Kvantifiera mänskliga monocyt Chemotaxis In Vitro och murina lymfocyter Trafficking In Vivo
Summary
Protokoll för kvantitativ bedömning av lymfocyter Kemotaxis och migration är viktiga verktyg för immunologi forskning. Här beskrivs ett in vitro- protokoll att tillstånd i realtid, multiplexed utvärdering av cellmigration, samt en kompletterande in-vivo teknik möjliggör spårning av infödda celler till mjälten.
Abstract
Chemotaxis är migration längs en specifik kemisk toning1. Chemokiner är kemotaktisk cytokiner som främjar cellulära människohandel med anatomisk och tidsmässig specificitet2. Chemotaxis är en kritisk funktion av lymfocyter och andra immunceller som kan vara kvantitativt bedömas in vitro. Detta manuskript beskriver metoder som möjliggör utvärdering av Kemotaxis, både in vitro- och in-vivo, för olika celltyper inklusive cellinjer och infödda celler. I in vitro-plattan-baserat format tillåter jämförelse av flera villkor samtidigt i realtid, och kan slutföras inom 1-4 h. In vitro assay villkor kan manipuleras för att införa agonister och antagonister, som liksom differentiera chemotaxisna från makt, som är slumpmässig rörelse. För in-vivo människohandel bedömningar, kan immunceller vara märkt med flera fluorescerande färgämnen och används för överföring. Differentiell märkning av celler möjliggör blandad cellpopulationer införs till samma djur, därmed minska variansen och minska antalet djur som krävs för ett adekvat powered experiment. Migration i lymfoid vävnad uppstår i så lite som 1 h, och flera vävnad fack kan avsmakas. Flödescytometri efter vävnad skörd möjliggör en snabb och kvantitativ analys av de flyttande mönster av flera celltyper.
Introduction
Robust immunitet kräver komplexa tidsmässiga och rumsliga samordning av en myriad av celltyper för att svara skada, infektion och generera self-tolerance. Flera dussin chemokine receptorer och deras motsvarande ligander har upptäckts och kännetecknas som tillhandahåller molekylära mekanismer genom vilka specifika celler kan riktas till en specifik vävnad vid en viss tidpunkt. Således är att studera Kemotaxis och migration en oumbärlig komponent av immunologi forskning. Faktiskt användes nyligen beskrivna in vitro- analysen som en screeningmetod för att identifiera en kemotaktisk kofaktor som accelererar chemotaxis av T-celler mot C-C chemokiner 19 och 213. Syftet med metoderna som beskrivs här är att möjliggöra kvantitativa bedömningar av immunceller chemotaxis in vitro- och in vivo.
Boyden (cellmigration och invasion) kammare analysen är en billig, reproducerbar och snabb metod för bedömning av cell migration4,5. I standard-analysen, den övre kammaren är seedade med celler, och är åtskilda av en porös Infoga från en nedre kammare, där cellerna migrerar. Vid önskad tid, kan celler som har migrerat till undersidan av skäret fastställas och färgas för kvantitering av ljusmikroskop. Men sådana mätningar begränsa datainsamling till en enda slutpunkt, som utesluter dynamiska datainsamling och kan kräva omfattande optimering för att bestämma den optimala tidpunkten för analys. Här beskrivs flera anpassningar som tillåter och multiplexering i realtid, kvantitativa mätningar av chemotaxisna i vitro.
För in-vivo studier, används en funktionell slutpunkt, nämligen den särskilda ansamlingen av celler i viss vävnad kupé. Pre märkt donatorcellerna införs i mottagarens djur genom överföring. Dessa givare celler kan därefter identifieras genom flödescytometri efter mottagarens vävnad skörd. Presenterade också är en samtidig märkning strategi som möjliggör bestämning av människohandel av olika celltyper inom ett enda mottagare djur. Denna metod eliminerar mellan djura variationen från cell injektionen, och står för fysiologiska variabilitet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kvantifiering av immunceller migration kan åstadkommas med hjälp av enkla och snabba analyser både in vitro och in-vivo. Vi visar i vitro chemotaxisna av humana monocyter som svar på en MCP-1 lutning och bröstförstoring genom serum. In vivo, givare murina splenocytes var differentially märkt och efter överföring, återvanns från mottagarens djur.
