Summary
림프 구 chemotaxis 및 마이그레이션에 대 한 양적 평가 대 한 프로토콜은 면역학 연구를 위한 중요 한 도구입니다. 여기, 생체 외에서 프로토콜 허용 실시간, 다중화 세포 이동의 평가 뿐만 아니라 상호 보완적인 vivo에서 기술 활성화 추적 기본 셀의 비장에 설명 되어 있습니다.
Abstract
Chemotaxis는 특정 화학 그라데이션1따라 마이그레이션. 발산은 해부학과 시간적 특이성2세포질 매매 홍보 혈 cytokines. Chemotaxis는 세포의 중요 한 기능 그리고 양이 많게 될 수 있는 다른 면역 세포에 생체 외평가. 이 원고 chemotaxis의 평가 허용 하는 방법에 설명 합니다 둘 다 생체 외에서 그리고 vivo에서, 셀 라인 및 기본 셀을 포함 하 여 다양 한 셀 형식에 대 한. 생체 외에서플레이트 기반 포맷 허용 몇 가지 조건 동시에 비교 실시간, 1-4 헤 체 외에서 분석 결과 조건 주 작동 근 그리고 길 항 근, 소개를 조작할 수 있습니다 내에서 완료 될 수 있습니다 그리고 뿐만 아니라 chemokinesis에서 chemotaxis 차별화는 임의 운동. Vivo에서 인신 매매 평가, 대 한 면역 세포는 여러 형광 염료로 표시 고 입양 전송에 사용 될 수 있습니다. 셀의 차동 라벨 혼합된 셀 인구 함으로써 분산 감소 하 고 적절 하 게 구동된 실험에 필요한 동물의 수를 줄이고 동일한 동물에 소개 될 수 있습니다. 1 시간 만큼 적게 발생 하는 림프 조직으로 마이그레이션 하 고 여러 조직 구획을 샘플링할 수 있다. Cytometry 조직 수확에 따라 여러 종류의 세포 철새 패턴의 급속 한 양적 분석 할 수 있습니다.
Introduction
강력한 면역에는 부상, 감염에 적절 하 게 응답 하 고 생성 하는 self-tolerance 세포 유형의 수많은 복잡 한 시간적 및 공간 조정을 필요 합니다. 여러 다스 chemokine 수용 체와 그들의 해당 ligands 발견 되었습니다 하 고 특정 셀에 의해 특징이 제공 분자 기계 장치는 특정 시간에 특정 조직으로 지시 될 수 있다. 따라서, 공부 chemotaxis 및 마이그레이션 면역학 연구의 필수적인 구성 요소 이다. 실제로, 설명 체 외에서 분석 결과 가속 C C 19와 21 발산3으로 T-세포의 chemotaxis 혈 공동 인자를 식별 하기 위해 심사 도구로 사용 최근 했다. 여기에 설명 된 방법의 목적은 면역 세포 chemotaxis에서 생체 외에서 그리고 vivo에서의 정량적 평가 허용 하는.
Boyden (셀 이동과 침략) 챔버 분석 결과 셀 마이그레이션4,5을 평가 하기 위한, 재현, 저렴 하 고 빠른 방법입니다. 표준 분석 결과에서 상단 챔버 셀, 시드 고 낮은 챔버로 셀 이동에서 다공성 삽입으로 구분 됩니다. 원하는 시간에 셀 삽입의 밑면 마이그레이션한 고정 고 가벼운 현미경 검사 법에 의해 정량에 대 한 스테인드 될 수 있습니다. 그러나, 이러한 측정 동적 데이터 수집 하는 걸로 단일 끝점으로 데이터 수집을 제한 하 고 분석을 위한 최적의 시간 점을 결정 광범위 한 최적화를 요구할 수 있습니다. 여기, 여러 적응 chemotaxis에서 생체 외에서의 실시간, 양적 및 다중화 측정을 허용 하는 설명 합니다.
Vivo에서 학문에 대 한 기능 끝점 사용 됩니다, 즉 주어진된 조직에 세포의 특정 축적. 사전 분류 기증자 세포 입양 전송을 통해 받는 사람 동물에 소개 된다. 이러한 기증자 세포 이후에 받는 조직 수확 후 cytometry로 식별할 수 있습니다. 또한 다른 종류의 세포는 단일 받는 사람 동물 내에서 인신 매매의 결정에 대 한 수 있도록 공동 상표 전략이 이다. 이 방법은 셀 주입, 및 생리 간 동물 다양성에 대 한 계정에서 동물 간 편차를 제거합니다.
