Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Expressie van exogene antigenen in de Mycobacterium bovis -BCG-vaccin via niet-genetische oppervlak decoratie met het systeem Avidin-Biotine

Published: January 31, 2018 doi: 10.3791/56421
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1Division of Infectious Diseases, Department of Medicine and Vancouver Costal Health Research Institute, University of British Columbia, 2Institute of Biomedical Technology, University of Tampere

Summary

Een nieuwe techniek voor snelle antigeen weergave op een bacteriële oppervlak wordt gepresenteerd, waarbij het oppervlak biotinylation gevolgd door blootstelling aan proteïnen van belang in fusie met monomere avidin. Laden van BCG met geselecteerde antigenen met succes verbetert de immunogeniciteit, suggereren dat oppervlakte decoratie traditionele genetische benaderingen kan vervangen.

Abstract

Tuberculose (TB) is een ernstige besmettelijke ziekte en de enige beschikbare vaccin M. bovis bacillus Calmette-Guérin (BCG) is veilig en effectief voor de bescherming tegen kinderen ernstige TB meningitis en sommige vormen van gedissemineerde TB, maar er niet in slaagt om te beschermen tegen pulmonaire TB, die de meest voorkomende vorm van de ziekte is. Veelbelovende strategieën ter verbetering van BCG momenteel rekenen op haar transformatie met genen coderend voor immunodominante M. tuberculosis (Mtb)-specifieke antigenen en/of complementeren met genen coderend voor cofactoren die antigeen zou stimuleren presentatie van cellen. Belangrijke beperkingen van deze benaderingen zijn lage efficiëntie, lage stabiliteit en het onzekere veiligheidsniveau van expressievectoren. In deze studie presenteren wij een alternatieve aanpak van vaccin verbetering, die bestaat uit BCG complementeren met exogene proteïnen van belang op het oppervlak van bacteriën, in plaats van transformatie met plasmiden codering van de bijbehorende genen. Eerst, eiwitten van belang worden uitgedrukt in fusie met monomere avidin in standaard E. coli expressiesystemen en vervolgens gebruikt voor het decoreren van het oppervlak van biotinyleerd BCG. Dierproeven met behulp van BCG oppervlak versierd met surrogaat ovoalbumine antigeen aantonen dat het gewijzigde bacterie is volledig immunogeen en specifieke T cel reacties teweeg kunnen. Over het geheel genomen ondersteunen de hier gepresenteerde sterk gegevens een roman en efficiënte methode voor het omvormen van de huidige BCG-vaccin dat de moeizame conventionele benadering van complementatie vervangen door exogene nucleïnezuren.

Introduction

Diverse strategieën zijn voorgesteld ter vervanging van het huidige TB-vaccin BCG, met inbegrip van eiwit adjuvans systemen, virale vectored technologieën, verzwakte levende stammen van de M.tb en genetisch gemodificeerde stammen van de BCG, ofwel invoering van genen over het uitdrukken van BCG-antigenen die niet voldoende blijk tijdens de infectie1 of Mtb gegeven-specifieke antigenen niet aanwezig in de BCG2. Genetische manipulatie, echter geconfronteerd met vele belemmeringen met inbegrip van de onzekere niveau van veiligheid, het tijdrovende proces en het lage rendement van4,5van de vectoren van de expressie. Met betrekking tot de verbetering van de BCG, is een alternatieve aanpak nodig ter verbetering van de immunogeniciteit zonder de noodzaak voor onzekere genetische afwisseling.

In deze studie introduceren wij een nieuwe strategie voor de weergave van recombinante eiwitten van de rente over het celoppervlak BCG, dat is gebaseerd op de interactie van de bekende avidin van hoge-affiniteit met biotine. Deze benadering biedt snelle en reproduceerbare gehechtheid van recombinante avidin fusion eiwitten op het oppervlak van biotinyleerd BCG, dat brede manipulaties van BCG vergemakkelijkt op een maximale verbetering van zijn werkzaamheid met behoud van haar uitstekende veiligheid opnemen, die gedurende tientallen jaren van gebruik.

Avidin affiniteit voor Biotine is extreem hoog (K,d = 1015 M) en eenmaal gevormd, het Biotine-avidin-complex is zeer stabiel en slechts onder voorwaarden6denaturering kan worden verstoord. Echter, voor dit soort interactie om te dienen als een gen alternatief voor de methode van de overdracht, op lange termijn maar omkeerbare weergave van recombinante eiwitten is vereist. Zo introduceerden we hier een lage affiniteit monomeer avidin (K,d = 10−7 M) dat leidt tot de omkeerbare release van eiwit van het oppervlak versierd BCG eenmaal ingenomen binnen antigeen presentatie van cellen. We getest om te voorzien van een proof of concept, deze methode met behulp van een monomeer avidin chimeer eiwit overeenkomt met een surrogaat-antigeen afgeleid van ovoalbumine (OVA)7,8. De resultaten toonden aan dat het celoppervlak BCG kan gemakkelijk en snel met worden verfraaid monomere avidin fusion eiwitten en dat deze binding aan de oppervlakte van de BCG stabiel en reproduceerbare zonder waarneembare veranderingen in de bacteriële groei en overleving is. Ook vonden we dat BCG versierd met monomere avidin gefuseerd met eicellen (AviOVA) kan veroorzaken een immuunrespons die vergelijkbaar is met die geïnduceerd door BCG genetisch uiting te geven aan het zelfde antigeen zowel in vitro als in vivo. Deze technologie van omkeerbare display van eiwitten van de rente over het bacteriële oppervlak is daarom een doeltreffende vervanging van traditionele gene transfer benaderingen en kan een platform bieden voor brede manipulaties van BCG en verdere toepassingen in vaccin ontwikkeling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dieren werden onderhouden overeenkomstig de protocollen die zijn goedgekeurd door de Animal Care en gebruik commissies aan de University of British Columbia. Experimenten werden goedgekeurd door de Animal Care en gebruik commissies en uitgevoerd volgens de Canadese Raad op Animal Care Guidelines. Het dierlijke verzekering welzijn nummer is A11-0247.

1. generatie van monomere Avidin Fusion eiwitten uiting van plasmiden

  1. Sub kloon monomere avidin reeks12 in pDEST17 plasmide tussen de "CTC" en "GAA" sites die correspondeert met 133-134bp. (dat wil zeggen, tussen de 6-histag en de pDEST17 Attr1 recombinatie site) te verkrijgen p17-Avi.
    Opmerking: De monomeer avidin DNA-sequentie is hieronder weergegeven. De drie mutaties in wild-type Avidin om de monomeer avidin geïntroduceerd worden in vette letters weergegeven.
    gccagaaagtgctcg ctgactggga aatggaccaa cgatctgggc tccATCatga ccatcggggc tgtgaacagc
    agaggtgaat tcacaggcac ctacatcaca gccgtaacag ccacatcaaa tgagatcaaa gagtcaccac tgcatgggac
    OOAGCTacc atcaacaaga ggacccagcc cacctttggc ttcaccgtca attggaagtt ttcagagtcc accactgtct
    tcacgggcca gtgcttcata gacaggaatg ggaaggaggt cctgaagacc atgtggctgc tgcggtcaag tgttaatgac
    attggtgatg acAAAaaagc taccagggtc ggcatcaaca tcttcactcg cctgcgcaca cagaaggagt ga
  2. Inleidingen geflankeerd met AttB1 en B2 Attsites die overeenkomt met de eicellen polypeptide757-1035 ontwerpen (ik-A-b- en H-2_Kb-beperkt epitopes) opeenvolging van DNA. Primer sequenties zijn: Attb1-eicellen
    GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCCTTGAGCAGCTTGAGAGTAT en Attb2-eicellen
    GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGTTACCCTACCACCTCTCTGC. (Attb1 en b2-sequenties van Attzijn vet).
    1. PCR-versterken eicellen polypeptide757-1035 DNA-sequentie met de inleidingen boven het pUC57-eicellen plasmide als sjabloon gebruiken.
    2. Het klonen van de PCR producten in pDONR-221 door een sitespecifieke in vitro recombinatie reactie (b.v., BP Clonase) pDONR-eicellen te verkrijgen.
  3. Breng het gen van belang in p17-Avi met behulp van de reactie van LR Clonase p17-Avi-eicellen te verkrijgen.
    Opmerking: Voor details van BP en LR recombinatie klonen, zie de handleiding van de fabrikant.