Med hjälp av en tallrik-läsare har fördelen av provtagning flera tidpunkter (så ofta som varje 30 s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av Bernard L. Schwartz programmet för läkare forskare vid Rockefeller University, Robertson terapeutiska utvecklingsfonden på Rockefeller University och Sackler Center för biomedicin och Nutrition forskning på den Rockefeller University.
Materials
| RPMI-1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875-093 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630-080 | |
| Fetal Bovine Serum | ATCC | 30-2020 | |
| Cell culture flask | Corning | 353136 | |
| Calcein AM | Thermo Fisher Scientific | C1430 | Excitation: 485nm, Emission: 520nm |
| Cell culture dish | Corning | 1007 | |
| 24 well plate | Corning | 353504 | |
| Fluoroblok Fibronectin Insert | Corning | CB354597 | |
| 15 mL conical tube | Corning | 352097 | |
| Bovine Serum Albumin | Cell Signaling Technology | 9998S | |
| Human Recombinant MCP-1 | Peprotech | 300-04 | |
| Adult bovine Serum | Sigma | B9433 | |
| HBSS with calcium and magnesium; no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
| SpectraMax M2e plate reader | Molecular Devices | ||
| Olympus IX71 inverted fluorescence microscope | Olympus | ||
| Isothesia | Henry Schein animal health | 11695-6776-2 | Isofluorane anesthesia |
| Cell strainer 40um nylon | Falcon Corning | 352340 | |
| ACK lysing buffer | Quality Biological | 118-156-101 | |
| CellTracker Orange CMTMR Dye | Thermo Fisher Scientific | C2927 | Excitation: 541nm, Emission: 565nm |
| CellTracker Green CMFDA Dye | Thermo Fisher Scientific | C2925 | Excitation: 485nm, Emission: 520nm |
| 5ml syringe | BD Syringe | 309646 | |
| 1ml TB syringe | BD Syringe | 309625 | |
| THP-1 cell line | ATCC | TIB-202 | |
| Brilliant Violet 421 anti-mouse CD3 Antibody | Biolegend | 100228 | Excitation: 405nm, Emission: 421nm |
| Brilliant Violet 605 anti-mouse CD19 Antibody | Biolegend | 115540 | Excitation: 405nm, Emission: 603nm |
| 96-well round bottom plate | Corning | 353077 | |
| LSRII | BD Biosciences | Flow cytometer |
References
- Griffith, J. W., Sokol, C. L., Luster, A. D. Chemokines and chemokine receptors: positioning cells for host defense and immunity. Annu Rev Immunol. 32, 659-702 (2014).
- Springer, T. A. Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm. Cell. 76 (2), 301-314 (1994).
- Ponda, M. P., Breslow, J. L. Serum stimulation of CCR7 chemotaxis due to coagulation factor XIIa-dependent production of high-molecular-weight kininogen domain 5. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (45), E7059-E7068 (2016).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J Exp Med. 115, 453-466 (1962).
- Chen, H. C. Boyden chamber assay. Methods Mol Biol. 294, 15-22 (2005).
- Tsuchiya, S., Yamabe, M., Yamaguchi, Y., Kobayashi, Y., Konno, T., Tada, K. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). Int J Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).
- Leonard, E. J., Yoshimura, T. Human monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1). Immunol Today. 11 (3), 97-101 (1990).
- Crouch, M. F. An automated fluorescence based assay of neurite formation. J Neurosci Methods. 104 (1), 87-91 (2000).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Poot, M., Kavanagh, T. J., Kang, H. C., Haugland, R. P., Rabinovitch, P. S. Flow cytometric analysis of cell cycle-dependent changes in cell thiol level by combining a new laser dye with Hoechst 33342. Cytometry. 12 (2), 184-187 (1991).
- West, C. A., He, C., Su, M., Swanson, S. J., Mentzer, S. J. Aldehyde fixation of thiol-reactive fluorescent cytoplasmic probes for tracking cell migration. J Histochem Cytochem. 49 (4), 511-518 (2001).
- Kim, C. H. The greater chemotactic network for lymphocyte trafficking: chemokines and beyond. Curr Opin Hematol. 12 (4), 298-304 (2005).