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Protocol
모든 절차는 록펠러 대학에 의해 승인 되었다 ' 기관 동물 관리 및 사용 위원회. 모든 동물은 특정 병원 체 자유로운 조건에서 보관 되어 있었다.
1. 체 외에서 Chemotaxis
- 문화 THP-1 세포와 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 4-(2-hydroxyethyl)-1 보충 로스웰 파크 기념 연구소 1640 (RPMI 1640)에 6- piperazineethanesulfonic 산 (HEPES; 25 m m) (미디어 완료), 0.5-1.0 x 10 6 셀/mL 사이 밀도 유지.
- 에는 35 m m 세포 배양 접시, 30 분에 대 한 calcein acetoxymethyl (calcein-오전; 2.5 µ M) 또는 37 ° C에서 완전 한 미디어에 적합 한 형광 성 염료 다른 조건 당 3.5 x 10 라벨 5 THP-1 셀
참고: 염료 세포 막 투과성 및 라이브 셀 라벨와 호환 되어야 합니다. - 사전 따뜻한 플레이트 리더를 37 ° c.
참고: 뿐만 아니라 온도 제어, 하단-읽기 기능이입니다 또한 필요. 마이그레이션 단계 1.10.2 정량화에 대 한 플레이트 리더를 대안에 대 한 참조 셀. - 셀 라벨는 하는 동안 준비 시험 접시와 낮은 챔버.
- 사용 24-잘 조직 배양 플레이트, 잘 당 한 상태. 3 중에 수행 하는 각 조건.
- 행 크의 추가 750 µ L ' s Buffered 소금물 (HBSS) 24-잘 접시에 25 mM HEPES 및 0.1% 소 혈 청 알 부 민 (BSA)와 버퍼. 이 기저 제어 상태 역할을 합니다.
비교 조건, 750 µ L에서 아래쪽 챔버에 전체 볼륨을 항상 유지에 대 한
- 다른 사용 우물.
참고:이 예제에서는 인간 monocyte chemoattractant 단백질-1 (MCP-1) 역할을 chemotaxis 7에 대 한 긍정적인 제어 합니다. - 어셈블 시 혼합물 25 mm HEPES HBSS, BSA (0.1%), 및 MCP-1을 결합 하 여
- (75 ng/mL). 성인 소 혈 청을 사용 하 여 (2.7 %v / v) 추가 긍정적인 컨트롤로 MCP-1.
참고: Chemokine 및 chemokine 농도 연구에서 혈 축에 따라 달라 집니다. 동결 건조 된 MCP-1 최종 농도 50 μ g/mL의 재고 솔루션 BSA (0.1%)와 증류수에 resuspended 이다. 이 작업 솔루션 10 μ g/mL의 물에 희석 수 있습니다. 더 낮은 약 실에이 솔루션의 5.6 μ 추가.
- 다른 사용 우물.
- 아래쪽 챔버의 구성이 완료 된 후 삽입 탭 플레이트의 노치와 정렬 있도록 각 잘 다공성 삽입 장소.
참고: 삽입에 대 한 적절 한 기 공 크기를 선택 하십시오. Monocytes, lymphocytes 3 μ m의 기 공 크기를 잘 수행합니다. 일부 세포 유형 및 chemokine 시스템은 최적의 마이그레이션에 대 한 매트릭스 코팅 표면이 필요할 수 있습니다. 예를 들어 측정 THP 1 monocyte chemotaxis MCP-1으로, fibronectin 또는 콜라겐 코팅 삽입은 것이 좋습니다. 정량에 대 한 플레이트 리더, 삽입 있어야 빛 impermeant 코팅, 폴 리 에틸렌 테 레프 탈 레이트, 등 비 마이그레이션의 탐지를 방지 하기 위해 상단에 셀 챔버 8.
- . Calcein 오전에 사용 하 여, 형광 흥분 및 방출 파장에서 설정 485 nm와 520 nm, 각각. 셀 유형 및 chemokine 시스템에 따라 chemotaxis 일반적으로 이상의 1-4 h ( 그림 2A) 발생 합니다.
