Summary
Protokoll för kvantitativ bedömning av lymfocyter Kemotaxis och migration är viktiga verktyg för immunologi forskning. Här beskrivs ett in vitro- protokoll att tillstånd i realtid, multiplexed utvärdering av cellmigration, samt en kompletterande in-vivo teknik möjliggör spårning av infödda celler till mjälten.
Abstract
Chemotaxis är migration längs en specifik kemisk toning1. Chemokiner är kemotaktisk cytokiner som främjar cellulära människohandel med anatomisk och tidsmässig specificitet2. Chemotaxis är en kritisk funktion av lymfocyter och andra immunceller som kan vara kvantitativt bedömas in vitro. Detta manuskript beskriver metoder som möjliggör utvärdering av Kemotaxis, både in vitro- och in-vivo, för olika celltyper inklusive cellinjer och infödda celler. I in vitro-plattan-baserat format tillåter jämförelse av flera villkor samtidigt i realtid, och kan slutföras inom 1-4 h. In vitro assay villkor kan manipuleras för att införa agonister och antagonister, som liksom differentiera chemotaxisna från makt, som är slumpmässig rörelse. För in-vivo människohandel bedömningar, kan immunceller vara märkt med flera fluorescerande färgämnen och används för överföring. Differentiell märkning av celler möjliggör blandad cellpopulationer införs till samma djur, därmed minska variansen och minska antalet djur som krävs för ett adekvat powered experiment. Migration i lymfoid vävnad uppstår i så lite som 1 h, och flera vävnad fack kan avsmakas. Flödescytometri efter vävnad skörd möjliggör en snabb och kvantitativ analys av de flyttande mönster av flera celltyper.
Introduction
Robust immunitet kräver komplexa tidsmässiga och rumsliga samordning av en myriad av celltyper för att svara skada, infektion och generera self-tolerance. Flera dussin chemokine receptorer och deras motsvarande ligander har upptäckts och kännetecknas som tillhandahåller molekylära mekanismer genom vilka specifika celler kan riktas till en specifik vävnad vid en viss tidpunkt. Således är att studera Kemotaxis och migration en oumbärlig komponent av immunologi forskning. Faktiskt användes nyligen beskrivna in vitro- analysen som en screeningmetod för att identifiera en kemotaktisk kofaktor som accelererar chemotaxis av T-celler mot C-C chemokiner 19 och 213. Syftet med metoderna som beskrivs här är att möjliggöra kvantitativa bedömningar av immunceller chemotaxis in vitro- och in vivo.
Boyden (cellmigration och invasion) kammare analysen är en billig, reproducerbar och snabb metod för bedömning av cell migration4,5. I standard-analysen, den övre kammaren är seedade med celler, och är åtskilda av en porös Infoga från en nedre kammare, där cellerna migrerar. Vid önskad tid, kan celler som har migrerat till undersidan av skäret fastställas och färgas för kvantitering av ljusmikroskop. Men sådana mätningar begränsa datainsamling till en enda slutpunkt, som utesluter dynamiska datainsamling och kan kräva omfattande optimering för att bestämma den optimala tidpunkten för analys. Här beskrivs flera anpassningar som tillåter och multiplexering i realtid, kvantitativa mätningar av chemotaxisna i vitro.
För in-vivo studier, används en funktionell slutpunkt, nämligen den särskilda ansamlingen av celler i viss vävnad kupé. Pre märkt donatorcellerna införs i mottagarens djur genom överföring. Dessa givare celler kan därefter identifieras genom flödescytometri efter mottagarens vävnad skörd. Presenterade också är en samtidig märkning strategi som möjliggör bestämning av människohandel av olika celltyper inom ett enda mottagare djur. Denna metod eliminerar mellan djura variationen från cell injektionen, och står för fysiologiska variabilitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
alla förfaranden godkändes av Rockefeller University ' s institutionella djur vård och användning kommittén. Alla djur har varit inhysta särskilda villkor patogenfria.
1. In Vitro Chemotaxis
- kultur THP-1 celler 6 1640 Roswell Park Memorial Institute (RPMI 1640) kompletteras med 10% fetalt bovint serum (FBS) och 4-(2-hydroxietyl) -1- piperazineethanesulfonic syra (HEPES; 25 mM) (komplett media), att bibehålla tätheten mellan 0,5-1,0 x 10 6 celler/mL.
