Protokoller for kvantitativ vurdering av lymfocytt chemotaxis og migrasjon er viktige verktøy for immunologi forskning. Her, er en i vitro protokoll beskrevet at tillatelser sanntid, multiplekset evaluering av celle migrasjon og en utfyllende i vivo teknikk aktivere sporing av innfødte celler milten.
Chemotaxis er overføring langs en bestemt kjemiske gradient1. Chemokines er chemotactic cytokiner som fremmer mobilnettet handel med anatomiske og tidsmessige spesifisitet2. Chemotaxis er en viktig funksjon av lymfocytter og andre immunceller som kan kvantitativt vurdert i vitro. Dette manuskriptet beskriver metoder som tillater evaluering av chemotaxis, både i vitro og i vivo, for ulike celletyper inkludert linjer og innfødt celler. Den i vitroplate-basert format tillater sammenligning av flere vilkår samtidig i sanntid, og kan fullføres innen 1-4 h. In vitro analysen forhold kan manipuleres til å introdusere agonister og antagonister, som samt skille chemotaxis fra chemokinesis, som er tilfeldig bevegelse. For i vivo menneskehandel vurderinger, kan immunceller være merket med flere fluorescerende fargestoffer og brukes for adopsjon overføring. Differensial merkingen av celler gir mikset-celle populasjoner introduseres inn i samme dyret, og dermed redusere variansen og redusere antall dyr kreves for et tilstrekkelig drevet eksperiment. Overføringen i lymfoidvev oppstår i så lite som 1 h og flere vev rom kan prøves. Flowcytometri etter vev harvest tillater en rask og kvantitativ analyse av den vandrende mønstre flere celletyper.
Robust immunitet krever kompleks timelige og romlig samordning av en rekke celletyper for å besvare skade, infeksjon og generere self-tolerance. Flere dusin chemokine reseptorer og deres tilsvarende ligander har blitt oppdaget og preget gir molekylære mekanismer av hvilke bestemte celler kan rettes i en bestemt vev på et bestemt tidspunkt. Dermed er studere chemotaxis og overføring en uunnværlig del av immunologi forskning. Faktisk, beskrevet i vitro analysen ble sist brukt som en screening verktøyet for å identifisere chemotactic kofaktor som akselererer chemotaxis av T-celler mot C-C chemokines 19 og 213. Formålet med metodene som er beskrevet her er å tillate kvantitative vurderinger av immun celle chemotaxis i vitro og i vivo.
Boyden (celle migrasjon og invasjonen) kammer analysen er en billig, reproduserbare og rask metode for å vurdere celle migrasjon4,5. I standard analysen, den øvre kammeret er plantet med celler og er atskilt med en porøs sett fra en lavere kammer, der cellene overføre. Da ønskede, kan celler som har migrert til undersiden av sette fast og farget for kvantifisering av * lys. Men slike målinger begrense datainnsamling til en enkelt sluttpunktet, som utelukker dynamisk datainnsamling og kan kreve omfattende optimalisering å bestemme optimale tidspunktet for analyse. Her beskrives flere tilpasninger som tillater sanntid, kvantitative og multiplex målinger av chemotaxis i vitro.
I vivo studier, brukes en funksjonell sluttpunkt, nemlig bestemt akkumulering av celler i en gitt vev kupé. Forhåndsinnstilte merket donor cellene er introdusert i mottakerens dyr gjennom adopsjon overføring. Disse donor cellene kan senere identifiseres av flowcytometri etter mottaker vev innhøsting. Også presentert er en co merking strategi som tillater fastsetting av handel med ulike celletyper i en enkelt mottaker dyr. Denne metoden eliminerer Inter dyr variasjon fra celle injeksjon, og står for fysiologiske Inter dyr variasjon.
Kvantifisering av immun celle migrasjon kan oppnås ved hjelp av enkle og raske søk både i vitro og i vivo. Vi viser i vitro chemotaxis av menneskelig monocytter svar til et MCP-1 gradering og styrking av serum. I vivo, donor murine splenocytes var ulikt merket og etter adoptivforeldre overføring, gjenvunnet fra mottakeren dyr.
Bruke en plate leser har fordelen av prøvetaking flere tidspunkt (så ofte som hvert 30 s) og automatisere kvantifisering overf?…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av Bernard L. Schwartz programmet for lege forskere ved The Rockefeller University, Robertson terapeutiske utvikling fondet ved Rockefeller University, og Sackler Center for biomedisin og ernæring forskning på den Rockefeller University.
RPMI-1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875-093 | |
HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630-080 | |
Fetal Bovine Serum | ATCC | 30-2020 | |
Cell culture flask | Corning | 353136 | |
Calcein AM | Thermo Fisher Scientific | C1430 | Excitation: 485nm, Emission: 520nm |
Cell culture dish | Corning | 1007 | |
24 well plate | Corning | 353504 | |
Fluoroblok Fibronectin Insert | Corning | CB354597 | |
15 mL conical tube | Corning | 352097 | |
Bovine Serum Albumin | Cell Signaling Technology | 9998S | |
Human Recombinant MCP-1 | Peprotech | 300-04 | |
Adult bovine Serum | Sigma | B9433 | |
HBSS with calcium and magnesium; no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
SpectraMax M2e plate reader | Molecular Devices | ||
Olympus IX71 inverted fluorescence microscope | Olympus | ||
Isothesia | Henry Schein animal health | 11695-6776-2 | Isofluorane anesthesia |
Cell strainer 40um nylon | Falcon Corning | 352340 | |
ACK lysing buffer | Quality Biological | 118-156-101 | |
CellTracker Orange CMTMR Dye | Thermo Fisher Scientific | C2927 | Excitation: 541nm, Emission: 565nm |
CellTracker Green CMFDA Dye | Thermo Fisher Scientific | C2925 | Excitation: 485nm, Emission: 520nm |
5ml syringe | BD Syringe | 309646 | |
1ml TB syringe | BD Syringe | 309625 | |
THP-1 cell line | ATCC | TIB-202 | |
Brilliant Violet 421 anti-mouse CD3 Antibody | Biolegend | 100228 | Excitation: 405nm, Emission: 421nm |
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD19 Antibody | Biolegend | 115540 | Excitation: 405nm, Emission: 603nm |
96-well round bottom plate | Corning | 353077 | |
LSRII | BD Biosciences | Flow cytometer |