Summary

Kvantifisere menneskelige Monocyte Chemotaxis In Vitro og Murine lymfocytt menneskehandel Vivo

Published: October 30, 2017
doi:

Summary

Protokoller for kvantitativ vurdering av lymfocytt chemotaxis og migrasjon er viktige verktøy for immunologi forskning. Her, er en i vitro protokoll beskrevet at tillatelser sanntid, multiplekset evaluering av celle migrasjon og en utfyllende i vivo teknikk aktivere sporing av innfødte celler milten.

Abstract

Chemotaxis er overføring langs en bestemt kjemiske gradient1. Chemokines er chemotactic cytokiner som fremmer mobilnettet handel med anatomiske og tidsmessige spesifisitet2. Chemotaxis er en viktig funksjon av lymfocytter og andre immunceller som kan kvantitativt vurdert i vitro. Dette manuskriptet beskriver metoder som tillater evaluering av chemotaxis, både i vitro og i vivo, for ulike celletyper inkludert linjer og innfødt celler. Den i vitroplate-basert format tillater sammenligning av flere vilkår samtidig i sanntid, og kan fullføres innen 1-4 h. In vitro analysen forhold kan manipuleres til å introdusere agonister og antagonister, som samt skille chemotaxis fra chemokinesis, som er tilfeldig bevegelse. For i vivo menneskehandel vurderinger, kan immunceller være merket med flere fluorescerende fargestoffer og brukes for adopsjon overføring. Differensial merkingen av celler gir mikset-celle populasjoner introduseres inn i samme dyret, og dermed redusere variansen og redusere antall dyr kreves for et tilstrekkelig drevet eksperiment. Overføringen i lymfoidvev oppstår i så lite som 1 h og flere vev rom kan prøves. Flowcytometri etter vev harvest tillater en rask og kvantitativ analyse av den vandrende mønstre flere celletyper.

Introduction

Robust immunitet krever kompleks timelige og romlig samordning av en rekke celletyper for å besvare skade, infeksjon og generere self-tolerance. Flere dusin chemokine reseptorer og deres tilsvarende ligander har blitt oppdaget og preget gir molekylære mekanismer av hvilke bestemte celler kan rettes i en bestemt vev på et bestemt tidspunkt. Dermed er studere chemotaxis og overføring en uunnværlig del av immunologi forskning. Faktisk, beskrevet i vitro analysen ble sist brukt som en screening verktøyet for å identifisere chemotactic kofaktor som akselererer chemotaxis av T-celler mot C-C chemokines 19 og 213. Formålet med metodene som er beskrevet her er å tillate kvantitative vurderinger av immun celle chemotaxis i vitro og i vivo.

Boyden (celle migrasjon og invasjonen) kammer analysen er en billig, reproduserbare og rask metode for å vurdere celle migrasjon4,5. I standard analysen, den øvre kammeret er plantet med celler og er atskilt med en porøs sett fra en lavere kammer, der cellene overføre. Da ønskede, kan celler som har migrert til undersiden av sette fast og farget for kvantifisering av * lys. Men slike målinger begrense datainnsamling til en enkelt sluttpunktet, som utelukker dynamisk datainnsamling og kan kreve omfattende optimalisering å bestemme optimale tidspunktet for analyse. Her beskrives flere tilpasninger som tillater sanntid, kvantitative og multiplex målinger av chemotaxis i vitro.

I vivo studier, brukes en funksjonell sluttpunkt, nemlig bestemt akkumulering av celler i en gitt vev kupé. Forhåndsinnstilte merket donor cellene er introdusert i mottakerens dyr gjennom adopsjon overføring. Disse donor cellene kan senere identifiseres av flowcytometri etter mottaker vev innhøsting. Også presentert er en co merking strategi som tillater fastsetting av handel med ulike celletyper i en enkelt mottaker dyr. Denne metoden eliminerer Inter dyr variasjon fra celle injeksjon, og står for fysiologiske Inter dyr variasjon.

Protocol

alle prosedyrer ble godkjent av Rockefeller University ' s institusjonelle Animal Care og bruk komiteen. Alle dyrene ble plassert ved bestemte patogen uten betingelser. 1. I Vitro Chemotaxis kultur THP-1 celler 6 i Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) med 10% fosterets bovin serum (FBS) og 4-(2-hydroxyethyl) -1- piperazineethanesulfonic syre (HEPES, 25 mM) (komplett media), opprettholde tetthet mellom 0,5-1.0 x 10 6 celle…

Representative Results

Når du bruker calcein-AM fargestoff, vil visuell inspeksjon av celler bekrefte merket uptake (figur 1). Automatisert fluorescerende målinger vil spore overføring som cellene transitt på undersiden av sette over tid. Disse dataene viser tydelig en induksjon av celle migrasjon mot MCP-1 og en styrking av dette svaret av serum (figur 2A). Avhengig av styrken vandrende stimulans, er det en forsinkelse på minst 15 minutter før e…

Discussion

Kvantifisering av immun celle migrasjon kan oppnås ved hjelp av enkle og raske søk både i vitro og i vivo. Vi viser i vitro chemotaxis av menneskelig monocytter svar til et MCP-1 gradering og styrking av serum. I vivo, donor murine splenocytes var ulikt merket og etter adoptivforeldre overføring, gjenvunnet fra mottakeren dyr.

Bruke en plate leser har fordelen av prøvetaking flere tidspunkt (så ofte som hvert 30 s) og automatisere kvantifisering overf?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbeidet ble støttet av Bernard L. Schwartz programmet for lege forskere ved The Rockefeller University, Robertson terapeutiske utvikling fondet ved Rockefeller University, og Sackler Center for biomedisin og ernæring forskning på den Rockefeller University.

Materials

RPMI-1640 Thermo Fisher Scientific 11875-093
HEPES Thermo Fisher Scientific 15630-080
Fetal Bovine Serum ATCC 30-2020
Cell culture flask Corning 353136
Calcein AM Thermo Fisher Scientific C1430 Excitation: 485nm, Emission: 520nm
Cell culture dish Corning 1007
24 well plate Corning 353504
Fluoroblok Fibronectin Insert Corning CB354597
15 mL conical tube Corning 352097
Bovine Serum Albumin Cell Signaling Technology 9998S
Human Recombinant MCP-1 Peprotech 300-04
Adult bovine Serum Sigma B9433
HBSS with calcium and magnesium; no phenol red Thermo Fisher Scientific 14025-092
SpectraMax M2e plate reader Molecular Devices
Olympus IX71 inverted fluorescence microscope Olympus
Isothesia Henry Schein animal health 11695-6776-2 Isofluorane anesthesia
Cell strainer 40um nylon Falcon Corning 352340
ACK lysing buffer Quality Biological 118-156-101
CellTracker Orange CMTMR Dye Thermo Fisher Scientific C2927 Excitation: 541nm, Emission: 565nm
CellTracker Green CMFDA Dye Thermo Fisher Scientific C2925 Excitation: 485nm, Emission: 520nm
5ml syringe BD Syringe 309646
1ml TB syringe BD Syringe 309625
THP-1 cell line ATCC TIB-202
Brilliant Violet 421 anti-mouse CD3 Antibody Biolegend 100228 Excitation: 405nm, Emission: 421nm
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD19 Antibody Biolegend 115540 Excitation: 405nm, Emission: 603nm
96-well round bottom plate Corning 353077
LSRII BD Biosciences Flow cytometer

References

  1. Griffith, J. W., Sokol, C. L., Luster, A. D. Chemokines and chemokine receptors: positioning cells for host defense and immunity. Annu Rev Immunol. 32, 659-702 (2014).
  2. Springer, T. A. Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm. Cell. 76 (2), 301-314 (1994).
  3. Ponda, M. P., Breslow, J. L. Serum stimulation of CCR7 chemotaxis due to coagulation factor XIIa-dependent production of high-molecular-weight kininogen domain 5. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (45), E7059-E7068 (2016).
  4. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J Exp Med. 115, 453-466 (1962).
  5. Chen, H. C. Boyden chamber assay. Methods Mol Biol. 294, 15-22 (2005).
  6. Tsuchiya, S., Yamabe, M., Yamaguchi, Y., Kobayashi, Y., Konno, T., Tada, K. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). Int J Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).
  7. Leonard, E. J., Yoshimura, T. Human monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1). Immunol Today. 11 (3), 97-101 (1990).
  8. Crouch, M. F. An automated fluorescence based assay of neurite formation. J Neurosci Methods. 104 (1), 87-91 (2000).
  9. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  10. Poot, M., Kavanagh, T. J., Kang, H. C., Haugland, R. P., Rabinovitch, P. S. Flow cytometric analysis of cell cycle-dependent changes in cell thiol level by combining a new laser dye with Hoechst 33342. Cytometry. 12 (2), 184-187 (1991).
  11. West, C. A., He, C., Su, M., Swanson, S. J., Mentzer, S. J. Aldehyde fixation of thiol-reactive fluorescent cytoplasmic probes for tracking cell migration. J Histochem Cytochem. 49 (4), 511-518 (2001).
  12. Kim, C. H. The greater chemotactic network for lymphocyte trafficking: chemokines and beyond. Curr Opin Hematol. 12 (4), 298-304 (2005).
check_url/56218?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Prangley, E., Kumar, T., Ponda, M. P. Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo. J. Vis. Exp. (128), e56218, doi:10.3791/56218 (2017).

View Video