2. de monomeer Avidin Fusion eiwit expressie, zuivering en uiteinde

  1. Transformeren p17-Avi-eicellen plasmide in E. coli BL21 en veroorzaken 250 mL van E. coli cultuur van de BL21 met IPTG (0,1 M) gedurende 3 uur bij 37 ° C.
  2. Lysis van bacteriën en integratie instanties solubilisatie
    1. De 250 mL van geïnduceerde BL21 cultuur pellet door 30 min van centrifugeren op 4.000 x g en bij 4 ° C.
    2. Verzamelen van pellets in 10 mL lysisbuffermengsel (50 mM Tris-HCL, 150 mM NaCl, 6 M Guanidine-HCL, pH 1,5-2,5) en incubeer gedurende 15 min bij 95 ° C. Na een nacht bebroeden bij kamertemperatuur op een rotator.
    3. Centrifuge 30 min op 15.000 x g en 4 ° C en verzamelen supernatant.
  3. Zuiveren van Avi-eicellen van Supernatant (ontbindend opneming organen Fractie) met Ni-NTA kolommen.
    1. Verdun opneming organen 1:2 met lysis-buffermengsel.
    2. Gebruik 4 mL Ni-NTA hars per 250 mL cultuur afkomstige integratie-organen.
    3. 3 x met 10 mL lysisbuffermengsel (pH 7.0) wassen.
    4. Elueer met 10 mL elutie buffer (lysis buffer pH 7.0 met 250 mM imidazol).
  4. Refold geëlueerd eiwit door geleidelijke verdunning (1:10) en snelle vortexing in Tris buffer (pH 7.5) met 1 mM DTT, 200 mM NDSB256 (3-(Benzyldimethylammonio)propanesulfonate), 0,5 mM, Tween 80, arginine 500 mM en 200 mM NaCl gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
  5. -Zout en buffer uitwisseling refolded eiwit uit Tris buffer in PBS met eiwit concentrators volgens de protocollen van de fabrikant.
  6. Verwijderen van aggregaten door centrifugeren gedurende 30 minuten bij 3500 x g en bij 4 ° C, en op te slaan aliquots oplosbaar eiwit bij-20 ° C.

3. Biotinylation van BCG celoppervlak

  1. Groeien van BCG in Middlebrook 7H 9 bouillon met 10% OADC (oliezuur, albumine en dextrose oplossing) en 0.05% Tween 80 bij 37 ° C op een shaker platform op 50 rpm tot OD = 0,5-1.
    Opmerking: BCG is een ziekteverwekker van bioveiligheid niveau 2 en alle experimenten betreffende BCG moeten gebeuren in een kabinet met de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen bioveiligheid.
  2. Wassen 109 BCG 3 keer met 500 µL ijskoude endotoxine gratis PBS plus 0,1% Tween80 (PBST) (pH 8.0). Schorten BCG pellet in steriele endotoxine gratis PBS.
  3. Onmiddellijk vóór gebruik, bereiden 1 mL 10 mM Sulfo-NHS SS Biotine in steriele gefilterd water.
    1. Incubeer bacteriën met 1 mL 0,5 mM van Sulfo-NHS SS Biotine bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
  4. Wassen gelabelde bacteriën 3 keer met 500 µL van iced koude PBST verwijderen niet hebben gereageerd biotinylation reagens.
    1. Resuspendeer de pellet in 1 mL PBST.
  5. Om te beoordelen biotinylation efficiëntie, vlek 108 biotinyleerd BCG met daar-FITC (1:100, 25 µL) bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten.
    1. Incubeer gebeitst bacteriën in 1 mL 2% PFA gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur en vervolgens niveaus van biotinylation te onderzoeken door stroom cytometry analyse.

4. fenotype van biotinyleerd Mycobacteria: groei en overleving

  1. Groeien van BCG stammen in Middlebrook 7H 9 bouillon met 10% OADC (oliezuur, albumine en dextrose oplossing) en 0.05% Tween 80 bij 37 ° C op een shaker platform op 50 rpm.
    1. De optische dichtheid (OD600) van de bacteriecultuur opnemen over een periode van 8 dagen.
  2. Gebruiken BCG-Luc (eerder beschreven9) voor het detecteren van bacteriën overleven in macrofagen.
    1. RAW264.7 cellen met biotinyleerd BCG-Luc (MOI 10:1) infecteren of onbehandeld BCG-Luc (control) en geïncubeerd bij 37 ° C gedurende een 48u periode.
    2. Cel monolayers wassen en vervolgens lyse met 0,025% SDS om ingenomen bacteriën vrij te geven.
    3. Maatregel bioluminescentie productie met Luciferase assay systeem en luminometer.
      Opmerking: Luminescentie signaal is kenmerkend voor bacteriële levensvatbaarheid. Raadpleeg de handleiding van de fabrikant voor meer informatie over luciferase assay.

5. de binding van de monomeer Avidin-fusieproteïne te biotinyleerd BCG oppervlak

  1. Meng 5 x 108 biotinyleerd BCG met Avi-eiwit (10 μg/mL finale in PBS-T) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur op shaker platform.
  2. Wash bacteriën 3 keer met 500 µL van iced koude PBST en vlek met konijn anti-avidin antilichaam (Ab) (1:100 verdunning, eerder beschreven10) gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur en vervolgens met FITC geconjugeerd geit anti-konijn IgG Ab onder dezelfde omstandigheden.
  3. Wassen van bacteriën 3 keer met PBST 500 µL en analyseren door stroom cytometry te evalueren in welke mate van oppervlakte decoratie.

6. lyofilisatie van mycobacteriën

  1. Biotinylate-bacteriën volgens stap 3.1-3.4 en jas biotinyleerd bacteriën met Avi-eicellen volgens stap 5.1.
  2. Aliquot biotinyleerd en gecoate bacteriën (108), wassen met PBS en resuspendeer in 0,5 mL lyofilisatie media (1,5%, 25% Sauton medium en 75% H2O nb-glutamaat).
  3. Bacteriën overbrengen in glazen flesjes en bevriezen in een vriezer-80 ° C's nachts.
  4. Lyophilize gevulde en bevroren glazen flesjes voor 24 h met gebruikmaking van een bevriezing van de droger.
  5. Opslaan van gedroogde monsters bij kamertemperatuur en reconstrueren in PBS wanneer nodig.
  6. Herhaal stap 3.5 biotinylation en oppervlakte coating stabiliteit te evalueren.