2. Murine Lymphocytes 입양 전송
- 기증자 세포의 준비
- Anesthetize 8-12 주-isoflurane 마 취 (1-3%)는 기화 기를 사용 하 여 오래 된 C57BL/6J 남성 기증자 쥐. 발가락-핀치에 의해 마 취의 적절 한 깊이 확인.
- 부정사 위치에 마우스를 놓습니다. 메스와 중간 절 개를 만들고 상단 왼쪽된 복 막 공간에서 비장을 찾습니다. 삭제할 모든 비장 고 완벽 한 미디어 (RPMI 10 %FBS 25mm HEPES 보충, 1 mL/비장) 얼음에 합니다. 잘린에 의해 마 취 기증자 동물을 안락사.
- 단일 셀 펜션과 전송 15 mL 원뿔 튜브에 게 주사기 플런저의 끝을 사용 하 여 완전 한 미디어 (1 mL /spleen)로 40 µ m 나일론 메시 부드럽게 통해 비장 조직 갈기.
- 추가 4 염화 염화 칼륨 (ACK) 세포의 버퍼 볼륨과 lyse 적혈구를 실 온에서 5 분 동안 품 어.
- 1000 x g 실 온에서 2 분 동안에 세포를 원심 고 상쾌한 삭제. 적혈구는 펠 릿에 남아, 경우 ACK 세포의 용 해 버퍼에서 resuspend, 실 온에서 5 분 동안 품 어, 1000 x g 2 분 동안에 세포를 원심 및 상쾌한 삭제.
- Resuspend 2 5 10 7 셀/mL, x의 농도에 완전 한 미디어에 셀 다음 40 µ m 나일론 메쉬 셀 파편 제거를 통해 세포 현 탁 액을 변형.
- 레이블 1 형광 염료와 호환 10 7 셀/받는 사람 마우스 x 셀 생활과 그 5-chloromethylfluorescein diacetate (최종 농도 2 μ M) 10 등 이후 고정 시 유지 될 것 이다 . 30 분 동안 37 ° C에서 품 어
참고: 하나 이상의 세포 인구를 추적 하려면 추가 셀 인구와 다른 형광 성 염료를 사용 합니다. 5-(and-6)-(((4-chloromethyl) 벤 조일와 기증자 세포의 부분을 표시 하는 예를 들어,) 아미노) tetramethylrhodamine (최종 농도 2 μ M) 11. - 추가 4 볼륨 HBSS 보충 25mm HEPES, 다음 2 분 및 폐기 상쾌한 1000 x g에서 원심 분리기. HBSS HEPES 25 m m 1 x 10 8 셀/mL의 최종 농도에 보충에 펠 릿을 resuspend.
- 하나 이상의 형광 염료를 사용 하는 경우 계속 주입 직전까지 분리 하는 세포 인구.
- 이후의 흐름 cytometry 보상 통 솔루션 (1 mL)을 각 색의 세포의 작은 약 수 (10 μ) 전송.
- 림프 톨의 전송
- 8-12 주 Anesthetize-isoflurane (1-3%);는 기화 기를 사용 하 여의 오래 된 C57BL/6J 남성 받는 사람 마우스 발가락 핀치에 의해 마 취의 깊이 확인. 동물에 수의 연 고를 적용 ' 건조 방지 하기 위해 s 눈.
- 짧게 소용돌이 기증자 세포 (1 s) 및 1 mL 주입 주사기 27 g, 바늘, 0.5에 해당 하는 경우 차동 레이블이 세포 인구를 결합.
- 이후의 흐름 cytometry 분석 통 솔루션 (1 mL) 혼합된 셀의 작은 약 수 (10 μ) 전송.
- 기증자 동물 발생 하기 쉬운 위치에 배치. 눈, 약간 내 다 눈알을 일으키는 등 피부에 가벼운 꼬리 압력 적용.
- Medially 바늘을 직접 하 고 각 받는 사람 마우스에 복고풍 orbitally 기증자 세포 현 탁 액의 100 µ L를 주입. 셀도 꼬리 정 맥을 통해 주입 할 수 있습니다.
- 는 점차적으로 주사 바늘을 철회 하 고 복구에 혼자 마우스를 놓습니다. 그것은 의식; 회복 될 때까지 동물을 모니터링 일단 완전히 복구 된 반환 동물 사회 주택.
