Summary
Protocolos para avaliação quantitativa da quimiotaxia de linfócitos e migração são ferramentas importantes para pesquisa de Imunologia. Aqui, um protocolo em vitro é descrito que permite em tempo real, multiplexados avaliação da migração celular, bem como um complementares na vivo técnica permitindo rastreamento de células nativas para o baço.
Abstract
Quimiotaxia é a migração ao longo de um gradiente químico específico1. Quimiocinas são Quimiotáticos citocinas que promovem o tráfico celular com especificidade anatómica e temporal2. Quimiotaxia é uma função crítica de linfócitos e outras células do sistema imunológico que podem ser quantitativamente avaliada em vitro. Este manuscrito descreve métodos que permitem a avaliação da quimiotaxia, tanto in vitro e em vivo, para tipos de diversas células incluindo linhas celulares e células nativas. O em vitro, formato baseado na placa permite a comparação das várias condições simultaneamente em tempo real e pode ser concluída dentro de 1-4 h. em vitro ensaio condições podem ser manipuladas para introduzir-se como agonistas e antagonistas, bem como diferencia quimiotaxia de chemokinesis, que é o movimento aleatório. Na vivo avaliação do tráfico, de células do sistema imunológico podem ser rotuladas com vários corantes fluorescentes e usadas para transferência adotiva. A rotulagem diferencial de células permite a populações de células mistas a ser introduzido o mesmo animal, assim, diminuindo a variância e reduzindo o número de animais necessários para uma experiência adequadamente alimentada. Migração no tecido linfoide ocorre em menos de 1h, e vários compartimentos de tecido podem ser saboreados. Citometria de fluxo após a colheita de tecidos permite uma análise rápida e quantitativa dos padrões migratórios de vários tipos de células.
Introduction
Imunidade robusta requer a coordenação temporal e espacial complexa de uma miríade de tipos de células, a fim de responder adequadamente a uma lesão, infecção e gerar auto-tolerância. Várias dezenas de receptors do chemokine e seus ligantes correspondentes foram descobertos e caracterizados fornecendo mecanismos moleculares pelos quais células específicas podem ser direcionados em um tecido específico em um tempo específico. Assim, estudar a quimiotaxia e a migração é um componente indispensável de pesquisa de Imunologia. Com efeito, o ensaio descrito em vitro recentemente foi usado como uma ferramenta de triagem para identificar um cofactor quimiotático que acelera a quimiotaxia de células T em direção de quimiocinas, 19 e 21 C C3. A finalidade dos métodos descritos aqui são para permitir avaliações quantitativas de célula imune quimiotaxia em vitro e in vivo.
O ensaio de câmara Boyden (migração celular e invasão) é um método barato, reprodutível e rápido para avaliar a migração de células4,5. No ensaio de padrão, a câmara superior é semeada com células e é separada por uma inserção porosa de uma câmara inferior, na qual as células migram. No momento desejado, células que migraram para a parte inferior da inserção podem ser fixo e manchadas para quantificação por microscopia de luz. No entanto, tais medições restringem a coleta de dados para um único ponto de extremidade, o que impede a coleta de dados dinâmico e podem exigir a otimização extensiva para determinar o ponto ideal de tempo para análise. Aqui, várias adaptações são descritas que permite medições em tempo real, quantitativas e multiplexadas de quimiotaxia em vitro.
Estudos em vivo , é usado um ponto de extremidade funcional, ou seja, o acúmulo específico de células em um compartimento de determinado tecido. Células de doador previamente rotulado são introduzidas animais destinatários através de transferência adotiva. Estas células de doador posteriormente podem ser identificadas por citometria de fluxo após a colheita de tecidos destinatário. Também apresentado é uma estratégia co rotulagem que permite a determinação do tráfico de diferentes tipos de células dentro de um único animal de destinatário. Esse método elimina a variação entre animais da injeção de célula, contas e variabilidade fisiológica de animal para animal.
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Protocol
todos os procedimentos foram aprovados pela Universidade Rockefeller ' s institucionais Cuidado Animal e Comissão de utilização. Todos os animais estavam alojados em condições específicas isentos de organismos patogénicos.