7. fagocytose Assay

  1. RAW 264.7 macrofaag cellen in 10 cm diameter cultuur gerechten in DMEM medium met 5% FCS, 1%, elke van L-glutamine, HEPES, niet-essentiële aminozuren, en penicilline en streptomycine groeien tot 70-80% confluentie.
  2. Zaad van 2 x 106 RAW 264.7 macrofaag cellen in een 6-well-plate. Cellen te houden 's nachts bij 37 ° C en 5% CO2toestaan.
  3. Genereren van DsRed BCG (eerder beschreven9) versierd met Avi-eicellen (DsRed BCG-Avi-OVA) volgens stappen 3.1-3.4 en 5.1.
  4. Infecteren ruwe cellen met DsRed BCG-Avi-eicellen of onbehandeld DsRed BCG op MOI 20:1 gedurende 24 uur bij 37 ° C.
  5. Spoel de cellen driemaal en trypsinize met 1 mL van 0,25% trypsine bij 37 ° C gedurende 10 minuten te verwijderen van gedeeltelijk vrijstaande bacteriën.
  6. Positiebepaling in 2,5% PFA in PBS gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
  7. 3 x met PBS wassen en analyseren door stroom cytometry.

8. intracellulaire handel in eicellen ingericht biotinyleerd BCG in macrofagen

  1. Fluorescentie microscopie
    1. Beënt, 3 x 105 RAW 264.7 macrofaag cellen op coverslips in een 24-well-plate. Cellen te houden 's nachts bij 37 ° C en 5% CO2toestaan.
    2. Macrophage cellen met mycobacteriën (MOI 10:1) in onderhoud media zonder antibiotica bij 37 ° C en 5% CO2 voor 4 tot en met 24 h infecteren.
    3. Wassen van de cellen en trypsinize om te verwijderen van oppervlakte geschakelde, niet-ingenomen bacteriën zoals in stap 7.5.
    4. Fix geïnfecteerde cellen in 2,5% PFA in PBS gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur gevolgd door 3 wasbeurten met PBS.
    5. Permeabilize cellen in blokkeren/permeabilization buffer (0,1% Triton X-100, 3% BSA in PBS) gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
      1. Gebruik specifieke antilichaam van belang (bijvoorbeeldanti-avidin Ab konijn) bij 10 μg/mL in permeabilization buffer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur gevolgd door secundair antilichaam (bijvoorbeeldFITC-geit anti-konijn IgG) voor 20 min.
    6. Wash cellen 3 x met PBS, een keer met water, en mount op dia's in 10 μL van waterige montage medium om te minimaliseren van de fluorescentie photobleaching.
    7. Onderzoeken van de dia's door digitale confocale microscopie met behulp van een Microscoop van de epifluorescence uitgerust met 63 x / 1.4 Plan-Apochromat doel. Record beelden met behulp van een digitale camera gekoppeld aan de Microscoop software.
  2. Immunogold kleuring en elektronenmicroscopie
    1. Zaad van 2 x 106 RAW 264.7 macrofaag cellen in 6-Wells-platen.
    2. Herstellen van BCG geïnfecteerde macrofagen met 4% PFA gedurende 4 uur bij kamertemperatuur.
    3. Wassen monsters tweemaal met PBS.
    4. Monsters in 4% lage smeltpunt agarose insluiten en uitdrogen in 70% ethanol.
    5. Monsters overbrengen in acryl hars en polymeriseren bij 50 ° C.
    6. 60 nm secties met microtome uitgesneden en verzamelen van secties op nikkel rasters.
    7. Label monsters met 10 μg/mL avidin antilichaam gedurende 1 uur bij kamertemperatuur of 4 ° C's nachts in incubatie oplossing (PBS en 0,1% BSA) en daarna wassen met incubatie oplossing goud-geconjugeerde F(ab')2 van ultra-kleine geit-anti-konijn IgG (1/20) gedurende 1 uur op de kamer temperatuur in incubatie oplossing.
    8. Secties in gedistilleerd water wassen, vlekken in 2% Glutaaraldehyde wassen opnieuw, droge lucht en onderzoek met de elektronenmicroscoop.

9. dierlijke immunisering en orgel Processing

Opmerking: Alle stappen moeten worden gedaan in een kabinet bioveiligheid.

  1. Pass biotinyleerd en eiwit gecoat bacteriën via 271/2G naald 10 keer om één celsuspensie.
  2. Neem 1 x 106 bacteriën in 100 μl van endotoxinen-vrije PBS en immuniseren een vrouwelijke C57BL/6 muizen (-A,b, H - 2 Kb, 5-6 week oud) subcutaan in het nekvel van de nek.
    1. Injecteren controle muizen met 100 μl van PBS alleen.
  3. Euthanaseren geïmmuniseerde muizen 20 dagen na immunisatie bij CO2 inademing gevolgd door cervicale dislocatie.
    1. Isoleren van de milt en breng het in RPMI media.
  4. Pureer de milt door een zeef van de cel 70 µm met een zuiger van de spuit 5 mL.
    1. Wassen met 5 mL RPMI. Centrifuge (800 x g, 3 min) te isoleren van de schorsing van een enkele cel.
    2. RBC met muis Biotine positieve selectie kit met biotine-Ter119/Erythroid cellen Ab afbreken.
    3. Centrifuge en resuspendeer de cellen in 10 mL van de volledige RPMI (10% FCS, 1% L-glutamine, penicilline van 1%, 1% streptomycine en 50 μM 2-ME).

10. ik-Ab tetrameer kleuring te bepalen de frequenties van antigeen-specifieke CD4+ T-cellen en intracellulaire Cytokine vlekken te bepalen frequenties van antigeen-specifieke T cellen vrijgeven van Cytokines in geïmmuniseerd dieren

  1. Tetrameer kleuring
    1. Vlekken van splenocytes van controle en geïmmuniseerde muizen (~ 20 x 106 cellen) met PE-geconjugeerde ik-A-b-eicellen323-339 tetramers (in de verdunning 1/12,5) gedurende 1 uur bij 37 ° C in bindende buffer (PBS met 2% FCS en 0,1% NaN3).
    2. AF647 CD4 Ab (1:25) en 7-AAD (te sporen dode cellen) toevoegen aan splenocytes gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
    3. Het analyseren van monsters met stroom cytometry.
    4. Verwerven van 500.000 gebeurtenissen in de CD4-positieve regio om te bepalen van de frequentie van tetrameer positieve gebeurtenissen.
      Opmerking: Totale splenocytes worden gedefinieerd door de wetenschappelijke stuurgroep/FSC dot blot, levende cellen door uitsluiting van de 7-AAD positieve gebeurtenissen en CD4 deelverzamelingen door gating AF647 positieve gebeurtenissen.
  2. Frequentie van antigeen specifieke intracellulaire Cytokine vrijgeven van T cellen
    1. Overdracht ongeveer 1 × 107 splenocytes in 4 mL voor volledige RPMI medium in zes-Wells-platen met of zonder recombinante eicellen (10 µg/mL) en incubeer gedurende 16 h.
    2. Cellen met Brefeldin A (1:1, 000) voor een extra 5 h behandelen.
    3. Wassen met PBS en onder voorbehoud van intracellulaire cytokine kleuring als volgt:
      1. Vlek celsteekproeven met PE-CD8 of PE-Cy7-CD4 Ab (1:50 in bindende buffer) bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
      2. Vast in 4% PFA bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten.
      3. Permeabilize met behulp van de permeabilization oplossing, volgens de instructies van de fabrikant.
      4. Wassen cellen en label met AF647-geconjugeerde IFN-γ Ab (1:50) gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
      5. Wassen van de cellen en onderworpen aan stroom cytometry analyse zoals hierboven beschreven.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De algemene procedures beschreven, werd de haalbaarheid van BCG oppervlakte biotinylation en decoratie met surrogaat antigeen eicellen onderzocht. De immunogeniciteit van de gemodificeerde BCG destijds getest in vivo. De bacteriële oppervlak was gemakkelijk gelabeld met biotine voor snelle weergave van de chimeer antigenen avidin zonder enige detecteerbare veranderingen in bacteriële fenotypen. De resulterende gewijzigde BCG efficiënt wordt ingenomen door antigeen presentatie cellen en een eicellen-specifieke immuunrespons bij muizen kan veroorzaken.