- i ett 35 mm cellkultur maträtt, etikett 3,5 x 10 5 THP-1 celler per skick med calcein acetoximetyl (calcein-AM; 2,5 µM) eller andra lämpliga fluorescerande färgämne i komplett media vid 37 ° C i 30 min.
Obs: Färgämnen måste vara cellmembranet-genomsläpplig och kompatibel med live-cell märkning. - Före varm en Plattläsare till 37 ° C.
Obs: Utöver temperaturkontroll, botten-läsning funktionalitet krävs också. Se steg 1.10.2 för ett alternativ till en Plattläsare för kvantifiering av migrera celler. - Medan celler märkning, förbereda den assay plattan och nedre kammaren.
- Använda en 24-väl vävnadsodling platta med ett villkor per brunn. Utför varje villkor i tre exemplar.
- Lägg till 750 µL av Hank ' s fosfatbuffrad saltlösning (HBSS) buffras med 25 mM HEPES och 0,1% bovint serumalbumin (BSA) på 24-väl plattan. Detta fungerar som villkoret basala kontroll.
- Använda andra brunnar för jämförelseläkemedlet villkor, alltid upprätthålla den totala volymen i botten kammare på 750 µL.
Obs: I det här exemplet mänskliga monocyt korrektiv protein-1 (MCP-1) fungerar som den positiva kontrollen för chemotaxis 7.- Montera reagens blandningen genom att kombinera HBSS med 25 mM HEPES, BSA (0,1%) och MCP-1 (75 ng/mL). Använd serum från vuxna nötkreatur (2,7% v / v) med MCP-1 som en extra positiv kontroll.
Obs: Chemokine och chemokine koncentrationen beror på den kemotaktiska axeln under studien. Frystorkade MCP-1 är resuspended i destillerat vatten med BSA (0,1%) att göra en utgångslösning med en slutlig koncentration på 50 μg/mL. Detta kan spädas i vatten till en fungerande lösning på 10 μg/mL. Lägga till 5,6 μL av denna lösning i den nedre kammaren.
- Montera reagens blandningen genom att kombinera HBSS med 25 mM HEPES, BSA (0,1%) och MCP-1 (75 ng/mL). Använd serum från vuxna nötkreatur (2,7% v / v) med MCP-1 som en extra positiv kontroll.
- Använda andra brunnar för jämförelseläkemedlet villkor, alltid upprätthålla den totala volymen i botten kammare på 750 µL.
- Efter sammansättningen av de nedre kamrarna är komplett, placera en porös infoga i varje brunn, se till att flikarna i skäret justera med skårorna på tallriken.
Obs: Välj lämplig porstorlek för skären. Monocyter och lymfocyter presterar en porstorlek på 3 μm bra. Vissa celltyper och/eller chemokine system kan kräva en matris-belagd yta för optimal migration. Exempelvis för att mäta THP-1 monocyt chemotaxis mot MCP-1, rekommenderas Fibronektin eller kollagen-belagda skär. Plattläsare för kvantitering, skäret måste en ljus-impermeant beläggning, såsom polyetentereftalat, att förhindra upptäckt av icke-migrera celler i övre kammare 8.
- Efter inkubation celler för 30 min med calcein-AM, överföra cellsuspension till en 15mL koniska rör. Centrifugera celler vid 1 000 x g i 2 min. okulärbesiktiga celler för att bekräfta upptag av calcein-AM ( figur 1).
- Ta försiktigt bort supernatanten med hjälp av ett vakuum insugningsventil. Tvätta märkta celler i serumfritt RPMI 1640 kompletteras med HEPES 25 mM. Centrifugera celler vid 1 000 x g i 2 min och kasta bort supernatanten.
- Omsuspendera cellerna i serumfritt RPMI 1640 kompletteras med HEPES 25 mM. Räkna celler och justera volymen så att cellerna är med en slutlig koncentration på 1,0-1,5 x 10 6 celler/mL.
- Fördela 250 μL av cellsuspensionen i skäret (övre kammaren).
- Efter alla övre kammare har fyllts, försiktigt lyfta plattan och inspektera undersidan för förekomst av luftbubblor som kan interferera med migration och upptäckt. Ta bort en bubbla, först prova att ta bort sedan omplacering skäret. Om misslyckade, använda en 27 G nål att punktera bubblan och sedan placera om skäret.