1. quimiotaxia In Vitro e
- cultura THP-1 células 6 em Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 4-(2-hidroxietil) -1- piperazineethanesulfonic ácido (ácido HEPES 25mm) (completar a mídia), mantendo a densidade entre 0,5-1,0 x 10 6 células/mL.
- Cultura de células em um 35 mm prato, etiqueta 3.5 x 10 5 THP-1 células por condição com acetoximetil calceína (calceína-AM; 2,5 µM) ou outra apropriada tintura fluorescente em mídia completa a 37 ° C por 30 min.
Nota: Corantes devem ser permeável a membrana celular e compatível com live-célula rotulagem. - Pré-aquecer um leitor de placas a 37 ° C.
Nota: Além do controle de temperatura, funcionalidade de leitura de fundo também é necessária. Consulte a etapa 1.10.2 para uma alternativa para um leitor de placas para quantificação de migração células. - Enquanto as células estão rotulando, preparar a placa de ensaio e câmara inferior.
Placa
- uso de cultura de tecido 24-bem, com uma condição por bem. Realizar cada condição em triplicado.
- Adicionar 750 µ l de Hank ' s solução de sal de tampão (HBSS) tamponada com 25mm HEPES e 0,1% albumina de soro bovino (BSA) para a placa de 24. Isto serve como condição o controle basal.
- Uso outro poços para condições de comparador, mantendo sempre o volume total na câmara inferior a 750 µ l.
Nota: Neste exemplo, monócitos humanos quimiotático proteína-1 (MCP-1) serve como o controle positivo para quimiotaxia 7.- Montar a mistura reagente combinando HBSS com 25mm HEPES, BSA (0,1%) e MCP-1 (75 ng/mL). Usar soro bovino adulto (2,7% v / v) com 1-MCP como um controle positivo adicional.
Nota: Concentração Chemokine e chemokine dependerá do eixo quimiotático sob estudo. MCP-1 liofilizado é resuspended em água destilada com BSA (0,1%) tornar-se uma solução com uma concentração final de 50 μg/mL. Isto pode ser diluído em água para uma solução de trabalho de 10 μg/mL. Adicionar 5.6 μL desta solução à câmara inferior.
- Montar a mistura reagente combinando HBSS com 25mm HEPES, BSA (0,1%) e MCP-1 (75 ng/mL). Usar soro bovino adulto (2,7% v / v) com 1-MCP como um controle positivo adicional.
- Uso outro poços para condições de comparador, mantendo sempre o volume total na câmara inferior a 750 µ l.
- Após a composição das câmaras de fundo estiver concluída, coloque uma inserção porosa em cada poço, garantindo que as guias do inserto de alinham com os entalhes da placa.
Nota: Escolha o tamanho de poro adequado para as inserções. Para monócitos e linfócitos, um tamanho de poro de 3 μm executa bem. Alguns tipos de células e/ou sistemas de chemokine podem exigir uma superfície revestida de matriz para migração ideal. Por exemplo, para medir a quimiotaxia de monócitos THP-1 no sentido de MCP-1, fibronectina ou inserções de colágeno-revestido são recomendadas. Para o leitor de placas para quantificação, a inserção deve ter um revestimento impermeant-luz, como o tereftalato de polietileno, para evitar a deteção de não-migração células na parte superior de câmara 8.
- Após incubação de células por 30 min com calceína-AM, transferir a suspensão de células para um tubo cônico de 15mL. Células de centrifugar a 1.000 x g por 2 min. inspecionam visualmente as células para confirmar a aceitação de calceína-AM ( Figura 1).
- Remover cuidadosamente o sobrenadante usando um aspirador a vácuo. Lave pilhas etiquetadas em soro livre RPMI 1640 suplementado com HEPES 25mm. Centrifugar as células a 1.000 x g por 2 min e descartar o sobrenadante.
- Os eritrócitos em soro livre RPMI 1640 suplementado com HEPES 25mm. Contar as células e ajustar o volume para que as células estão em uma concentração final de 1.0-1.5 x 10 6 células/mL.