Generatie van monomere avidin fusion plasmiden en eiwitten
Een expressie plasmide p17-Avi werd gegenereerd zodat ze compatibel met Gateway methode moeten worden gehanteerd voor de productie van de monomeer avidin fusion eiwitten. EICELLEN werd gekloond in p17-Avi en uitgedrukt in E. coli, dan gezuiverd en refolded zoals beschreven hierboven (Figuur 1).

Biotine efficiënt hecht aan het bacteriële oppervlak en heeft geen invloed op de groei van bacteriën of overleving
Bacteriën waren gelabeld met verschillende concentraties (0-1 mM) van biotine en gekleurd te onderzoeken van de efficiëntie van oppervlakte biotinylation volgens bovenstaande protocollen. Stroom cytometry analyse toonde een totale verschuiving van fluorescentie histogram in bacteriën aangeduid met 0,5 mM Biotine (Figuur 2), en deze concentratie werd gebruikt gedurende deze studie voor het genereren van biotinyleerd bacteriën. Daarna, we onderzocht het effect van bacteriële oppervlakte wijziging op bacteriële fenotype en vond dat zijn de biotinyleerd en controle onbehandeld BCG een soortgelijke groeiprofiel weergegeven over een periode van 8 dagen (figuur 3A). BCG uiten luciferase (BCG-Luc)9 werd gebruikt voor het onderzoeken van bacteriële overleven in macrofagen. Luminescentie signalen indicatief van bacteriële levensvatbaarheid werden geregistreerd meer dan 48 h. resultaten toonde vergelijkbare profielen van de daling van de geleidelijke levensvatbaarheid tussen biotinyleerd en bestrijding van bacteriën (figuur 3B). Kortom, deze gegevens duidelijk aangeven dat bacteriële oppervlakte biotinylation heeft geen invloed op bacteriële groei of overleven in macrofagen, hetgeen belangrijk is aangezien verhoogde overleven in macrofagen zou kunnen een toename in bacteriële virulentie betekenen.

Efficiëntie van bacteriële oppervlakte decoratie
Biotinyleerd bacteriën waren bedekt met eicellen antigeen peptide in fusie met monomere avidin, volgens bovenstaande protocollen. Stroom cytometry analyse toonde minimumniveaus van eicellen binden aan niet-biotinyleerd bacteriën (MFI = 8.31 ± 0.42, figuur 4A, bovenste paneel) en aanzienlijke niveaus van eicellen bindt aan biotinyleerd bacteriën (MFI = 54.67 ± 4,98) in vergelijking met controle bacteriën (MFI = 5.92 ± 0.22, figuur 4A, lagere paneel).

Stabiliteit van BCG oppervlakte decoratie
Aangezien conventionele levende BCG vaccins zijn geformuleerd als gedroogde poeders, was een belangrijke vraag die ontstaan tijdens deze studie de stabiliteit van gemodificeerde BCG nadat vriesdrogen reconstitutie en opslag in gekoeld of kamertemperatuur. Dus we oppervlakte weergave van Avi-eicellen in gelyofiliseerd BCG Avi-eicellen (oppervlak versierd met Avi-eicellen) onderzocht en in vers ingericht bacteriële preparaten. De resultaten (figuur 4B) toonden aan dat niveaus van Avi-eicellen op het bacteriële oppervlak bleef stabiel en aantoonbaar een maand na lyofilisatie en opslag bij kamertemperatuur in vergelijking met verse bereidingen van de BCG Avi-eicellen, die bewezen dat dit oppervlak decoratie-methode is geschikt voor de ontwikkeling van een vaccin.

Macrophage fenotype wordt niet beïnvloed door bacteriële oppervlakte decoratie
Om te zien of deze oppervlakte decoratie methodologie met bacteriële indienststelling gastheer cellen interfereert, hebben we een aantal RAW264.7 cellen en DsRed bacteriën9 gebruikt voor het uitvoeren van een test van de fagocytose beschreven in het bovenstaande protocol. Figuur 4C toonde dat bacteriële oppervlak versierd BCG hadden geen significante interferentie met bacteriële vermelding (22.5 ± 1,57%) ten opzichte van ongecoat wild type BCG (24.47 ± 1.18%) die aangeeft dat oppervlakte decoratie van BCG geen effect op macrophage heeft fenotype.

Avidin fusion eiwitten intracellulair reizen en co lokaliseren met MHC moleculen
Onderzoek naar Avi-eicellen-ingericht BCG lot in macrofagen, aanhangend ruwe cellen geïnfecteerd en onderzocht door fluorescentie microscopie, zoals beschreven in het bovenstaande protocol. Beelden verkregen (figuur 5A) bleek dat Avi-eicellen niet alleen aanwezig op de bacteriële oppervlak, maar ook vrijstaand en translocated naar het cytoplasma verre aan de bacteriën. Verder controleren dit resultaat, wij een immunogold kleuring experiment uitgevoerd en de beelden verkregen toonde duidelijk aan dat de Avi-eicellen antigenen niet alleen aanwezig op het oppervlak van de BCG zijn, maar ook van het oppervlak van de BCG loskoppelen kunnen, kruisen de phagosomal membraan, en reizen richting het cytosol (figuur 5B). Om verder te onderzoeken of de bacteriën Avi-eicellen ingericht aankonden hun oppervlakte-proteïne lading te leveren aan het antigeen presentatie traject, waren macrofagen besmet met Avi-eicellen BCG, zoals beschreven in het protocol, en onderworpen aan confocal analyses. Resultaten (figuur 6A) bleek dat er colocalization is Avi-eicellen met-A moleculen, suggereren dat avidin fusieproteïne vrijstaand en translocated aan het antigeen presentatie compartimenten waarin ze geladen op MHC II moleculen zijn. Resultaten toonde ook aan dat de Avi-eicellen peptide mede met lokaliseert klasse I moleculen binnen BCG phagosomes wanneer gekleurd voor H-2_kb (figuur 6B), waarin wordt aangetoond dat potentiële presentatie van Avi-eicellen-antigeen tot een CD8+ T cellen door de macrophage. Deze gegevens wijzen erop dat zodra het oppervlak versierd bacteriën voer macrofagen, de antigenen zijn in staat om verkeer naar de antigeen presentatie-trajecten.

