قياس الإنفلونزا تحييد ردود الأجسام المضادة للفيروسات A(H3N2) في الأمصال البشرية قبل درياقي فحوصات باستخدام خلايا مدكك-SIAT1
Summary
إنفلونزا تحييد الأجسام المضادة ترتبط بحماية عدوى الإنفلونزا. فحوصات درياقي قياس تحييد الأجسام المضادة في الأمصال البشرية، وغالباً ما تستخدم للأنفلونزا البشرية علم الأمصال. يصف لنا الإنزيم درياقي استخدام خلايا مدك-SIAT1 لقياس تحييد الأجسام المضادة التتر المعاصرة فيروسات A(H3N2) 3C.2a و 3C.3a عقب التطعيم ضد الإنفلونزا أو العدوى.
Abstract
تحييد الأجسام المضادة ضد هيماغلوتينين (هكتار) من فيروسات الإنفلونزا تعتبر الآلية المناعية الرئيسية التي ترتبط بحماية لعدوى الإنفلونزا. فحوصات درياقي (مينيسوتا) كثيرا ما تستخدم لقياس استجابات جسم تحييد في الأمصال البشرية بعد التطعيم ضد الإنفلونزا أو العدوى. خلايا الكلي داربي الكلاب مدين (مدك) هي الركيزة الخلية المستخدمة عادة لفحوصات دقيقة. ومع ذلك، المتداولة حاليا قد اكتسبت فيروسات الإنفلونزا A(H3N2) 3C.2a و 3C.3a تبديل مستقبلات ملزم خصوصية. ثبت خط الخلية مدك-SIAT1 مع زيادة 2، 6 α سيليك اللبن مويتيس على السطح توفر العدوى محسنة وتكرار أكثر إخﻻصا من الخلايا مدك التقليدية لهذه الفيروسات A(H3N2) المعاصرة. هنا، نحن تصف مقايسة MN استخدام الخلايا مدك-SIAT1 التي تم الأمثل للتحديد الكمي لتحييد التتر الأجسام المضادة لهذه الفيروسات A(H3N2) المعاصرة. في هذا البروتوكول، الحرارة إبطال الأمصال المحتوية على تحييد الأجسام المضادة هي أول متسلسل المخفف، ثم المحتضنة مع تسيد 10050/جيدا من فيروسات الإنفلونزا A(H3N2) للسماح للأجسام المضادة في الأمصال لربط للفيروسات. ثم تضاف إلى خليط الفيروس أضداد الخلايا مدك-SIAT1، والمحتضنة ح 18-20 في 37 درجة مئوية، 5% CO2 للسماح A(H3N2) الفيروسات تصيب خلايا مدك-SIAT1. بعد الاحتضان بين عشية وضحاها، لوحات ثابتة وهي الكمية كمية الفيروس في كل جيدا قبل مقايسة الممتز المرتبط بالانزيم (ELISA) المضادة الإنفلونزا باستخدام الأجسام مضادة البروتين النووي (NP). ويعرف تحييد عيار الأجسام المضادة المتبادلة لتمييع المصل أعلى يقضي على تثبيط % إيه فايف زيرو من فيروس العدوى.
Introduction
تواصل فيروسات الإنفلونزا تتسبب في معدلات الاعتلال والوفيات في البشر كل سنة. ها هو بروتين سكري السطحية الرئيسية من فيروسات الإنفلونزا. تحييد الأجسام المضادة التي تستهدف ها هي الآلية المناعية الرئيسية الذي يرتبط بالحماية من الإصابة بالإنفلونزا1،2. هيماجلوتينيشن تثبيط (مرحبا) فحوصات وفحوصات دقيقة هي نوعان من الأساليب المستخدمة على نطاق واسع لقياس استجابات جسم الإنسان سيرا بعد العدوى أو التطعيم ضد الإنفلونزا3. المقايسة مرحبا تدابير تثبيط الأضداد hemagglutination الفيروس من خلايا الدم الحمراء، ويعتبر تحليل مركب. على عكس مرحبا، مقايسة MN مباشرة قياس مستويات الأجسام المضادة في الأمصال البشرية التي تحييد عدوى الإنفلونزا في الثقافات الخلية. مدك الخلايا غالباً ما تستخدم في عزل فيروس الإنفلونزا وفحوصات MN4.