- Dispensar 250 μL da suspensão de células para a inserção (câmara superior).
- , Depois de todas as câmaras superiores foram preenchidas, delicadamente levantem a placa e inspecionam a parte inferior para a presença de bolhas de ar que podem interferir com a migração e a deteção. Para remover uma bolha, primeiro tente remover em seguida re-posicionamento da inserção. Se malsucedido, usar uma agulha 27G para perfurar a bolha e, em seguida, coloque novamente a inserção.
- Coloque a placa no leitor de placa previamente aquecido a 37 ° C.
- Leituras de fluorescência Acquire do fundo em intervalos de 1-3 min. Ao usar calceína-AM, defina a fluorescência excitação e emissão de comprimentos de onda em 485 nm e 520 nm, respectivamente. Dependendo do sistema de tipo e chemokine de célula, quimiotaxia ocorre tipicamente mais de 1-4 h ( Figura 2A).
- Como uma alternativa para medições contínuas usando um leitor de placas, imagem dos poços usando um fluorescente microscópio invertido ( Figura 2B) capaz de excitação e detecção de luz em 485 nm e 520 nm, respectivamente. Use uma baixa ampliação para capturar a maioria da parte inferior da inserção. Quantificar as células, processando as imagens com ImageJ ou similares de software 9.
2. Transferência adotiva de linfócitos de murino
- preparação de células de doador
- Anesthetize semana de 8-12-ratos de doador masculino C57BL/6J velhos com isoflurano anestesia (1-3%), usando um vaporizador. Confirmar a profundidade apropriada da anestesia pelo dedo do pé-pitada.
- Colocar o mouse na posição supina. Fazer uma incisão com um bisturi e localize o baço no espaço peritoneal superior esquerdo. Excisar o baço inteiro e colocar em mídia completa (RPMI suplementado com 10% FBS e 25mm HEPES; 1 mL/baço) no gelo. Eutanásia em animais anestesiados doador por decapitação.
- Moer tecido baço suavemente através de 40 µm de malha de nylon em mídia completa (1 mL /spleen) usando a extremidade de um êmbolo da seringa para fazer uma célula única suspensão e transfira para um tubo cônico de 15 mL.
- Adicionar 4 volumes de lise de potássio (ACK) cloreto de amônio buffer e incubar durante 5 min à temperatura ambiente para lisar eritrócitos.
- As células a 1.000 x g por 2 min à temperatura de centrifugação e descartar o sobrenadante. Se hemácias permanecem em pelota, resuspenda em tampão de Lise ACK, incubar durante 5 min à temperatura ambiente, centrifugue células a 1.000 x g por 2 min e descartar o sobrenadante.
- Ressuspender as células em mídia completa em uma concentração de 2-5 x 10 7 células/mL e, em seguida, estique a suspensão de células através de uma malha de nylon de 40 µm para remover os resíduos de células.
- Label 1 x 10 7 rato de células/destinatário com uma tintura fluorescente compatível com células vivas e que será mantida mediante fixação subsequente, tais como 5-chloromethylfluorescein diacetato (concentração final 2 μM) 10 . Incubar a 37 ° C por 30 min.
Nota: Para controlar a população de mais de um celular, use outras tinturas fluorescentes com populações de células adicionais. Por exemplo, uma parte das células do doador pode ser rotulada com 5-(and-6)-(((4-chloromethyl) benzoíla) amino) diversos (concentração final 2 μM) 11. - Adicionar 4 volumes HBSS suplementado com 25mm HEPES, em seguida, centrifugar a 1.000 x g por 2 min e descarte sobrenadante. Resuspenda o pellet em HBSS suplementado com HEPES 25mm para uma concentração final de 1 x 10 8 células/mL.
- Se usando mais de um corante fluorescente, manter as populações de células separadas até imediatamente antes da injeção.
- Transferir uma pequena alíquota (10 μL) de células de cada cor para uma solução fixador (1 mL) para compensação de citometria de fluxo subsequente.
- Transferência de linfócitos
- anestesiamos a semana de 8-12-velhos camundongos C57BL/6J destinatários machos com isoflurano (1-3%) usando um vaporizador; confirmar a profundidade de anestesia pelo dedo do pé-pitada. Aplicar a pomada veterinária animal ' olhos de s para impedir a secagem.
- Brevemente as células do doador vórtice (1 s) e a transferência para a seringa de injeção de 1 mL com 27 G, 0,5 na agulha, combinando populações de células diferencialmente rotulado, se aplicável.
- Transferir uma pequena alíquota (10 μL) de células mistas para uma solução fixador (1 mL) para análises de citometria de fluxo subsequente.
- Colocar animais dadores de bruços. Aplique uma pressão suave caudal a pele dorsal para o olho, fazendo com que o globo ocular para se projetar ligeiramente.
- Direto da agulha medialmente e injetar 100 µ l de suspensão de células de doador retrô-orbitally para cada destinatário do mouse. As células também podem ser injetadas através da veia da cauda.
- , Gradualmente, retirar a agulha de injeção e posicione o mouse sozinho em uma gaiola de recuperação. Monitorar o animal até que ele recuperou a consciência; uma vez totalmente recuperado retorno do animal à habitação social.
- Recolha e análise
- após 1 h, anestesiar o destinatários ratos com isoflurano anestesia (1-3%) usando um vaporizador; confirmar a profundidade de anestesia pelo dedo do pé-pitada. Colher o baço (ou outro tecido de interesse) (etapa 2.1.2.) de cada destinatário do mouse e coloque em mídia completa (1 mL/destinatário). Eutanásia em animais anestesiados por decapitação.
Nota: Maiores intervalos antes da colheita de tecido irão aumentar a acumulação de tecido através de pelo menos 24 h. - Moer tecido baço suavemente através de 40 µm de malha de nylon em mídia completa usando a extremidade de um êmbolo da seringa para fazer uma célula única suspensão e transferência para tubo cônico de 15 mL.
- Adicionar 4 volumes do lysis ACK buffer e incubam 5 min à temperatura ambiente. Centrifugar a suspensão de eritrócitos a 1.000 x g por 2 min à temperatura ambiente e descartar o sobrenadante.
- Os eritrócitos de coloração, o tampão (tampão fosfato salino suplementado com 1% FBS). Contar as células e ajustar para uma concentração final de 3 x 10 7 células/mL. Transferir 100 µ l de suspensão de células para um 96-poço redondo placa inferior.
- Células mancha para marcadores desejadas (consulte a tabela de materiais) para análise por citometria de fluxo. Adicionar anticorpos conjugados fluoróforo (consulte a tabela de materiais) contra marcadores desejadas e incubar a 4 ° C por 20 min no escuro. Adicione 100 µ l tampão de coloração, centrifugue células a 1.000 x g por 3 min e descartar o sobrenadante.
- Resuspenda o pellet em 200 µ l tampão de coloração, centrifugue células a 1.000 x g por 3 min e descartar o sobrenadante.
- Ressuspender o sedimento na coloração de 125 µ l de buffer e adquirir amostras usando um citômetro de fluxo, usando os procedimentos padrão.
Nota: A tinta verde é animada por um laser de 488 nm e a emissão é detectada com filtros dicroicos 505 e 530/30. O corante laranja é animado por um 561 nm e a emissão é detectado por um filtro dicroico 582/15.- Uso salvou células de 2.1.8.2 para compensar cada tintura fluorescente.
Nota: Usando a compensação baseada no grânulo com fluorophores correspondência a excitação e espectros de emissão das tinturas rotulagem resultará em compensação suboptimal. - Usar as células de entrada salvas da etapa 2.2.2.1 para determinar com precisão a proporção de diferencialmente rotulado entradas células se usando mais do que uma população rotulada ( Figura 3). Calcular a migração específica de tecido com base na relação de rotulado de células sem rótulo ( Figura 4).
- Uso salvou células de 2.1.8.2 para compensar cada tintura fluorescente.
- após 1 h, anestesiar o destinatários ratos com isoflurano anestesia (1-3%) usando um vaporizador; confirmar a profundidade de anestesia pelo dedo do pé-pitada. Colher o baço (ou outro tecido de interesse) (etapa 2.1.2.) de cada destinatário do mouse e coloque em mídia completa (1 mL/destinatário). Eutanásia em animais anestesiados por decapitação.
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Representative Results
Quando usar tintura de calceína-AM, inspeção visual das células confirmará a captação do rótulo (Figura 1). Leituras de fluorescentes automatizadas controlará a migração como trânsito de células na parte inferior da inserção ao longo do tempo. Estes dados mostram claramente uma indução de migração de células para o MCP-1, bem como um aumento da resposta pelo soro (Figura 2A). Dependendo da força do estímulo migratório, há um intervalo de pelo menos 15 min antes do aumento do sinal. O sinal fluorescente pode pico e então gradualmente declinar. Isto representa uma diminuição líquida do número de células aderindo à parte inferior da inserção como células passam em solução na câmara inferior a um ritmo mais rápido do que a de células migrando de câmara superior. Mais fortes estímulos migratórios normalmente resultam em um) início anterior de um aumento nos valores de fluorescência; b) mais rápida taxa de aumento na fluorescência; e c) valores de fluorescência de pico mais altos. Imagens representativas, adquiridas pela microscopia de fluorescência invertido também são mostradas (Figura 2B), com a quantificação da contagem de células (Figura 2).
Estudos em vivo utilizando mais de uma etiqueta fluorescente, é importante dosar a proporção relativa de populações de células do material de entrada. Que explica a variação na mistura de populações de células para injeção (Figura 3). Neste caso, a proporção de células de verde e laranja-fluorescente foi 0.97:1. Assim, para compensar este desequilíbrio ligeiro, contagem de células verde-fluorescente foram divididas por 0,97 para seus números proporcionalmente o material de entrada de índice. Após quantificar pilhas etiquetadas por citometria de fluxo, tráfico pode ser quantificado como o número de pilhas etiquetadas recuperados dividido pelo número total de células recuperadas.
Estes resultados demonstram a vantagem de usar a estratégia de duplo-cor, que elimina o efeito da eficácia de injeção variável; Embora haja considerável variação de células recuperadas entre os animais, para qualquer determinado animal, que a proporção de células verde-fluorescente para laranja-fluorescente é aproximadamente igual (Figura 4). Estes resultados são esperados, como a célula duas populações foram tratadas de forma idêntica, mas várias perturbações podem ser testadas para o seu efeito na orientação de linfócitos. Desvio da linha de identidade indicam diferentes capacidades migratórias das populações de célula específica. Além disso, vários subconjuntos de células podem ser determinados pela coloração das células recuperadas para as proteínas desejadas. Aqui, as células-T, indicadas pela coloração CD3 e as células B, indicadas pela coloração CD19 também são recuperados com proporções iguais de células de verde para laranja fluorescente.