Oppervlakte ingerichte bacteriën zijn volledig immunogene
Om te onderzoeken of oppervlakte ingerichte BCG is in staat een specifieke immuunrespons in vivo, C57BL/6 muizen inducerende werden geïmmuniseerd met PBS alleen (control), wild-type BCG, Avi-eicellen ingericht BCG en BCG genetisch getransformeerd met een plasmide wil een soortgelijke eicellen antigeen. Geïmmuniseerde muizen werden opgeofferd 20 dagen later en de frequenties van eicellen-specifieke CD4+ T cellen en het vrijgeven van cytokines eicellen-specifieke T-cellen werden waargenomen, volgens het protocol. Resultaten (figuur 7A-B) toonde een groter deel van de eicellen-specifieke CD4+T-cel-reactie in dieren geïmmuniseerd met BCG bekleed met Avi-eicellen in vergelijking met BCG WT. BCG genetisch gemodificeerde uitspreken eicellen toonde een soortgelijke immuunrespons BCG AVI-eicellen (Figuur 7). Deze gegevens bleek dat de bacteriële oppervlakte decoratie-methode staat voor het opwekken van een aanzienlijke uitbreiding van het antigeen is specifiek CD4+ T cellen en de mate van T-cel-respons-inductie is vergelijkbaar met BCG genetisch gemanipuleerde om uit te drukken een soortgelijke eicellen antigeen.

Aangezien de intracellulaire cytokines zijn ook belangrijke indicatoren van antigeen-specifieke T cel reacties, werden intracellulaire cytokines kleuring (ICS) experimenten uitgevoerd om te verder immuunresponsen van T cel te beoordelen aan de hand van de expressie en de frequenties van Effector cytokines in dieren geïmmuniseerd met bacteriën eicellen versierd en bacteriën genetisch getransformeerd met een uiting van de plasmide eicellen. We hebben onderzocht de niveaus van IFN-γ release, die een bekende indicator van beschermende reactie tegen intracellulaire bacteriën11 is. We laten zien dat we waren kundig voor speurder vergelijkbare niveaus van eicellen-specifieke IFN-γ vrijgeven van CD4+ cellen in dieren geïmmuniseerd met bacteriën oppervlak versierd met eicellen (BCG-Avi-eicellen en BCG-p19-Avi-eicellen) ten opzichte van dieren geïmmuniseerd met bacteriën genetisch uiten eicellen (BCG-p19-OVA) (figuur 8A). Nog belangrijker is, wij waren ook kundig voor speurder aanzienlijk hogere frequenties van IFN-γ produceren CD8+ T cellen in dieren geïmmuniseerd met BCG-Avi-eicellen ten opzichte van dieren geïmmuniseerd met BCG genetisch uiten eicellen (Figuur 8 b-C) die aantoont dat de Biotine-avidin oppervlakte weergave van antigeen methodologie gemedieerde kan effectief vervangen BCG transformatie nucleïnezuren.