فيروسات الإنفلونزا باستمرار الخضوع للانجراف مستضدي والتحول، والحصول على طفرات في البروتينات هكتار التي يمكن أن تغير من خصوصية ملزم مستقبلات لفيروسات. منذ عام 2014، ظهرت مجموعات جديدة من الفيروسات A(H3N2) وواصل أن يعمم حتى الموسم الحالي. أن غالبية هذه الفيروسات تنتمي إلى المجموعة الوراثية 3C.2a و 3C.3a على أساس تحليل النشوء والتطور من البروتينات هكتار. العديد من الفيروسات 3C.2a المتداولة قد قللت من قدرة على هيماجلوتيناتي خلايا الدم الحمراء و ولذلك لا يمكن أن توصف ب فحوصات مرحبا5. يجب استخدام تحييد فحوصات لقياس استجابات الأجسام المضادة لهذه الفيروسات التي لا هيماجلوتيناتي6. وعلاوة على ذلك، وقد أظهرت الدراسات أن هذه الفيروسات A(H3N2) المعاصرة غيرت خصائص ربط مستقبلات مقارنة مع سابق A(H3N2) الفيروسات، وتميل إلى أن تتراكم الطفرات الثقافة تكييفها وتعدد الأشكال عند باساجيد في الخلايا في المختبر الثقافات7،،من89. بالمقارنة مع التقليدية مدكك الخلايا، مدكك-SIAT1 وخط خلية وضعتها ماتروسوفيتش et al. من خلال مستقرة من تعداء الخلايا مدك مع كدنا للبشرية α2، 6-سيالترانسفيراسي (SIAT1). هذا خط الخلية تعرب عن زيادة كميات من α2، مويتيس 6-سيليك اللبن وانخفاض كميات من α2، مويتيس حمض 3-سيليك من الأصل مدك الخلايا10. وقد أظهرت الخلايا مدك-SIAT1 لتحسين معدلات العزل للفيروسات A(H3N2) مقارنة مدك الخلايا11. ومؤخرا، لين et al. وذكرت أن للنشأة 3C.2a و 3C.3a البشرية A(H3N2) فيروسات الإنفلونزا، تحققت تكرار الفيروس أكثر إخﻻصا وأفضل فيروس العدوى عندما كانت فيروسات المستزرعة في خطوط الخلايا مدك-SIAT1 مقارنة مع مدك الخلايا7. وهكذا، الخلايا مدك-SIAT1 هي أفضل في فحوصات دقيقة لوصف استجابات الأجسام المضادة للمجموعات الأخيرة من الفيروسات A(H3N2).
هنا يصف لنا مقايسة مينيسوتا استخدام خلايا مدك-SIAT1 لقياس استجابات جسم 3C.2a المعاصرة وفيروسات A(H3N2) 3C.3a في الأمصال البشرية. فيروسات تزرع في البيض أو خلايا يمكن استخدامها في هذا التحليل. الحرارة إبطال الأمصال المحتوية على تحييد الأجسام المضادة هي أول متسلسل المخفف، ثم المحتضنة مع تسيد 10050/جيدا من إنفلونزا A(H3N2) للسماح للأجسام المضادة في الأمصال لربط للفيروس. ثم تضاف إلى خليط الفيروس أضداد الخلايا مدك-SIAT1، والمحتضنة ح 18-20 في 37 درجة مئوية، 5% CO2 للسماح للفيروس A(H3N2) تصيب خلايا مدك-SIAT1، وتكرار. بعد الاحتضان بين عشية وضحاها، اللوحات ثابتة وهي الكمية كمية الفيروس في كل بئر بإليزا استخدام المضادة الإنفلونزا “التي أرستها” الأجسام المضادة. الكشف عن الحزب الوطني يشير إلى وجود الإصابة بالفيروس وعدم تحييد الأجسام المضادة. ويعرف تحييد عيار الأجسام المضادة المتبادلة لتمييع المصل أعلى يوفر ≥ 50 ٪ تثبيط فيروس العدوى.
Protocol
Representative Results
Discussion
والرزن مينيسوتا واحد من الاختبارات الرئيسية المستخدمة للأنفلونزا الأمصال للكشف عن استجابات الأجسام المضادة بعد الإصابة بالإنفلونزا أو التطعيم. كثيرا ما تستخدم التتر المتولدة من فحوصات دقيقة النتيجة الأولية للعديد من الدراسات السيرولوجية الإنفلونزا. فحوصات دقيقة تستخدم على نطاق واسع أ…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر الدكتور سو لو، والدكتور ليو فنغ، والسيدة أشلي بوروز من “شعبة الإنفلونزا” التابعة لمركز السيطرة على الأمراض لاستعراض دقيق وتقديم المساعدة في إعداد هذه المخطوطة. ونحن نشكر الدكتور أدريان ريبر من “شعبة الإنفلونزا” من مركز السيطرة على الأمراض لمساعدته في إعداد الرسومات في الشكل 3. وأخيراً، نشكر الدكتور م. ماتروسوفيتش، ماربورغ، ألمانيا لتوفير خلايا مدكك-SIAT1.