Figura 1: rotulagem celular. Inspecção visual do centrifugado após rotulagem confirma a absorção adequada da tintura fluorescente (à esquerda), em contraste com antes da rotulagem (direita). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Quantificação de em vitro migração. (A) dados representativos (média ± erro-padrão) adquiridos em tempo real de um leitor de placa comparando 3 condições: mídia (controle), chemokine (MCP-1, 75 ng/mL) ou chemokine com soro (MCP-1, 75 ng/mL e bovina soro, 2,7% v/v no buffer). As leituras foram adquiridas da face inferior da placa cada 3 min, com um comprimento de onda de excitação de 485 nm e deteção de comprimento de onda de 520 nm. (B) micrografias representativas em 4 X ampliação da parte inferior da inserção em 1 h, que permite a visualização directa da migração de células. Escala de barras = 500 µm (amarelo). (C) quantificação do número de células por campo de baixa potência (LPF; 4 X) utilizando software ImageJ. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: manchado células entradas. Enredo de citometria de fluxo mostrando a relação dos dois diferencialmente manchadas de populações de células na célula injetado entrada da etapa 2.2.2.1. A relação determinada a partir desta trama serve para corrigir a variação introduzida durante a mistura inicial das duas populações e é usada para ajustar a contagem de células durante a análise de dados downstream. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: relação de pilhas etiquetadas recuperado de baços de destinatários animais. As proporções de células fluorescentes verde ou laranja-fluorescente são apresentadas em percentagem do total recuperado splenocytes, com cada ponto de dados que representa um animal único destinatário. O total rotulado células são mostrado (triângulo), bem como os subconjuntos que manchados também positivos para os marcadores de superfície celular CD19 (quadrado) ou CD3 (círculo). Linha tracejada é a linha de identidade onde a relação entre as cores é igual a 1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Quantificação da migração celular imune pode ser realizada usando simples e rápida os ensaios in vitro e em vivo. Demonstramos a em vitro quimiotaxia de monócitos humanos em resposta a um gradiente de MCP-1 e aumento pelo soro. In vivo, doador murino splenocytes diferencialmente foram rotulados e após transferência adotiva, foram recuperados do destinatários animais.
Usando um leitor de placa tem a vantagem de vários pontos de tempo de amostragem (tão frequentemente quanto cada 30 s) e automatizando a quantificação da migração de células. Isto elimina a necessidade de escolher um ponto único tempo para avaliação e evitando os métodos de trabalho mais intensivo de contagem manual de poços individuais. Além disso, este método fornece informações mais dinâmicas do que podem ser obtidas por microscopia. Durante a análise deve ser mantido em mente que as células cairão a inserção na câmara inferior e não contribuirá para a intensidade de fluorescência. Assim, o número de células na parte inferior da inserção, como indicado por fluorescência relativa, será uma função da taxa de migração e a taxa pela qual as células caem a inserção.
As células maiores podem exigir uma inserção com poros maiores, e 8 μm porosa inserções estão disponíveis. Células menores (incluindo linfócitos nativos) podem não ser brilhantes o suficiente para ser confiavelmente detectado por um fluorímetro e podem exigir avaliação por microscopia, particularmente para as pequenas alterações na quimiotaxia. Alguns tipos de células podem passar rapidamente para a solução de câmara inferior e não tem bastante tempo residência na pastilha para ser detectado, resultando em uma curva plana. Neste caso, as células podem ser quantificadas por citometria directamente a partir da solução de câmara inferior, ou uma matriz revestidos de inserção pode ser usada para alongar o tempo de trânsito, além de usar um insert com poros menores (por exemplo, 1 μm).
Crítica para estes ensaios é a identificação das condições migratórias robustas. Estudos em vitro , o tipo de célula estudado deve ser capaz de responder a um quimiotático e co-fatores necessários devem ser considerados. Otimização pode ser necessária para a densidade celular introduzida na câmara alta. Em geral, uma densidade mais elevada resultará em um sinal mais forte, mas isso precisa ser equilibrado contra um maior sinal de migração de não-específica. Testar uma gama de concentrações quimiotático também pode ajudar a identificar uma janela temporal adequada para a captura de migração.
Esse método também pode ser adaptado para usar várias cores. Isto é concebível reduziria a variabilidade, bem como o aumento do número de condições que podem ser incluídos em um único ensaio. A consideração principal aqui é o brilho dos corantes fluorescentes. Calceína-AM é muito brilhante e, portanto, facilmente detectado por aplicativos de leitor do microscópio e placa. Considerando que os corantes utilizados para estudos em vivo não foram facilmente detectados por microscopia e produziram o fundo elevado; presumivelmente, isso impediria também deteção de leitor de placa precisos.