Figure 1
Figuur 1: bouw van een recombinatie klonen van de plasmide voordeproductie van avidin fusion eiwitten. (A) een gen segment codering voor monomere avidin werd gesynthetiseerd met beperkingsplaatsen NdeI en kennisgevingen en subcloned in pDEST17 tussen de 6 x histidine en de cassette van de gateway voor het genereren van p17-Avi plasmide. EICELLEN peptide252-345 DNA sequenties beëindigd met attB sites werden gekloond in pDONR221. Daarna, eicellen genen werden subcloned in p17-Avi. Afbeelding bewerkt en herdrukt met toestemming van PLOS ONE12. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: efficiëntie van BCG biotinylation. BCG was biotinyleerd met concentratie van de verschillende van NHS-SS-Biotine gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur, vervolgens gelabeld met FITC-streptavidine, en geanalyseerd door stroom cytometry. Resultaten worden gepresenteerd als de histogrammen van groene fluorescentie intensiteit en de invoegen grafiek geeft de gemiddelde ± SEM van gemiddelde fluorescentie intensiteiten (MFI) 3 onafhankelijke experimenten in mindering. * P < 0,05; ** P < 0,01; P < 0,001. Afbeelding bewerkt en herdrukt met toestemming van PLOS ONE12. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: Biotinylation van BCG oppervlak heeft geen invloed op de groei of haar voortbestaan in de macrofaag. (A) Biot-BCG en controle ongelabelde wild-type BCG waren gegroeid in volledige 7 H 9 media en replicatie over een periode van 8 dagen werd bewaakt. De resultaten worden uitgedrukt als groeikrommes, dat wil zeggen, absorptie bij 600 betekenen nm als functie van tijd ± SEM uit 3 onafhankelijke experimenten. (B) macrofagen waren geïnfecteerd met Biot-BCG-Luc of labelloze BCG-Luc bepalen voor de aangegeven tijd heeft ontvangen, waarna cel lysates werden voorbereid en vehiculumcontrolegroep bioluminescentie te detecteren van levensvatbare bacteriën. Resultaten worden uitgedrukt als: relatieve licht eenheden (RLU) ± SEM uit 3 onafhankelijke experimenten. Afbeelding bewerkt en herdrukt met toestemming van PLOS ONE12. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: Avi-eicellen binden aan Biot-BCG en zijn stabiliteit. (A) Biot-dsRed-BCG (bacteriën uiting van rode fluorescentie, eerder beschreven9) en de controle niet-biotinyleerd dsRed-BCG waren gemengd met Avi-eicellen bij kamertemperatuur voor 1 h en de omvang van eicellen bindend werd geëvalueerd door het oppervlak vlekken met konijn anti-avidin antistof en FITC-geit anti-konijn IgG (FL1). Monsters werden gewassen en geanalyseerd door stroom cytometry. Resultaten worden gepresenteerd als de histogrammen van groene fluorescentie intensiteit en waarden zijn gemiddelde ± SEM van MFI van Biot-BCG-AviOVA bindend verkregen uit drie onafhankelijke experimenten. (B) gelyofiliseerd Biot-BCG bedekt met Avi-eicellen en vers gemaakte Avi-eicellen-Biot-BCG waren gelabeld en geanalyseerd door stroom cytometry zoals beschreven in A. Gegevens vertegenwoordiger van drie onafhankelijke experimenten, en waarden zijn gemiddelde ± SEM van MFI's van Avi-eicellen-Biot-BCG bindend verkregen uit drie onafhankelijke experimenten. (C) RAW macrofagen waren geïnfecteerd met DsRed BCG-Avi-OOVA of DsRed-BCG gedurende 24 uur bij 37 ° C. Monsters werden vervolgens gewassen, behandeld met trypsine, vaste en geanalyseerd door FACS. Resultaten worden uitgedrukt als rode fluorescentie histogrammen, die de omvang van fagocytose weerspiegelen. Waarden geven aan gemiddelde percentage ± SEM van cellen inname van BCG verkregen uit drie onafhankelijke experimenten. Afbeelding bewerkt en herdrukt met toestemming van PLOS ONE12. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5: Avi-eicellen losgekoppeld van BCG oppervlak en stak de phagosomal membraan naar de cytosol. (A) aanhanger ruwe cellen op cover slips geïnfecteerd met eicellen-ingericht dsRed-BCG gedurende 24 uur bij 37 ° C en vervolgens vast/permeabel en gekleurd met konijn anti-avidin antistof en FITC-geit anti-konijn IgG. Monsters waren gemonteerd op Microscoop dia's en geanalyseerd door digitale confocale microscopie. Rode signalen geven de positie van BCG en groene signalen weerspiegelen de lokalisatie van Avi-eicellen. De stippellijn geeft aan de macrofaag celrand en het bodemrecht paneel is een 4 X vergroting van het donormateriaal in het linkerpaneel getoond. (B) dunne secties van BCG-AviOVA besmet ruwe cellen werden vastgesteld met paraformaldehyde sequentieel geïncubeerd met anti-avidin antistof en anti-konijn geit goud-geconjugeerde IgG te visualiseren Avi-eicellen en onderzocht met een elektronenmicroscoop. Vergroting van 12.000 X wordt weergegeven. Lijn de pijlpunten uit geven aan Avi-eicellen losgekoppeld van BCG oppervlak en geëxporteerd buiten het phagosome membraan. De beelden zijn vertegenwoordigers van twee onafhankelijke experimenten. Afbeelding bewerkt en herdrukt met toestemming van PLOS ONE12. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 6
Figuur 6: Avidin-fusion antigeen mede gelokaliseerd met de MHC klasse II en klasse I moleculen. Aanhangend BMA3.1A7 cellen, een muis macrofaag cellijn, besmet waren met eicellen GFP-BCG (uiting van groen fluorescent, eerder beschreven9) ingericht voor 4 h en vervolgens gestimuleerd met IFN-γ voor 24 h. cellen werden dan vaste/permeabel en gekleurd met konijn anti-avidin antistof, Alexa 594 anti-konijn IgG en Alexa 647 rat anti-muis-A (A) of Alexa 647 rat anti-muis H-2_kb (B). Monsters waren gemonteerd op Microscoop dia's en geanalyseerd door digitale confocale microscopie. Groene signalen geven de positie van BCG-GFP en rode signalen weerspiegelen de lokalisatie van Avi-eicellen. Blauwe signalen geven de positie van de MHC klasse II of klasse I moleculen. De stippellijn geeft het gebied van belang. Pijlpunten geven Avi-eicellen colocalization met MHC moleculen. Beelden getoond zijn vertegenwoordigers van twee onafhankelijke experimenten. Afbeelding bewerkt en herdrukt met toestemming van PLOS ONE12. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 7
Figuur 7: In vivo CD4+ T-cel-reactie op BCG eicellen-ingericht. C57BL/6 muizen werden subcutaan ingespoten met BCG oppervlak versierd met BCG genetisch veranderd om uit te drukken van eicellen (BCG-p19-OVA), eicellen, ongewijzigde BCG wild-type, PBS (control) of getransformeerd met controle plasmide en oppervlak versierd met Avi-eicellen () BCG-p19-AviOVA). Na een periode van 20 dagen, splenocytes waren bereid uit de milt van euthanized dieren en gekleurd met PE-geconjugeerde ik-A-b-eicellen323-339 tetramers (A) gevolgd door AF647-CD4 antilichaam en 7-AAD. Monsters werden vervolgens geanalyseerd door stroom cytometry. Resultaten worden uitgedrukt als twee-parameter dot plots dat de gemiddelde frequenties ± SEM van tetrameer positieve gebeurtenissen in de CD4 weergeven+ bevolking uit twee dieren/groep. Gegevens worden weergegeven zijn representatief voor drie onafhankelijke experimenten (een totaal van zes muizen werden onderzocht met celsteekproeven van elke muis geëvalueerd in drievoud). De gegevens in grafieken (B) worden uitgedrukt als waarde ± SEM van het absolute aantal (in een totaal van 500.000 gebeurtenissen) eicellen tetrameer specifieke CD4+ cellen in twee dieren/groep en drie onafhankelijke experimenten. * P < 0,05; ** P < 0,01; P < 0,001. Afbeelding bewerkt en herdrukt met toestemming van PLOS ONE12. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 8
Figuur 8: frequenties van T-cellen die het vrijgeven van cytokines in reactie op Avi-eicellen coated BCG-vaccinatie. Splenocytes van geïmmuniseerde muizen met PBS, BCG Wild-type, BCG WT oppervlak versierd met Avi-eicellen, BCG-p19-eicellen en BCG-p19-AviOVA werden gestimuleerd met recombinant eicellen eiwit voor 16 h gevolgd door een 5 h-periode behandeling met Brefeldin A. Cells waren dan gewassen en gekleurd eerst met PE-Cy7 anti-CD4 (A) of PE anti-CD8 antilichaam (B) vervolgens AF647 anti-IFN-γ antilichaam. Cellen werden vervolgens gewassen en geanalyseerd door stroom cytometry. Resultaten worden uitgedrukt als twee-parameter dot percelen te tonen de gemiddelde frequenties ± SEM van IFN-γ producerende cel deelverzamelingen in CD4+ en CD8+ populaties uit twee dieren/groep. Gegevens worden weergegeven zijn representatief voor drie onafhankelijke experimenten (een totaal van zes muizen werden onderzocht met celsteekproeven van elke muis geëvalueerd in drievoud). De gegevens in grafieken (C) worden uitgedrukt als het gemiddelde van de absolute nummer ± SEM van IFN-γ vrijgeven van CD4+ T cellen (zie linker grafiek) of IFN-γ vrijgeven van CD8+ T cellen (juiste grafiek) van twee dieren/groep en drie onafhankelijke experimenten. * P < 0,05; ** P < 0,01; P < 0,001. Afbeelding bewerkt en herdrukt met toestemming van PLOS ONE12. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In deze studie meldden wij een niet-genetische aanpak voor snelle en effectieve weergave van exogene eiwitten op BCG oppervlak om toe te voegen specifieke antigenen of specifieke functionele eigenschappen verwacht om efficiënt de immunogeniciteit van de bacterie. We toonden aan dat het celoppervlak BCG biotinyleerd voor ogenblikkelijke oppervlakte decoratie met avidin fusion eiwitten gemakkelijk zou kunnen zijn. De totale procedure kan worden uitgevoerd binnen de 2 uur, terwijl genetische transformatie en selectie van positieve klonen vereist 2 tot 3 maanden van tijd lag. Oppervlakte modificatie heeft geen invloed op bacteriële groei en overleving. Bacteriën versierd met surrogaat antigeen eicellen konden leveren het antigeen in de antigeen presentatie pathway en geïnduceerde specifieke immuunrespons in vivo, die werd beoordeeld door stroom cytometry testen met inbegrip van MHC tetrameer kleuring en intracellulaire cytokine kleuring (ICS). Nog belangrijker, in vivo onderzoek toonde duidelijk aan dat oppervlak versierd bacteriën konden voor het opwekken van vergelijkbare niveaus van immune reactie ten opzichte van BCG genetisch gemanipuleerde aan uitdrukkelijke soortgelijke antigenen.

Avidin Biotine interactie is de sterkste niet-covalente interactie bekend in de natuur met een K-o van 10−15 M13. Het is niet alleen een nuttig instrument gebruikte in biologisch onderzoek14, maar ook onlangs aangetoond dat gelden in kanker therapie15,16. In deze studie, een drievoudige Mutatie (N54A, W110K en N17I) werd toegepast op wild-type avidin tetramere avidin omzetten in een vorm van monomere avidin, dat is aanzienlijk verminderd avidin-Biotine affiniteit (K,d= 10−7 M) en bindt omkeerbaar aan biotine. Dit monomeer avidin werd gebruikt voor het ontwikkelen van een p17-Avi-plasmide die compatibel is met de Gateway recombinatie klonen (Invitrogen) voor een snelle one-step-expressie van een proteïne van belang. Deze nieuwe versie van de monomeer avidin heeft verschillende voordelen, met inbegrip van het voorkomen van grote bacteriële klomp aggregatie en van voorbijgaande aard/omkeerbare bacteriële oppervlakte weergave van proteïnen van belang. Daarom, eenmaal ingenomen door de gastheercel, Avi-fusion eiwitten kunnen losmaken van het oppervlak van biotinyleerd bacteriën en verkeer intracellulair. Ten slotte, de mutaties omzetten avidin in een niet-geglycosyleerde-formulier dat toegepast in gist of transgene planten17,18 voor de productie van grote hoeveelheden avidin fusion eiwitten in eukaryotische systemen worden kan. Deze vorm van monomere avidin werd gekozen in plaats van een versie van de monomeer streptavidine (mSA)19, die heeft zowel daar als rhizavidin sequenties en had een hogere affiniteit voor bindende (Kd van 10−9 M) in vergelijking met mAvidin. Met voorbereidende tests, moest mSA chimera eiwit een veel lagere efficiëntie van de bindende biotinyleerd bacteriën ten opzichte van mAvidin chimera eiwit. Deze studie, daarom, was gebaseerd op mAvidin, maar daar monomeer of andere vormen van streptavidine/avidin zou ook een mogelijkheid voor andere toepassingen.