- 수집 및 분석
- 1 시간 후 anesthetize 한 기화 기를 사용 하 여 받는 사람 마우스 isoflurane 마 취 (1-3%)와 함께, 발가락-핀치에 의해 마 취의 깊이 확인. 비장 (또는 관심의 다른 조직) 수확 (2.1.2 단계.) 각 받는 사람 마우스와 완전 한 미디어 (1 mL/받는 사람)에 장소에서. 잘린에 의해 마 취 동물을 안락사.
참고: 조직 수확 전에 더 긴 간격으로 적어도 24 h. 통해 조직 축적 증가 - 주사기 플런저의 끝을 사용 하 여 단일 세포 현 탁 액 및 전송 15 mL 원뿔 튜브에 게 완전 한 미디어로 40 µ m 나일론 메시 부드럽게 통해 비장 조직 갈기.
- 추가 4 볼륨 ACK 세포의 버퍼링 하 고 실 온에서 5 분을 품 어. 실 온에서 2 분 동안 1000 x g에 세포 현 탁 액을 원심 및 상쾌한 삭제.
- 얼룩에서 resuspend 셀 버퍼 (인산 염 버퍼 염 분 보충 1 %FBS). 셀 고 3 x 10 7 셀/mL의 최종 농도를 조정 합니다. 세포 현 탁 액의 100 µ L 하단 플레이트 라운드 96 잘 전송.
- Cytometry에 의해 분석을 위해 원하는 마커 (재료의 표 참조)에 대 한 얼룩 셀. 원하는 표시에 대 한 fluorophore 활용 된 항 체 (재료의 표 참조)를 추가 하 고 어둠 속에서 20 분 동안 4 ° C에서 품 어. 100 µ L를 추가 3 분 1000 x g에서 세포를 원심 버퍼, 얼룩 및 삭제는 상쾌한.
- 200 µ L에 펠 릿을 resuspend 3 분 1000 x g에서 세포를 원심 버퍼, 얼룩 및 삭제는 상쾌한.
- Resuspend 125 µ L 얼룩에 펠 릿 버퍼 및 표준 절차를 사용 하 여 교류 cytometer를 사용 하 여 샘플을 수집.
참고: 녹색 염료 488 nm 레이저에 의해 흥분 되 고 방출 505 530/30 dichroic 필터 감지. 주황색 염료는 561에 의해 흥분 및 방출 582/15의 dichroic 필터에 의해 검출 된다.- 2.1.8.2 각 형광 성 염료에 대 한 보상에서 사용 저장 셀.
참고: fluorophores 여기 및 라벨 염료의 방출 스펙트럼과 구슬 기반 보상을 사용 하 여 차선 보상 발생 합니다. - 사용 하 여 단계 2.2.2.1에서에서 저장 된 입력된 셀의 비율을 정확 하 게 결정 경우 하나 이상의 레이블이 인구 ( 그림 3)를 사용 하 여 차동 입력된 셀을 표시. 레이블이 없는 셀 ( 그림 4)에 표시 된 계산의 비율에 따라 조직 특정 마이그레이션.
- 2.1.8.2 각 형광 성 염료에 대 한 보상에서 사용 저장 셀.
- 1 시간 후 anesthetize 한 기화 기를 사용 하 여 받는 사람 마우스 isoflurane 마 취 (1-3%)와 함께, 발가락-핀치에 의해 마 취의 깊이 확인. 비장 (또는 관심의 다른 조직) 수확 (2.1.2 단계.) 각 받는 사람 마우스와 완전 한 미디어 (1 mL/받는 사람)에 장소에서. 잘린에 의해 마 취 동물을 안락사.
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Representative Results
Calcein 오전 염료를 사용 하는 경우 셀의 시각적 검사 레이블 통풍 관 (그림 1)를 확인 합니다. 자동화 된 형광 판독 시간이 지남에 삽입의 아래쪽에 셀 교통으로 마이그레이션을 추적 합니다. 이러한 데이터는 명확 하 게 혈 청 (그림 2A)에 의해이 응답의 확대 뿐만 아니라 MCP-1으로 셀 이동의 유도 표시. 철새 자극의 강도 따라, 신호 증가 전에 적어도 15 분의 지연이 있다. 형광 신호 피크 하 고 점차적으로 거부할 수 있습니다. 이 셀 셀 위 약 실에서 마이그레이션 보다 더 빠른 속도로 낮은 챔버로 솔루션으로 통과 삽입의 밑바닥에 고착 하는 셀의 수에 있는 순수한 감소를 나타냅니다. 더 강한 철새 자극에 일반적으로 결과) 형광 값;에 상승의 이전 발병 형광; 증가의 b) 빠른 속도 그리고 c) 높은 피크 형광 값. 거꾸로 형광 현미경 검사 법에 의해 취득 하는 대표 이미지도 셀 (그림 2C)의 정량과 (그림 2B), 표시 됩니다.