- Placera plattan i förväg värmde 37 ° C plattan läsaren.
- Förvärva fluorescens avläsningar från botten 1-3 minuters mellanrum. När du använder calcein-AM anger fluorescensen excitation och utsläpp våglängder på 485 nm och 520 nm, respektive. Beroende på det cell typ chemokine systemet och chemotaxisna uppstår vanligtvis över 1-4 h ( figur 2A).
- Som ett alternativ till kontinuerliga mätningar med hjälp av en tallrik-läsare, bild brunnarna med en inverterad fluorescerande Mikroskop ( figur 2B) kan excitation och detektion av ljus på 485 nm och 520 nm, respektive. Använd en låg förstoring för att fånga merparten av undersidan av skäret. Kvantifiera celler genom att bearbeta bilderna med ImageJ eller liknande programvara 9.
2. Adoptiv överföring av murina lymfocyter
- beredning av donatorcellerna
- Anesthetize 8-12 vecka-gammal C57BL/6J manliga givare möss med isofluran anestesi (1-3%) med en spridare. Bekräfta rätt djup anestesi av tå-nypa.
- Placera musen i ryggläge. Gör en mittlinjen snitt med en skalpell och lokalisera mjälte i övre vänstra peritoneal rymden. Punktskatt hela mjälten och placera i komplett media (RPMI kompletteras med 10% FBS och 25 mM HEPES; 1 mL/mjälte) på is. Euthanize sövda donatordjuren genom halshuggning.
- Mala mjälte vävnad försiktigt genom 40 µm nylon mesh till komplett media (1 mL /spleen) hjälp i slutet av en sprutkolven för att göra en enskild cell fjädring och överföring till en 15 mL koniska rör.
- Lägga till 4 volymer av ammoniumklorid kalium (ACK) lysis buffert och inkubera i 5 min i rumstemperatur att lysera erytrocyter.
- Centrifugera cellerna vid 1 000 x g under 2 minuter vid rumstemperatur och Kassera supernatanten. Om erytrocyter förblir i pelleten, Återsuspendera i ACK lyseringsbuffert, inkubera i 5 minuter i rumstemperatur, Centrifugera celler vid 1 000 x g i 2 min och Kassera supernatanten.
- Resuspendera cellerna i komplett media vid en koncentration på 2-5 x 10 7 celler/mL och sedan Sila cellsuspensionen genom en 40 µm nylon mesh ta bort cellfragment.
- Etikett 1 x 10 7 celler/mottagare mus med ett fluorescerande färgämne som är kompatibel med levande celler och som behålls vid efterföljande fixering, såsom 5-chloromethylfluorescein diacetat (slutlig koncentration 2 μM) 10 . Inkubera vid 37 ° C i 30 min.
Obs: För att spåra mer än en cell befolkningen, använda andra fluorescerande färgämnen med ytterligare cellpopulationer. Exempel en del av donatorcellerna kan märkas med 5-(and-6)-(((4-chloromethyl) bensoylperoxid) amino) tetrametylrodamin (slutlig koncentration 2 μM) 11. - Lägga till 4 volymer HBSS kompletteras med 25 mM HEPES, sedan Centrifugera vid 1 000 x g under 2 min och Kassera supernatanten. Återsuspendera pelleten i HBSS kompletteras med HEPES 25 mM till en slutlig koncentration på 1 x 10 8 celler/mL.
- Om du använder mer än ett fluorescerande färgämne, hålla cellpopulationer separerade förrän omedelbart före injektion.
- Överför en liten alikvot (10 μL) av celler av varje färg för ett fixativ-lösning (1 mL) för efterföljande flödesberäkning flödescytometri.
- Överföring av lymfocyter
- söva 8-12 vecka-gammal C57BL/6J manliga mottagaren möss med isofluran (1-3%) med en spridare, bekräfta djup anestesi av tå-nypa. Gäller veterinärmedicinska salva för djur ' s ögon att förhindra torkning.
- Kort vortex donatorcellerna (1 s) och överföring till 1 mL injektionsspruta med 27 G, 0,5 i nålen, kombinera differentially märkt cellpopulationer, om tillämpligt.
- Överför en liten alikvot (10 μL) av blandade celler till en fixativ lösning (1 mL) för efterföljande flödesanalyser flödescytometri.
- Placera donatordjuren i liggande position. Applicera milt kaudala Tryck rygg till ögat, orsakar ögongloben att sticka ut lite.
- Rikta nålen medialt och injicera 100 µL donator cellsuspension retro-orbitally i varje mottagande mus. Cellerna kan också injiceras via svans venen.
- Gradvis dra tillbaka injektionsnålen och Placera musen ensam i en återhämtning bur. Övervaka djur tills det har återfått medvetandet; en gång fullt återställda tillbaka djuret till subventionerat.
- Insamling och analys av
- efter 1 h, söva mottagarens möss med isofluran anestesi (1-3%) med en spridare; bekräfta djup anestesi av tå-nypa. Skörda mjälte (eller annan vävnad av intresse) (steg 2.1.2.) från varje mottagare mus och placera in komplett media (1 mL/mottagare). Euthanize sövda djur genom halshuggning.
Obs: Längre intervall före vävnad skörden kommer att öka vävnad ackumulering genom minst 24 h. - Mala mjälte vävnad försiktigt genom 40 µm nylon mesh till komplett media hjälp i slutet av en sprutkolven för att göra en enskild cell fjädring och överföring till 15 mL koniska tube.
- Lägga till 4 volymer av ACK lysis buffert och inkubera 5 min i rumstemperatur. Centrifugera cellsuspension vid 1 000 x g under 2 minuter vid rumstemperatur och Kassera supernatanten.
- Omsuspendera cellerna i färgning buffert (fosfatbuffrad saltlösning kompletteras med 1% FBS). Räkna celler och justera till en slutlig koncentration på 3 x 10 7 celler/mL. Överför 100 µL cellsuspension till en 96-väl rund bottenplatta.
- Fläcken celler för önskad markörer (se tabell av material) för analys av flödescytometri. Lägg till fluorophore-konjugerade antikroppar (se tabell av material) mot önskade markörer och inkubera vid 4 ° C i 20 min i mörker. Tillsätt 100 µL färgning buffert, Centrifugera celler vid 1 000 x g i 3 min och kasta bort supernatanten.
- Återsuspendera pelleten i 200 µL färgning buffert, Centrifugera celler vid 1 000 x g i 3 min och kasta bort supernatanten.
- Återsuspendera pelleten i 125 µL färgning buffert och förvärva prover med hjälp av en flödescytometer med hjälp av standardprocedurer.
Obs: Det gröna färgämnet är upphetsad av 488 nm laser och utsläpp upptäcks med 505 och 530/30 kantfilter. Den orange färgen är upphetsad av en 561 nm och utsläppen upptäcks av ett 582/15 dikroiskt filter.- Använd Sparad celler från 2.1.8.2 att kompensera för varje fluorescerande färgämne.
Obs: Använder pärla-baserad ersättning med fluorophores matcha excitation och utsläpp spectra av märkning färgerna kommer att leda till suboptimal ersättning. - Använda de sparade indataceller från steg 2.2.2.1 att noggrant bestämma förhållandet mellan differentially märkt indataceller om du använder mer än en märkt befolkningen ( figur 3). Beräkna vävnad specifik migration baserat på kvoten av märkt omärkt celler ( figur 4).
- Använd Sparad celler från 2.1.8.2 att kompensera för varje fluorescerande färgämne.
- efter 1 h, söva mottagarens möss med isofluran anestesi (1-3%) med en spridare; bekräfta djup anestesi av tå-nypa. Skörda mjälte (eller annan vävnad av intresse) (steg 2.1.2.) från varje mottagare mus och placera in komplett media (1 mL/mottagare). Euthanize sövda djur genom halshuggning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
När du använder calcein-AM färgämne, kommer att visuell inspektion av celler bekräfta etikett upptag (figur 1). Automatiserad fluorescerande avläsningar kommer spåra migration som celler transitering på undersidan av insatsen över tid. Dessa uppgifter visar tydligt en induktion av cellmigration mot MCP-1, samt en förstärkning av detta svar av serum (figur 2A). Beroende på styrkan i den flyttande stimulansen, finns det en eftersläpning av minst 15 min före en ökning av signal. Fluorescerande signalen kan topp och sedan gradvis sjunka. Detta motsvarar en minskning av antalet celler som ansluter sig till undersidan av skäret som celler passera in lösningen i den lägsta kammaren i en takt snabbare än celler migrerar från den övre kammaren. Starkare flyttande stimuli vanligtvis resulterar i en) tidigare debut av en ökning av fluorescens värden; (b) snabbare ökning av fluorescens; och c) högre toppvärden fluorescens. Representativa bilder förvärvats av inverterad fluorescensmikroskopi visas också (figur 2B), med kvantifiering av blodbilden (figur 2 c).