Succesvolle implementatie van de beschreven protocollen, hangt af van de kwaliteit van de gegenereerde fusieproteïne en efficiëntie van de bacteriële oppervlakte biotinylation. Avi-gelabeld eiwit geëlueerd moet worden-gezouten en buffer uitgewisseld in PBS met behulp van de juiste moleculair-gewicht eiwit concentrator. Neerslag kan optreden bij hoge concentratie factoren voor sommige eiwitten, daarom concentratie factor moet worden getest en bepaald met behulp van kleine hoeveelheden eiwit geëlueerd op eerste, bijvoorbeeld0,5 tot 1 mL van ontbindend integratie lichaam verdund in 20 mL PBS en vervolgens geconcentreerd. Het is ook belangrijk om de temperatuur van het eiwit ongeveer 4 ° C tijdens het gehele proces om te voorkomen dat neerslag.

Ter verbetering van de efficiëntie van bacteriële oppervlakte biotinylation, moet Sulfo-NHS SS Biotine worden opgeslagen in de originele verpakking in het donker bij 4 ° C. Het reagens is zeer vocht gevoelig; flesjes met het reagens moeten daarom worden geëquilibreerd tot kamertemperatuur voor opening. Ook, Biotine stockoplossing (10 mM) moet worden onmiddellijk vóór gebruik zoals het NHS-ester-deel daarvan ontstabiel en geworden nietreactief zeer snel. Biotine stamoplossing niet kan worden opgeslagen en worden hergebruikt; een nieuwe Biotine flacon is nodig voor elk biotinylation-experiment. Voor de beste resultaten, worden verse culturen van BCG, nieuwe media, evenals verse buffers aanbevolen. Zoals vermeld in het protocol, biotinyleerd en gecoate BCG kon worden gelyofiliseerde vorm en bewaard gedurende ten minste 30 dagen zonder dat de kwaliteit van de oppervlaktelaag. Dit is vooral handig bij het verzenden of overzetten van monsters van de ene locatie naar de andere of bij het uitvoeren van langebaan experimenten.

Deze BCG oppervlakte decoratie methode biedt ook andere spannende mogelijkheden te analyseren en evalueren van de immunogeniciteit van nieuw ontwikkelde vaccins kandidaten op een snelle en nauwkeurige manier. Het primaire doel van roman TB vaccins is ertoe TH1 type cellen zoals CD4+ en CD8+ T cellen die spelen belangrijke rol in de bescherming tegen TB. Het systeem van de avidin-Biotine ontwikkeld in deze studie biedt een zeer nuttig instrument voor de beoordeling van deze T-cellen reacties. Deze nieuwe technologie van snel weergeven van recombinante eiwitten/antigenen op het oppervlak van de BCG vertegenwoordigt een geweldig hulpmiddel om snel en nauwkeurig de beschermende werkzaamheid van vele immunogene eiwitten (bijvoorbeelduitgescheiden specifieke M.tb eiwitten), en dus kan worden vertaald in de ontwikkeling van doeltreffende vaccins.

Door te passen en variërend van de concentratie van proteïnen toe Avi-fusion op bacteriële oppervlak, kan een ander voordeel van deze methode worden gelijktijdig verschillende antigenen van belang om op te geven het bacteriële oppervlak te maximaliseren van de effectiviteit van het vaccin. Omdat studies hebben aangetoond dat BCG met belangrijke macrofaag functies zoals phagosome rijping20,21 en antigeen presentatie21 interfereert, kan een mogelijkheid om verdere verbetering van BCG BCG oppervlak met worden versieren een combinatie van factoren bekend voor het versnellen van de rijping van de phagosome samen met antigenen van belang.

Sommige beperkingen van deze technologie omvatten de eis van de grootschalige productie van recombinante eiwitten, die uitdagend en duur in arme gebieden zijn kan. Ook zou produceren hard voor het zuiveren van eiwitten vereisen probleemoplossing en optimalisatie. Echter kunnen deze beperkingen worden omzeild met de verbetering van recombinante eiwitten productietechnologieën. Een andere beperking omvat ook de mogelijkheid dat natuurlijk voorkomende anti-avidin antilichamen gemeenschappelijk in laboratorium dieren en mensen22 het gebruik van avidin voor therapeutische doeleinden belemmeren zou. Echter andere laboratoria hebben getest de veiligheid en de werkzaamheid van avidin therapie en hebben aangetoond dat de veiligheid en de werkzaamheid van avidin niet aanzienlijk beïnvloed door de immunogeniciteit23. Interessant, het omzetten van de wild-type tetramere avidin in de vorm van een monomeer aanzienlijk daalde de immunogeniciteit24.

Samenvattend, kan deze nieuwe technologie gebruik te maken van een avidin-Biotine systeem ter verbetering van de BCG immunogeniciteit via een snelle en reproduceerbare niet-bacteriële oppervlakte modificatie met eiwitten van belang met succes vervangen traditionele transformatie van BCG met antigeen-encoding plasmiden. Bovendien, deze nieuwe methode kan niet alleen verbetering van het huidige BCG-vaccin vergemakkelijken, maar kan ook een nieuw platform te bieden voor snelle beoordeling van vrijwel elke potentiële antigeen en eiwitten die normaal moeilijk uitspreken genetisch in BCG, met brede toepassingen in de ontwikkeling van TB-vaccin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Wij danken Dr. R Stokes voor de BCG Pasteur stam en A. Talal voor technische ondersteuning. Wij danken GenScript voor hulp bij gene synthese.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Endotoxin-free RPMI 1640 StemCell Technologies  36750
Sulfo-NHS SS biotin Thermo Fisher  21328
FITC-conjugated streptavidin Sigma-Aldrich S3762
Phycoerythrin (PE)-conjugated I-Ab-OVA323-339 tetramer  MBL International  TS-M710-1
7-AAD BD Pharmingen 559925
TALON polyhistidine-Tag purification resin  Clontech 635501
Alexa Fluor (AF) 647 conjugated rat anti-mouse CD4 BD Bioscience  557681
AF647 rat anti-mouse IFN-g BD Bioscience  557735
AF647 rat anti-mouse I-A/I-E BD Bioscience  562367
PeCy7 rat anti-mouse CD4 BD Bioscience  552775
PE rat anti-mouse CD8 Ab BD Bioscience  561095
AF 647 rat anti-mouse H-2kb BD Bioscience 562832
FITC-conjugated goat anti rabbit antibody Thermo Fisher 31635
AF 647 rat anti-mouse CD4 BD Bioscience  557681
Ultra-small gold-conjugated goat anti-rabbit IgG Electron Microscopy Sciences 25100
Middlebrook 7H9 broth BD Diagnostic Systems 271310
OADC BD Diagnostic Systems B11886
Tween 80 Sigma-Aldrich P1379
RAW 264.7 murine macrophage cell lines American Type Culture Collection
pDEST17 plasmid  Invitrogen 11803012
pUC57-OVA plasmid  GenScript SD1176
BP clonase  Invitrogen 11789020
LR clonase  Invitrogen 11791043
pDONR221 plasmid Invitrogen 12536017
Ni-NTA columns  Qiagen 31014
Pierce protein concentrators  Thermo Fisher  88527
Flurosave Calbiochem-Novabiochem 345789
Axioplan II epifluorescence microscope Carl Zeiss Inc
CCD digital camera  Retiga EX, QImaging
Tecnai G2 200kV electron microscope  FEI Company G2 200Kv 
70μm Falcon cell strainer  Thermo Fisher  87712
EasyStep mouse biotin positive selection kit  StemCell 18556
biotin-Ter119/Ertyroid cells antibody BioLegend 116203
Brefeldin A BD Pharmingen 555029
Cytofix/Cytoperm kit  BD Pharmingen 554714
Bright-Glo Luciferase assay system Promega e2620
Turner Biosystem luminometer  Promega TD-20/20
Leica EM UC6 microtome  Leica Microsystems UC6
Novalyphe NL 500 freeze dryer Savant Instruments  NL 50
Wheaton boroscilicate glass vials Wheaton  VWR 66011-675