비보에 이용 하 여 연구 이상의 형광 라벨, 입력된 자료에 세포 인구의 상대적 비율을 quantitate 중요 하다. 이 혼합 주사 (그림 3)에 대 한 세포 인구에 대 한 분산에 대 한 계정. 이 경우에, 녹색 및 주황색 형광 세포의 비율이 이었다 0.97:1. 따라서,이 약간의 불균형에 대 한 계정, 녹색 형광 셀 카운트 입력된 자료에 비례하여 그들의 숫자 색인을 0.97로 분할 되었다. Cytometry로 레이블이 지정 된 셀을 측정 후 매매 수 측정할 수 복구 하는 세포의 총 수로 나눈 복구 레이블이 지정 된 셀의 수로.
이 결과 다양 한 주입 효능; 효과 제거 하는 듀얼 컬러 전략을 사용 하는 이점은 입증 동물 사이 복구 된 세포의 상당한 변화 동안에, 주황색 형광을 녹색 형광 세포 비율은 약 어떤 주어진된 동물 든 지에 대 한 동등한 것 (그림 4). 이러한 결과 예상, 두 개의 셀으로 인구는, 동일 하 게 취급 했다 하지만 다양 한 섭 림프 구 유도에 미치는 영향에 대 한 테스트할 수 있습니다. 정체성의 라인에서 벗어난 다른 철새 기능 특정 세포 인구를 나타내는 것 이다. 또한, 여러 셀 하위 집합 원하는 단백질에 대 한 복구 된 세포를 얼룩이 지기에 의해 확인할 수 있습니다. 여기, T-세포, CD3 얼룩, 표시 및 B-세포, CD19 얼룩으로 표시는 녹색-오렌지 형광 세포의 동등한 비율으로 복구 또한.
그림 1: 셀 라벨. 라벨링 후 셀 펠 릿의 육안 검사 형광 염료의 (왼쪽), 달리 (오른쪽)를 표시 하기 전에 적절 한 이해를 확인 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 체 외에서 마이그레이션의 정량화. (A) 대표 데이터 (평균 ± 표준 오차)에 인수 3 조건 비교 플레이트 리더에서 실시간: 미디어 (제어), chemokine (MCP-1, 75 ng/mL) 또는 chemokine 세럼 (MCP-1, 75 ng/mL 및 소 해 혈 청, 버퍼에 2.7 %v / v)와 함께. 판독 520의 485 nm 및 검출 파장의 여기 파장을 가진 접시 마다 3 분의 밑면에서 인수 했다 nm. (B) 4 X 대표 현미경 확대 1 h, 마이그레이션 직접 시각화 수 있는 삽입의 아래쪽의 세포. 바 규모 500 µ m (노랑) =. (C) 저전력 필드 당 휴대폰 번호의 정량화 (LPF; 4 X) ImageJ 소프트웨어를 사용 하 여. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 입력된 셀 스테인드. 교류 cytometry 줄거리 차동 2의 비율을 보여주는 단계 2.2.2.1에서에서 주입 된 셀 입력에 세포 인구 스테인드. 이 줄거리에서 결정 하는 비율 차이 두 개의 인구의 초기 혼합 하는 동안 도입에 대 한 수정 하 고 다운스트림 데이터 분석 하는 동안 셀 수를 조정 하는 데 사용 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 받는 사람 동물의 spleens에서 레이블이 지정 된 셀의 비율 회복. 녹색 형광 또는 오렌지 형광 세포의 비율 각 데이터 요소를 나타내는 단일 받는 사람 동물 총 복구 된 splenocytes의 비율로 표시 됩니다. 셀을 표시 하는 총은 또한 세포 표면 마커 CD19 (사각형) 또는 c d 3에 대 한 긍정적인 스테인드 하위 집합 뿐만 아니라 그림된 (삼각형), (원). 파선은 정체성의 색상 사이의 비율입니다 1. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
면역 세포 이동의 정량화는 간단한를 사용 하 여 수행할 수 있습니다 그리고 신속한 분석 실험 체 외에서 그리고 vivo에서모두. 혈 청에 의해 인간 monocytes MCP-1 그라디언트 및 확대에 대 한 응답에서의 chemotaxis 생체 외에서 설명합니다. Vivo에서, 기증자 murine splenocytes 차동 표시 했다 고 입양 전송 다음 받는 사람 동물에서 발견 했다.
몇 시간 포인트 샘플링의 장점이 플레이트 리더를 사용 하 여 (자주 매일 30 s) 및 셀 자동화 마이그레이션의 정량. 이 평가 및 개인 우물의 수동 계산의 더 노동 집약적인 방법 피하에 대 한 단일 시간 지점을 선택 하는 필요성을 obviates. 또한,이 방법은 현미경 검사 법에 의해 수집 될 수 있다 보다 더 동적 정보를 제공 합니다. 분석 하는 동안 그것는 셀 아래쪽 챔버에 삽입을 떨어질 것 이다 형광 강도에 기여 하지 것 이다 유지 한다. 따라서, 삽입, 밑면에는 셀 수 상대 형광에 의해 표시 된 대로 마이그레이션의 속도와 속도는 셀 삽입 떨어져 기능 있을 것입니다.
큰 셀 더 큰 숨 구멍으로 삽입 해야 할 수도 있습니다 그리고 8 μ m 다공성 삽입 사용할 수 있습니다. 작은 세포 (를 포함 하 여 네이티브 lymphocytes) 충분히 밝은 안정적으로 fluorimeter에 의해 감지 되지 않을 수 있습니다 하 고 특히 chemotaxis에 작은 변화에 대 한 현미경 검사 법에 의해 평가 요구할 수 있습니다. 일부 세포 유형 낮은 챔버 솔루션으로 빠르게 전달 하 고 오랫동안 충분 한 체류 시간에 없는 검색, 삽입 병합된 곡선 결과 수 있습니다. 이 경우 셀 낮은 챔버 솔루션에서 직접 cytometry에 의해 정해질 수 있다 또는 매트릭스 코팅 삽입 삽입을 사용 하 여 더 작은 숨 구멍 (예: 1 μ m)와 운송 시간을 길게 하는 데 사용할 수 있습니다.
이러한 분석에 중요 한는 강력한 철새 조건의 id입니다. 생체 외에서 연구, 공부 하는 셀 형식을 chemoattractant에 응답 수 있어야 합니다 및 필요한 공동 요인을 고려해 야 합니다. 최적화는 상단 챔버에 도입 된 세포 밀도 대 한 필요할 수 있습니다. 일반적으로, 더 높은 조밀도 더 강한 신호를 발생 합니다 있지만이 높은 일반적인 마이그레이션 신호에 대 한 균형 해야 합니다. Chemoattractant 농도의 범위를 테스트 수 있습니다 또한 식별할 마이그레이션 캡처에 대 한 적합 한 임시 창.
이 방법은 또한 여러 색상을 사용 하 여 적용할 수 있습니다. 이 알만 단일 분석 결과에 포함 될 수 있는 조건의 수 증가 뿐만 아니라 다양성, 줄일 것 이다. 주 고려 여기 형광 염료의 밝기입니다. Calcein 오전은 매우 밝고 따라서 쉽게 현미경 및 플레이트 리더 응용 프로그램에 의해 감지. 반면 염료 사용에 대 한 vivo에서 연구 현미경 검사 법에 의해 쉽게 탐지 되지 했다 생산과 높은 배경; 아마도이 또한 정확한 플레이트 리더 검색을 배제 것 이다.
Vivo에서 학문에 대 한 기증자 세포의 건강은 그들의 이동성 기능을 보존 하는 것이 중요. 허 혈 및 세포 죽음의 가능성을 증가 하는 생존 비 수술 보다는 기증자 동물을 희생 하 고 다음 셀, 수확의 일환으로 기증자 세포의 수확 할 수 있습니다. 주사와 수확 사이의 시간은 다른 세포 인구 사용 되는; 실험에 대 한 중요 한 고려 사항 분기 또는 세포 인구 사이의 유사성 수준 시간이 지남에 변경할 수 있습니다. 받는 사람에 주입을 최소화 한다 기증자 로부터 수확 후 처리 시간. 또한, 기증자/받는 사람 호환성 또한 긴요 하다. 인간의 세포 내부 종 수용자 세포는 짧은 기간 동안 잘 용납 쥐에 의해 신속 하 게 거부 됩니다. 예를 들어 우리 찾을 수 없습니다 마이그레이션에 차이 C57BL/6J 또는 BALB/cJ 기증자와 셀 C57BL/6J 받는 1 시간 동안 사용 됩니다.