För in-vivo studier utnyttjar mer än en fluorescerande etikett, är det viktigt att kvantifiera den relativa andelen cellpopulationer av ingående material. Detta står för variansen i blandande cellpopulationer injektionsvätska (figur 3). I detta fall var förhållandet mellan grönt och orange-fluorescerande celler 0.97:1. Således, för att beakta denna liten obalans, grön fluorescerande blodkroppar delades med 0,97 att indexera deras nummer i proportion till det ingående materialet. Efter kvantifiera märkta celler av flödescytometri, kan människohandel kvantifieras som antalet märkta celler återvinns dividerat med det totala antalet celler som återvinns.
Dessa resultat visar fördelen med tvåfärgad strategin, vilket eliminerar effekten av varierande injektion effekt; medan det finns betydande avvikelse av återvunna celler mellan djur, för något visst djur förhållandet mellan grön-lysrör till orange fluorescerande celler är ungefär lika (figur 4). Dessa resultat som förväntas, som cellen två populationer behandlades identiskt, men olika störningar kan testas för sin effekt på lymfocyter homing. Avvikelse från raden av identitet skulle tyda olika flyttande förmåga för de specifika cellpopulationer. Dessutom kan flera cell delmängder bestämmas genom färgning återvunna cellerna för de önska proteinerna. Här, återvinns T-celler, indikeras av CD3 färgning, och B-celler, indikeras av CD19 färgning också med lika proportioner av grönt till orange-fluorescerande celler.
Figur 1: Cell märkning. Okulärbesiktning av cellpelleten efter märkning bekräftar adekvat upptag av den fluorescerande färgämne (vänster), i kontrast till före märkning (höger). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Kvantifiering av in vitro- Migration. (A) representativa uppgifter (medelvärde ± medelfel) förvärvade i realtid från en Plattläsare jämföra 3 villkor: media (kontroll), chemokine (MCP-1, 75 ng/mL) eller chemokine med serum (MCP-1, 75 ng/mL och bovint serum, 2,7% v/v i buffert). Avläsningar förvärvades från undersidan av plattan var 3 min med en magnetisering våglängd av 485 nm och upptäckt våglängd av 520 nm. (B) representativa micrographs på 4 X förstoring på undersidan av insatsen på 1 h, som tillåter direkt visualisering av migrera celler. Skala barer = 500 µm (gul). (C) kvantifiering av cell nummer per låg-drivna fält (LPF; 4 X) använder ImageJ programvara. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: målat indataceller. Flöde flödescytometri tomt visar förhållandet mellan två differentially målat cellpopulationer i injicerade cell input från steg 2.2.2.1. Förhållandet bestäms från här tomt serverar att korrigera för varians som infördes under första blandning av de två befolkningarna och används för att justera blodkroppar under nedströms dataanalys. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: förhållandet mellan märkt cellerna återhämtat sig från mjälte av mottagarens djur. Proportionerna av grönt fluorescerande eller orange fluorescerande celler presenteras som en procentandel av den totala återvunna splenocytes, med varje datapunkt som representerar ett enda mottagare djur. Den totala märkt celler är visad (triangeln), as well as delmängder som också färgas positivt för de cellen ytmarkörer CD19 (torg) eller CD3 (cirkel). Streckad linje är raden av identitet där förhållandet mellan färger är lika med 1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kvantifiering av immunceller migration kan åstadkommas med hjälp av enkla och snabba analyser både in vitro och in-vivo. Vi visar i vitro chemotaxisna av humana monocyter som svar på en MCP-1 lutning och bröstförstoring genom serum. In vivo, givare murina splenocytes var differentially märkt och efter överföring, återvanns från mottagarens djur.