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Horwitz, M. A., Harth, G. A new vaccine against tuberculosis affords greater survival after challenge than the current vaccine in the guinea pig model of pulmonary tuberculosis. Infect. Immun. 71 (4), 1672-1679 (2003).
  2. Pym, A. S., et al. Recombinant BCG exporting ESAT-6 confers enhanced protection against tuberculosis. Nat Med. 9 (5), 548-553 (2003).
  3. Grode, L., et al. Increased vaccine efficacy against tuberculosis of recombinant Mycobacterium bovis bacille Calmette-Guerin mutants that secrete listeriolysin. The J Clin Invest. 115 (9), 2472-2479 (2005).
  4. Bastos, R. G., Borsuk, S., Seixas, F. K., Dellagostin, O. A. Recombinant Mycobacterium bovis BCG. Vaccine. 27 (47), 6495-6503 (2009).
  5. Mederle, I., et al. Plasmidic versus insertional cloning of heterologous genes in Mycobacterium bovis BCG: impact on in vivo antigen persistence and immune responses. Infect Immun. 70 (1), 303-314 (2002).
  6. Singh, N. P., et al. A Novel Approach to Cancer Immunotherapy Tumor Cells Decorated with CD80 Generate Effective Antitumor Immunity A Novel Approach to Cancer Immunotherapy Tumor Cells Decorated with CD80 Generate Effective Antitumor Immunity. Cancer Res. 63 (14), 4067-4073 (2003).
  7. Oizumi, S., Strbo, N., Pahwa, S., Deyev, V., Podack, E. R. Molecular and cellular requirements for enhanced antigen cross-presentation to CD8 cytotoxic T lymphocytes. J Immunol. 179 (4), 2310-2317 (2007).
  8. Sharif-Paghaleh, E., et al. Monitoring the efficacy of dendritic cell vaccination by early detection of (99m) Tc-HMPAO-labelled CD4(+) T cells. Eur J Immunol. 44 (7), 2188-2191 (2014).
  9. Sun, J., et al. A broad-range of recombination cloning vectors in mycobacteria. Plasmid. 62 (3), 158-165 (2009).
  10. Laitinen, O. H., et al. Rational design of an active avidin monomer. J. Biol. Chem. 278 (6), 4010-4014 (2003).
  11. Flynn, J. L., Chan, J., Triebold, K. J., Dalton, D. K., Stewart, T. A., Bloom, B. R. An essential role for interferon gamma in resistance to Mycobacterium tuberculosis infection. J Exp Med. 178 (6), 2249-2254 (1993).
  12. Liao, T. Y. A., Lau, A., Joseph, S., Hytonen, V., Hmama, Z. Improving the immunogenicity of the Mycobacterium bovis BCG vaccine by non-genetic bacterial surface decoration using the avidin-biotin system. PLoS ONE. 10 (12), e0145833 (2015).
  13. Green, N. M. Avidin and streptavidin. Methods Enzymol. 184, 51-67 (1990).
  14. Howarth, M., Takao, K., Hayashi, Y., Ting, A. Y. Targeting quantum dots to surface proteins in living cells with biotin ligase. PNAS. 102 (21), 7583-7588 (2005).
  15. Lesch, H. P., Kaikkonen, M. U., Pikkarainen, J. T., Yla-Herttuala, S. Avidin-biotin technology in targeted therapy. Expert Opin Drug Deliv. 7 (5), 551-564 (2010).
  16. Paganelli, G., Bartolomei, M., Grana, C., Ferrari, M., Rocca, P., Chinol, M. Radioimmunotherapy of brain tumor. Neurol Res. 28 (5), 518-522 (2006).
  17. Cummings, J. F., et al. Safety and immunogenicity of a plant-produced recombinant monomer hemagglutinin-based influenza vaccine derived from influenza A (H1N1)pdm09 virus: a Phase 1 dose-escalation study in healthy adults. Vaccine. 32 (19), 2251-2259 (2014).
  18. Kolotilin, I., et al. Plant-based solutions for veterinary immunotherapeutics and prophylactics. Vet Res. 45, 114-117 (2014).
  19. Demonte, D., Drake, E. J., Lim, K. H., Gulick, A. M., Park, S. Structure-based engineering of streptavidin monomer with a reduced biotin dissociation rate. Proteins. 81 (9), 1621-1633 (2013).
  20. Deghmane, A. E., et al. Lipoamide dehydrogenase mediates retention of coronin-1 on BCG vacuoles, leading to arrest in phagosome maturation. J Cell Sci. 120 (19), 3489-3489 (2007).
  21. Soualhine, H., et al. Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guerin secreting active cathepsin S stimulates expression of mature MHC class II molecules and antigen presentation in human macrophages. J Immunol. 179 (8), 5137-5145 (2007).
  22. Bubb, M. O., Green, F., Conradie, J. D., Tchernyshev, B., Bayer, E. A., Wilchek, M. Natural antibodies to avidin in human serum. ImmunolLett. 35 (3), 277-280 (1993).
  23. Petronzelli, F., et al. Therapeutic use of avidin is not hampered by antiavidin antibodies in humans. Cancer Biother Radiopharm. 25 (5), 563-570 (2010).
  24. Bigini, P., et al. In vivo fate of avidin-nucleic acid nanoassemblies as multifunctional diagnostic tools. ACS Nano. 8 (1), 175-187 (2014).

Tags

Immunologie kwestie 131 Mycobacterium tuberculosis macrofagen immuunrespons recombinante eiwitten T-cellen antigenen biotine avidin-Biotine
Expressie van exogene antigenen in de <em>Mycobacterium bovis</em> -BCG-vaccin via niet-genetische oppervlak decoratie met het systeem Avidin-Biotine
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liao, T. Y. A., Lau, A., Sunil, J.,… More

Liao, T. Y. A., Lau, A., Sunil, J., Hytönen, V., Hmama, Z. Expression of Exogenous Antigens in the Mycobacterium bovis BCG Vaccine via Non-genetic Surface Decoration with the Avidin-biotin System. J. Vis. Exp. (131), e56421, doi:10.3791/56421 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter