथ ही साथ उपसमुच्चय भी जो कोशिका सतह मार्करों CD19 (वर्ग) या CD3 (सर्कल) के लिए सकारात्मक दाग । डैश्ड रेखा पहचान की वह पंक्ति होती है जहां रंगों के बीच का अनुपात 1 के बराबर होता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

प्रतिरक्षा सेल प्रवास के ठहराव सरल और तेजी से दोनों विट्रो में और vivo मेंपरख का उपयोग कर पूरा किया जा सकता है । हम प्रदर्शन एक एमसीपी-1 ढाल और सीरम द्वारा वृद्धि के जवाब में मानव monocytes के इन विट्रो chemotaxis में । vivo में, दाता murine splenocytes अंतर लेबल और adoption हस्तांतरण के बाद, प्राप्तकर्ता पशुओं से बरामद किए गए थे ।

एक प्लेट रीडर का उपयोग कई समय अंक नमूने का लाभ है (के रूप में अक्सर के रूप में हर 30 एस) और कोशिकाओं को पलायन के quantitation स्वचालित । इस obviates मूल्यांकन के लिए एक एकल समय बिंदु का चयन और अधिक श्रम-व्यक्तिगत कुओं की मैनुअल गिनती के गहन तरीकों से परहेज करने की जरूरत है । इसके अलावा, इस विधि से अधिक गतिशील जानकारी प्रदान करता है माइक्रोस्कोपी द्वारा इकट्ठा किया जा सकता है । विश्लेषण के दौरान यह ध्यान में रखा जाना चाहिए कि कोशिकाओं को नीचे चैंबर में डालने से गिर जाएगी, और प्रतिदीप्ति तीव्रता के लिए योगदान नहीं होगा । इस प्रकार, सम्मिलित करें के नीचे पर कक्षों की संख्या, सापेक्ष प्रतिदीप्ति द्वारा दर्शाई गई, माइग्रेशन की दर का एक फ़ंक्शन होगा और वह दर जिसके द्वारा कक्ष सम्मिलित करना बंद कर देगा.

बड़ी कोशिकाओं को बड़ा pores के साथ एक डालने की आवश्यकता हो सकती है, और 8 माइक्रोन छिद्र आवेषण उपलब्ध हैं । छोटे कोशिकाओं (देशी लिम्फोसाइटों सहित) पर्याप्त उज्ज्वल नहीं हो सकता है मज़बूती से एक fluorimeter द्वारा पता लगाया है और माइक्रोस्कोपी द्वारा मूल्यांकन की आवश्यकता हो सकती है, विशेष रूप से chemotaxis में छोटे परिवर्तन के लिए. कुछ सेल प्रकार के निचले चैंबर समाधान में तेजी से पारित कर सकते है और एक लंबे समय पर्याप्त निवास का पता लगाने के लिए नहीं है, एक समतल वक्र में जिसके परिणामस्वरूप । इस मामले में, कोशिकाओं cytometry द्वारा सीधे निचले चैंबर समाधान से मात्रा जा सकता है, या एक मैट्रिक्स लेपित डालने के लिए छोटे pores (1 माइक्रोन) के साथ एक डालने का उपयोग करने के अलावा में पारगमन समय लंबा इस्तेमाल किया जा सकता है ।

इन परख के लिए महत्वपूर्ण मजबूत प्रवासी शर्तों की पहचान है । के लिए इन विट्रो अध्ययन, कक्ष प्रकार का अध्ययन एक chemoattractant का जवाब देने में सक्षम होना चाहिए, और आवश्यक सह कारकों पर विचार किया जाना चाहिए । अनुकूलन कक्ष ऊपरी चैंबर में शुरू घनत्व के लिए आवश्यक हो सकता है । सामांय में, एक उच्च घनत्व एक मजबूत संकेत में परिणाम होगा, लेकिन यह एक उच्च गैर विशिष्ट प्रवास के संकेत के खिलाफ संतुलित किया जाना चाहिए । chemoattractant सांद्रता की एक सीमा का परीक्षण भी प्रवास पर कब्जा करने के लिए एक उपयुक्त लौकिक खिड़की की पहचान में मदद कर सकते हैं ।

यह विधि भी एकाधिक रंगों का उपयोग करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । यह गर्भ में परिवर्तनशीलता को कम करेगा, साथ ही शर्तों की संख्या में वृद्धि है कि एक भी परख में शामिल किया जा सकता है । प्राथमिक विचार यहां फ्लोरोसेंट रंगों की चमक है । Calcein-AM बहुत उज्ज्वल है और इसलिए आसानी से दोनों माइक्रोस्कोप और प्लेट रीडर अनुप्रयोगों द्वारा पता चला. जबकि vivo अध्ययन में के लिए इस्तेमाल रंजक आसानी से माइक्रोस्कोपी और उत्पादित उच्च पृष्ठभूमि से पता नहीं किया गया; शायद यह भी सही प्लेट रीडर का पता लगाने बाधा होगा ।

वीवो स्टडीज में , दाता कोशिकाओं के स्वास्थ्य के लिए अपने प्रवासी समारोह के संरक्षण के लिए महत्वपूर्ण है । दाता कोशिकाओं की फसल गैर अस्तित्व सर्जरी के भाग के रूप में किया जाना चाहिए, बल्कि दाता पशु त्याग और फिर कटाई कोशिकाओं है, जो ischemia और कोशिका मृत्यु की संभावना बढ़ जाती है । इंजेक्शन और फसल के बीच का समय प्रयोगों के लिए एक महत्वपूर्ण विचार है जिसमें विभिन्न कोशिका आबादी का उपयोग किया जाता है; सेल की आबादी के बीच विचलन या समानता का स्तर समय के साथ बदल सकता है । प्रसंस्करण समय दाता से फसल के बाद प्राप्तकर्ता में इंजेक्शन जब तक कम किया जाना चाहिए । इसके अलावा, दाता/ मानव कोशिकाओं को तेजी से चूहों द्वारा खारिज कर दिया जाएगा, हालांकि इंट्रा प्रजातियों allogeneic कोशिकाओं को कम समय में अच्छी तरह से सहन कर रहे हैं । उदाहरण के लिए, हम C57BL/6J या बालब/मुख्य ंयायाधीश के साथ कोशिकाओं को पलायन में कोई अंतर नहीं मिल 1 ज की अवधि में C57BL/6J प्राप्तकर्ताओं के साथ प्रयोग किया जाता है ।

यह vivo में विधि प्रवासी क्षमता में अंतर का आकलन करने के लिए उपयोगी है । दोनों इनपुट कोशिकाओं और प्राप्तकर्ता जानवरों औषधीय या अंय perturbations के अधीन किया जा सकता है । इसी तरह, प्राप्तकर्ता जानवरों संक्रामक या भड़काऊ उत्तेजनाओं, या अन्य उपचार है कि लिम्फोसाइट ्े12को प्रभावित करने के लिए उजागर किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल को भी आसानी से ट्रांसजेनिक माउस लाइनों को लागू किया जा सकता है । विशेष रूप से, उन फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त निराकरण लेबलिंग के लिए की जरूरत है और शक्ति मल्टीप्लेक्स रणनीतियों सकता है ।

यह नोट करने के लिए महत्वपूर्ण है कि जिस समय में अलग कोशिका आबादी इंजेक्शन से पहले मिश्रित कर रहे हैं के रूप में ज्यादा संभव के रूप में कम किया जाना चाहिए. विभेदक लेबल कोशिका आबादी के बाद ही मिलाया जाना चाहिए प्राप्तकर्ता पशुओं पूरी तरह से anesthetized गया है और इंजेक्शन के लिए तैयार हैं । विभिंन आबादी में मौजूद रंजक मिश्रण, जब प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण दोनों के बीच अस्पष्ट जुदाई में जिसके परिणामस्वरूप कर सकते हैं । इसके अलावा, विभिन्न उपचार स्थितियों इस समय के दौरान अनुपचारित कोशिकाओं को प्रभावित कर सकते हैं । उदाहरण के लिए, कक्ष की सतह से बाइंड करने वाले एजेंट्स को अनुपचारित कक्षों में स्थानांतरित किया जा सकता है, जिससे परिणाम प्राप्त होते हैं ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है

Acknowledgments

इस काम के रॉकफेलर विश्वविद्यालय में चिकित्सक वैज्ञानिकों के लिए बर्नार्ड एल Schwartz कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया था, रॉकफेलर विश्वविद्यालय में Robertson चिकित्सीय विकास निधि, और Sackler में एक चिकित्सा और पोषण अनुसंधान के लिए केंद्र रॉकफेलर विश्वविद्यालय ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI-1640 Thermo Fisher Scientific 11875-093
HEPES Thermo Fisher Scientific 15630-080
Fetal Bovine Serum ATCC 30-2020
Cell culture flask Corning 353136
Calcein AM Thermo Fisher Scientific C1430 Excitation: 485nm, Emission: 520nm
Cell culture dish Corning 1007
24 well plate Corning 353504
Fluoroblok Fibronectin Insert Corning CB354597
15 mL conical tube Corning 352097
Bovine Serum Albumin Cell Signaling Technology 9998S
Human Recombinant MCP-1 Peprotech 300-04
Adult bovine Serum Sigma B9433
HBSS with calcium and magnesium; no phenol red Thermo Fisher Scientific 14025-092
SpectraMax M2e plate reader Molecular Devices
Olympus IX71 inverted fluorescence microscope Olympus
Isothesia Henry Schein animal health 11695-6776-2 Isofluorane anesthesia
Cell strainer 40um nylon Falcon Corning 352340
ACK lysing buffer Quality Biological 118-156-101
CellTracker Orange CMTMR Dye Thermo Fisher Scientific C2927 Excitation: 541nm, Emission: 565nm
CellTracker Green CMFDA Dye Thermo Fisher Scientific C2925 Excitation: 485nm, Emission: 520nm
5ml syringe BD Syringe 309646
1ml TB syringe BD Syringe 309625
THP-1 cell line ATCC TIB-202
Brilliant Violet 421 anti-mouse CD3 Antibody Biolegend 100228 Excitation: 405nm, Emission: 421nm
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD19 Antibody Biolegend 115540 Excitation: 405nm, Emission: 603nm
96-well round bottom plate Corning 353077
LSRII BD Biosciences Flow cytometer

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References

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इम्यूनोलॉजी अंक १२८ लिम्फोसाइट monocyte chemotaxis सेल प्रवास तथा आक्रमण कक्ष प्रवाह cytometry दत्तक हस्तान्तरण प्रवास परख
बढ़ाता मानव Monocyte Chemotaxis इन <em>विट्रो</em> और Murine लिम्फोसाइट ्े <em>में Vivo</em>
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Prangley, E., Kumar, T., Ponda, M.… More

Prangley, E., Kumar, T., Ponda, M. P. Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo. J. Vis. Exp. (128), e56218, doi:10.3791/56218 (2017).

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