Materials
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) with high Glucose | Life Science | 11965 | A critical component of Sterile Cell Culture, Virus Propagation and Virus Diluent Media |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30070.03 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) Fraction V, Protase Free | Sigma-Aldrich | 3117332001 | |
| L-Glutamine | Life Science | 25030-081 | |
| Sodium pyruvate | Life Science | 11360-070 | |
| Geneticin G-418 disulfate salt | Sigma-Aldrich | A1720-5G | |
| HEPES | Life Science | 15630-080 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Science | 15140-122 | |
| Acetone | VWR | 67-64-1 | Used at an 80% concentration |
| Phosphate-Citrate Buffer with Sodium Perborate | Sigma-Aldrich | SLBF2806V | |
| O-Phenylenediamine Dihydrochloride tablet | Sigma-Aldrich | SLBQ1086V | 1 tablet per 100ml of cell culture grade water |
| Sulfuric Acid | Fisher Scientific | A510-P500 | Used 0.5M final concentration |
| Ethanol, Denatured, 4L | VWR | EM-AX0422-3 | Used at an 70% concentration |
| Trypsin-EDTA | Life Science | 1748048 | |
| RDE II "Seiken" | Denka Seiken | 370013 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379-500ml | |
| Anti-NP mouse monoclonal Ab | Millipore pool | MAB 8257 MAB 8258 | |
| Anti-mouse IgG HRP | KPL | 074-1802 | |
| 96-well flat-bottom plates | Thermo Scientific | 3455 | |
| Plate reader | Molecular Device | Spectromax 384 plus | |
| Cell Culture Flask 162 cm2/Vent Cap | Corning/VWR | 3151 |
References
- Reber, A., Katz, J. Immunological assessment of influenza vaccines and immune correlates of protection. Expert Rev of Vaccines. 12, 519-536 (2013).
- Li, C. K., Rappuoli, R., Xu, X. N. Correlates of protection against influenza infection in humans–on the path to a universal vaccine?. Curr Opin in Immunol. 25, 470-476 (2013).
- WHO Global Influenza Surveillance Network. . Manual for the labratory diagnosis and virological surveillence of influenza. , (2011).
- Govorkova, E. A., Kodihalli, S., Alymova, I. V., Fanget, B., Webster, R. G. Growth and immunogenicity of influenza viruses cultivated in Vero or MDCK cells and in embryonated chicken eggs. Dev Biological Stand. 98, 39-51 (1999).
- Levine, M. Z., et al. Neutralizing Antibody Responses to Antigenically Drifted Influenza A(H3N2) Viruses among Children and Adolescents following 2014-2015 Inactivated and Live Attenuated Influenza Vaccination. Clin Vaccine Immunol : CVI. 23, 831-839 (2016).
- Lin, Y., et al. The characteristics and antigenic properties of recently emerged subclade 3C.3a and 3C.2a human influenza A(H3N2) viruses passaged in MDCK cells. Influenza Other Respir Viruses. , (2017).
- Lin, Y. P., et al. Neuraminidase receptor binding variants of human influenza A(H3N2) viruses resulting from substitution of aspartic acid 151 in the catalytic site: a role in virus attachment?. J of Virol. 84, 6769-6781 (2010).
- Skowronski, D. M., et al. Mutations acquired during cell culture isolation may affect antigenic characterisation of influenza A(H3N2) clade 3C.2a viruses. Euro Surveillance. 21, 30112 (2016).
- Matrosovich, M., Matrosovich, T., Carr, J., Roberts, N. A., Klenk, H. D. Overexpression of the alpha-2,6-sialyltransferase in MDCK cells increases influenza virus sensitivity to neuraminidase inhibitors. J of Virol. 77, 8418-8425 (2003).
- Oh, D. Y., Barr, I. G., Mosse, J. A., Laurie, K. L. MDCK-SIAT1 cells show improved isolation rates for recent human influenza viruses compared to conventional MDCK cells. J Clin Microbiol. 46, 2189-2194 (2008).
- US Department of Health and Human Services. . Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , (2009).
- Reed, H. M. A simple method of estimating fifty percent endpoints. The American Journal of Hygiene. 27, (1938).
- Laurie, K. L., et al. International Laboratory Comparison of Influenza Microneutralization Assays for A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and A(H5N1) Influenza Viruses by CONSISE. Clinical Vaccine Immunol : CVI. 22, 957-964 (2015).
- Lin, Y., Gu, Y., McCauley, J. W. Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay. J Vis Exp : JoVE. , (2016).
- van Baalen, C. A., et al. ViroSpot microneutralization assay for antigenic characterization of human influenza viruses. Vaccine. 35, 46-52 (2017).