이 비보에 방식은 철새 기능에 차이 평가 하는 데 유용 합니다. 두 셀을 입력 하 고 받는 사람 동물 약리학 또는 다른 섭 대상이 될 수 있습니다. 마찬가지로, 받는 사람 동물 전염 성 또는 염증 성 자극, 또는 림프 구 밀매12에 영향을 주는 다른 치료에 노출 될 수 있습니다. 이 프로토콜 유전자 변형 마우스 라인에 쉽게 적용 수 있습니다 또한. 특히, 형광 단백질을 표현 하는 그 라벨에 대 한 필요성을 제거 것 및 멀티플렉싱 전략 약효 수 있습니다.
그것은 주입 전에 다른 세포 인구는 혼합 시간 가능한 만큼 감소 되어야 한다는 주의 하는 것이 중요. 받는 사람 동물 완전히 마 취 주사에 대 한 준비가 되어 후에 차동 레이블이 세포 인구를 혼합 한다. 다른 인구에 있는 염료, cytometry에 의해 분석 하는 경우 둘 사이의 불분명 분리 결과로 혼합할 수 있습니다. 또한, 다른 치료 조건이이 기간 동안 치료 세포를 달라질 수 있습니다. 예를 들어 세포 표면에 바인딩되는 에이전트 결과 혼동 함으로써 치료 셀에 양도할 수 있습니다.
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Disclosures
저자 공개할 게 없다
Acknowledgments
이 작품 의학 및 영양 연구에 대 한 록펠러 대학, 록펠러 대학에 로버트 슨 치료 개발 기금 그리고 Sackler 센터에서 의사 과학자에 대 한 버나드 L. 슈워츠 프로그램에 의해 지원 되었다는 록펠러 대학입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875-093 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630-080 | |
| Fetal Bovine Serum | ATCC | 30-2020 | |
| Cell culture flask | Corning | 353136 | |
| Calcein AM | Thermo Fisher Scientific | C1430 | Excitation: 485nm, Emission: 520nm |
| Cell culture dish | Corning | 1007 | |
| 24 well plate | Corning | 353504 | |
| Fluoroblok Fibronectin Insert | Corning | CB354597 | |
| 15 mL conical tube | Corning | 352097 | |
| Bovine Serum Albumin | Cell Signaling Technology | 9998S | |
| Human Recombinant MCP-1 | Peprotech | 300-04 | |
| Adult bovine Serum | Sigma | B9433 | |
| HBSS with calcium and magnesium; no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
| SpectraMax M2e plate reader | Molecular Devices | ||
| Olympus IX71 inverted fluorescence microscope | Olympus | ||
| Isothesia | Henry Schein animal health | 11695-6776-2 | Isofluorane anesthesia |
| Cell strainer 40um nylon | Falcon Corning | 352340 | |
| ACK lysing buffer | Quality Biological | 118-156-101 | |
| CellTracker Orange CMTMR Dye | Thermo Fisher Scientific | C2927 | Excitation: 541nm, Emission: 565nm |
| CellTracker Green CMFDA Dye | Thermo Fisher Scientific | C2925 | Excitation: 485nm, Emission: 520nm |
| 5ml syringe | BD Syringe | 309646 | |
| 1ml TB syringe | BD Syringe | 309625 | |
| THP-1 cell line | ATCC | TIB-202 | |
| Brilliant Violet 421 anti-mouse CD3 Antibody | Biolegend | 100228 | Excitation: 405nm, Emission: 421nm |
| Brilliant Violet 605 anti-mouse CD19 Antibody | Biolegend | 115540 | Excitation: 405nm, Emission: 603nm |
| 96-well round bottom plate | Corning | 353077 | |
| LSRII | BD Biosciences | Flow cytometer |
References
- Griffith, J. W., Sokol, C. L., Luster, A. D. Chemokines and chemokine receptors: positioning cells for host defense and immunity. Annu Rev Immunol. 32, 659-702 (2014).
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