Med hjälp av en tallrik-läsare har fördelen av provtagning flera tidpunkter (så ofta som varje 30 s) och automatisera kvantitering av migrera celler. Detta undanröjer behovet av att välja en enda tidpunkt för utvärdering och undvika mer arbetsintensiva metoder för manuell räkning av enskilda brunnar. Metoden ger dessutom mer dynamisk information än kan samlas in av mikroskopi. Under analysen måste det hållas i åtanke att celler kommer att falla utanför skäret i botten kammare och bidrar inte till fluorescensintensiteten. Således blir antalet celler på undersidan av skäret, som indikeras av relativa fluorescens, en funktion av graden av migration och andelen som celler falla av skäret.
Större celler kan kräva ett skär med större porer, och 8 μm porösa skär finns. Mindre celler (inklusive infödda lymfocyter) kanske inte är tillräckligt ljust för att upptäckas av en fluorimeter och kan kräva utvärdering av mikroskopi, särskilt för små förändringar i Kemotaxis. Vissa celltyper kan passera snabbt in i den nedersta kammaren lösningen och inte har en tillräckligt lång uppehållstid på skäret att detekteras, vilket resulterar i en tillplattad kurva. I det här fallet celler kan kvantifieras av flödescytometri direkt från den lägsta kammaren lösningen, eller ett matrix-belagda skär kan användas för att förlänga transittid förutom att använda ett skär med mindre porer (t.ex. 1 μm).
Kritisk till dessa analyser är identifiering av robust flyttande villkor. Den celltyp som studerade måste kunna svara på en korrektiv för in vitro- studier, och nödvändiga co-faktorer måste beaktas. Optimering kan krävas för cell densiteten infördes i den övre kammaren. I allmänhet en högre densitet kommer att resultera i en starkare signal, men detta måste vägas mot en högre icke-specifik migration-signal. Prövar en rad korrektiv koncentrationer kan också hjälpa till att identifiera en lämplig tidsmässiga fönster för att fånga migration.
Denna metod skulle också kunna anpassas till använda flera färger. Detta skulle möjligen minska variabiliteten, samt öka antalet villkor som kan inkluderas i en enda analys. Det främsta övervägandet här är ljusstyrkan på de fluorescerande färgerna. Calcein-AM är mycket ljus och därför enkelt detekteras av både mikroskopet och plate reader program. Färgämnena som används för in-vivo studier upptäcktes inte lätt av mikroskopi och producerade hög bakgrund; Detta skulle förmodligen också hindra korrekt plattan läsare upptäckt.
För in-vivo studier är donatorcellerna hälsa viktigt att bevara deras flyttande funktion. Skörden av donatorcellerna bör göras som en del av icke-survival kirurgi, snarare än att offra donatordjuret och sedan skörda celler, vilket ökar sannolikheten för ischemi och celldöd. Tiden mellan injektion och skörd är en viktig faktor för experiment där olika cellpopulationer används; divergens eller likheten mellan cellpopulationer kan förändras över tid. Behandlingstiden efter skörd från givaren tills injektion i mottagaren bör minimeras. Även är givare/mottagare kompatibilitet också kritisk. Mänskliga celler kommer att snabbt avvisas av möss, även inom arten allogena celler är tolereras väl under korta tidsperioder. Till exempel, vi inte hittar en skillnad i Migrera celler med C57BL/6J eller BALB/cJ givare används med C57BL/6J mottagare under en period på 1 h.
Detta in-vivo -metoden är användbar för att bedöma skillnader i flyttande anlagen. Både indata celler och mottagarens djur kan bli föremål för farmakologisk eller andra störningar. Likaså kan mottagaren djur utsättas för infektiösa och inflammatoriska stimuli eller andra behandlingar som påverkar lymfocyter människohandel12. Detta protokoll kan också kopplas lätt till transgena möss rader. I synnerhet de som uttrycker fluorescerande proteiner skulle undanröja behovet av märkning och kan potentiera multiplexering strategier.