Estudos em vivo , a saúde das células do doador é importante preservar sua função migratória. A colheita de células do doador deve ser feita como parte da cirurgia não-sobrevivência, ao invés de sacrificar o animal dador e então colheita de células, que aumenta a probabilidade de morte de isquemia e celular. O tempo entre a injeção e a colheita é uma consideração importante para experimentos em que populações de células diferentes são usadas; o nível de divergência ou similaridade entre as populações de célula pode mudar ao longo do tempo. Tempo de processamento após a colheita do doador até injeção no destinatário deve ser minimizada. Também, a compatibilidade doador/beneficiário também é fundamental. Células humanas serão rapidamente rejeitadas pelos ratos, embora as células alogénicas intra-espécies são bem toleradas durante curtos períodos. Por exemplo, não encontramos uma diferença na migração de células com doadores C57BL/6J ou BALB/cJ são usadas com destinatários C57BL/6J, durante um período de 1 h.
Esse método na vivo é útil para avaliar as diferenças na capacidade migratória. As duas células de entrada e destinatários animais podem estar sujeitas a farmacológicas ou outras perturbações. Da mesma forma, animais destinatários podem ser expostos a estímulos inflamatórios ou infecciosos, ou outros tratamentos que afetam linfócitos tráfico de12. Este protocolo também pode ser aplicado facilmente a linhas de rato transgénico. Em particular, aqueles expressando proteínas fluorescentes que eliminam a necessidade de rotular e poderiam potencializar estratégias de multiplexação.
É importante notar que o tempo em que as populações de células diferentes são misturadas antes da injeção deve ser reduzido o máximo possível. Populações de células diferencialmente rotulada devem ser misturadas somente depois que o destinatários animais tem sido completamente anestesiados e estão prontos para injeção. Podem misturar os corantes presentes nas diferentes populações, resultando na separação clara entre os dois quando analisados por citometria de fluxo. Além disso, as condições de tratamento diferentes podem afetar as células não tratadas durante este tempo. Por exemplo, agentes que se ligam à superfície da célula podem ser transferidos para as células não tratadas, confundindo assim os resultados.
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Disclosures
Os autores não têm nada a divulgar
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo programa Bernard L. Schwartz para cientistas de médico na Universidade Rockefeller, fundo de desenvolvimento terapêutico de Robertson da Universidade Rockefeller, e o centro de Sackler de Biomedicina e nutrição pesquisa na Universidade de Rockefeller.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875-093 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630-080 | |
| Fetal Bovine Serum | ATCC | 30-2020 | |
| Cell culture flask | Corning | 353136 | |
| Calcein AM | Thermo Fisher Scientific | C1430 | Excitation: 485nm, Emission: 520nm |
| Cell culture dish | Corning | 1007 | |
| 24 well plate | Corning | 353504 | |
| Fluoroblok Fibronectin Insert | Corning | CB354597 | |
| 15 mL conical tube | Corning | 352097 | |
| Bovine Serum Albumin | Cell Signaling Technology | 9998S | |
| Human Recombinant MCP-1 | Peprotech | 300-04 | |
| Adult bovine Serum | Sigma | B9433 | |
| HBSS with calcium and magnesium; no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
| SpectraMax M2e plate reader | Molecular Devices | ||
| Olympus IX71 inverted fluorescence microscope | Olympus | ||
| Isothesia | Henry Schein animal health | 11695-6776-2 | Isofluorane anesthesia |
| Cell strainer 40um nylon | Falcon Corning | 352340 | |
| ACK lysing buffer | Quality Biological | 118-156-101 | |
| CellTracker Orange CMTMR Dye | Thermo Fisher Scientific | C2927 | Excitation: 541nm, Emission: 565nm |
| CellTracker Green CMFDA Dye | Thermo Fisher Scientific | C2925 | Excitation: 485nm, Emission: 520nm |
| 5ml syringe | BD Syringe | 309646 | |
| 1ml TB syringe | BD Syringe | 309625 | |
| THP-1 cell line | ATCC | TIB-202 | |
| Brilliant Violet 421 anti-mouse CD3 Antibody | Biolegend | 100228 | Excitation: 405nm, Emission: 421nm |
| Brilliant Violet 605 anti-mouse CD19 Antibody | Biolegend | 115540 | Excitation: 405nm, Emission: 603nm |
| 96-well round bottom plate | Corning | 353077 | |
| LSRII | BD Biosciences | Flow cytometer |
References
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