Det är viktigt att notera att tiden där olika cellpopulationer blandas före injektion bör minskas så mycket som möjligt. Differentially märkt cellpopulationer ska blandas först efter mottagarens djuren har varit helt sövd och är redo för injektion. Färgämnena som är närvarande i de olika populationerna kan blanda, vilket resulterar i oklara separation mellan två när analyseras med flödescytometri. Dessutom kan behandlas olika villkor påverka obehandlad cellerna under denna tid. Till exempel överföras agenter som binda till cellytan på obehandlade cellerna, därmed confounding resultat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Bernard L. Schwartz programmet för läkare forskare vid Rockefeller University, Robertson terapeutiska utvecklingsfonden på Rockefeller University och Sackler Center för biomedicin och Nutrition forskning på den Rockefeller University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875-093 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630-080 | |
| Fetal Bovine Serum | ATCC | 30-2020 | |
| Cell culture flask | Corning | 353136 | |
| Calcein AM | Thermo Fisher Scientific | C1430 | Excitation: 485nm, Emission: 520nm |
| Cell culture dish | Corning | 1007 | |
| 24 well plate | Corning | 353504 | |
| Fluoroblok Fibronectin Insert | Corning | CB354597 | |
| 15 mL conical tube | Corning | 352097 | |
| Bovine Serum Albumin | Cell Signaling Technology | 9998S | |
| Human Recombinant MCP-1 | Peprotech | 300-04 | |
| Adult bovine Serum | Sigma | B9433 | |
| HBSS with calcium and magnesium; no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
| SpectraMax M2e plate reader | Molecular Devices | ||
| Olympus IX71 inverted fluorescence microscope | Olympus | ||
| Isothesia | Henry Schein animal health | 11695-6776-2 | Isofluorane anesthesia |
| Cell strainer 40um nylon | Falcon Corning | 352340 | |
| ACK lysing buffer | Quality Biological | 118-156-101 | |
| CellTracker Orange CMTMR Dye | Thermo Fisher Scientific | C2927 | Excitation: 541nm, Emission: 565nm |
| CellTracker Green CMFDA Dye | Thermo Fisher Scientific | C2925 | Excitation: 485nm, Emission: 520nm |
| 5ml syringe | BD Syringe | 309646 | |
| 1ml TB syringe | BD Syringe | 309625 | |
| THP-1 cell line | ATCC | TIB-202 | |
| Brilliant Violet 421 anti-mouse CD3 Antibody | Biolegend | 100228 | Excitation: 405nm, Emission: 421nm |
| Brilliant Violet 605 anti-mouse CD19 Antibody | Biolegend | 115540 | Excitation: 405nm, Emission: 603nm |
| 96-well round bottom plate | Corning | 353077 | |
| LSRII | BD Biosciences | Flow cytometer |
References
- Griffith, J. W., Sokol, C. L., Luster, A. D. Chemokines and chemokine receptors: positioning cells for host defense and immunity. Annu Rev Immunol. 32, 659-702 (2014).
- Springer, T. A. Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm. Cell. 76 (2), 301-314 (1994).
- Ponda, M. P., Breslow, J. L. Serum stimulation of CCR7 chemotaxis due to coagulation factor XIIa-dependent production of high-molecular-weight kininogen domain 5. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (45), E7059-E7068 (2016).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J Exp Med. 115, 453-466 (1962).
- Chen, H. C. Boyden chamber assay. Methods Mol Biol. 294, 15-22 (2005).
- Tsuchiya, S., Yamabe, M., Yamaguchi, Y., Kobayashi, Y., Konno, T., Tada, K. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). Int J Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).
- Leonard, E. J., Yoshimura, T. Human monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1). Immunol Today. 11 (3), 97-101 (1990).
- Crouch, M. F. An automated fluorescence based assay of neurite formation. J Neurosci Methods. 104 (1), 87-91 (2000).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Poot, M., Kavanagh, T. J., Kang, H. C., Haugland, R. P., Rabinovitch, P. S. Flow cytometric analysis of cell cycle-dependent changes in cell thiol level by combining a new laser dye with Hoechst 33342. Cytometry. 12 (2), 184-187 (1991).
- West, C. A., He, C., Su, M., Swanson, S. J., Mentzer, S. J. Aldehyde fixation of thiol-reactive fluorescent cytoplasmic probes for tracking cell migration. J Histochem Cytochem. 49 (4), 511-518 (2001).
- Kim, C. H. The greater chemotactic network for lymphocyte trafficking: chemokines and beyond. Curr Opin Hematol. 12 (4), 298-304 (2005).
