Grippe neutralisante d’anticorps aux virus a (H3N2) dans le sérum humain par micro-neutralisation de mesure des analyses utilisant des cellules de MDCK-SIAT1
Summary
Les anticorps neutralisants de grippe sont en corrélation avec protection des infections grippales. Tests de micro-neutralisation mesurent les anticorps neutralisants dans des sérums humains et sont souvent utilisés pour la sérologie humaine de la grippe. Nous décrivons un essai de micro-neutralisation en utilisant des cellules de MDCK-SIAT1 pour mesurer les titres d’anticorps neutralisants à virus a (H3N2) 3C.2a et 3C.3a contemporains après vaccination contre la grippe ou une infection.
Abstract
Des anticorps neutralisants dirigés contre l’hémagglutinine (HA) des virus grippaux sont considérés comme le principal mécanisme immunitaire qui est en corrélation avec la protection pour les infections grippales. Tests de micro-neutralisation (MN) sont souvent utilisés pour mesurer la production d’anticorps neutralisants dans des sérums humains après vaccination contre la grippe ou une infection. Les cellules de Madine Darby Canine Kidney (MDCK) sont le substrat de la cellule utilisée couramment pour des dosages de MN. Toutefois, 3C.2a et 3C.3a la grippe a (H3N2) ont acquis des virus actuellement en circulation modifiée spécificité de liaison du récepteur. La lignée de cellules de MDCK-SIAT1 avec portions accrue α-2,6 sialique galactose sur la surface s’est avéré d’infectiosité améliorée et réplications plus fidèles que les cellules MDCK conventionnelles prévoient ces virus a (H3N2) contemporains. Nous décrivons ici un essai de MN en utilisant des cellules de MDCK-SIAT1 qui a été optimisé afin de quantifier les titres d’anticorps neutralisants de ces virus a (H3N2) contemporains. Dans ce protocole, sérums de chaleur inactivé contenant les anticorps neutralisants sont tout d’abord dilués en série, puis incubées avec 100 TCID50/bien des virus de la grippe a (H3N2) pour permettre des anticorps dans le sérum pour lier aux virus. Des cellules de MDCK-SIAT1 sont ensuite ajoutées au mélange des anticorps du virus et incubés pendant 18 à 20 h à 37 ° C, 5 % de CO2 pour permettre à des virus a (H3N2) d’infecter des cellules de MDCK-SIAT1. Après une nuit d’incubation, les plaques sont fixées et la quantité de virus dans chaque bien est quantifiée par un dosage immuno-enzymatique (ELISA) à l’aide contre la grippe une nucléoprotéine (NP) des anticorps monoclonaux. Titre d’anticorps de neutralisation est définie comme l’inverse de la plus forte dilution de sérum qui fournit ≥50 % d’inhibition de l’infectiosité du virus.
Introduction
Virus de la grippe continuent à cause de morbidité et mortalité chez l’homme chaque année. HA est la glycoprotéine de surface importante des virus grippaux. Les anticorps neutralisants ciblant HA constituent le principal mécanisme immunitaire qui est en corrélation avec la protection de l’influenza infection1,2. Tests d’hemagglutination inhibition (HI) et MN essais sont deux méthodes largement utilisés pour mesurer la production d’anticorps dans le sérum humain après grippe infection ou la vaccination3. Le test HI mesure inhibition des anticorps d’hémagglutination virus des globules rouges et est considéré comme un test de substitution. Contrairement à HI, le dosage de MN peut mesurer directement le taux d’anticorps dans le sérum humain qui neutralisent l’infection grippale dans des cultures cellulaires. Des cellules de MDCK sont souvent utilisés dans l’isolement du virus grippal et MN essais4.
Virus de l’influenza subissent constamment la dérive antigénique et Maj, acquérir des mutations sur les protéines HA pouvant modifier la spécificité de liaison du récepteur du virus. Depuis 2014, nouveaux groupes de virus a (H3N2) ont émergé et ont continué à circuler jusqu’à la saison en cours. La majorité de ces virus appartiennent au groupe génétique 3C.2a et 3C.3a, basée sur l’analyse phylogénétique des protéines HA. Beaucoup de virus circulants 3C.2a avaient réduit la capacité de résultats des globules rouges et donc ne peuvent être qualifiées de HI essais sur5. Tests de neutralisation doivent être utilisés pour mesurer la production d’anticorps à ces virus que résultats pas6. En outre, des études ont montré que ces virus a (H3N2) contemporains ont modifié les propriétés de liaison du récepteur par rapport aux précédents virus a (H3N2) et ont tendance à accumuler les mutations de la culture adaptée et polymorphisme lorsque repiquées dans in vitro de cellules cultures7,8,9. Par rapport aux traditionnelles cellules MDCK, MDCK-SIAT1 est une lignée cellulaire développée par Matrosovich et al. par le biais de transfection stable des cellules MDCK avec l’ADNc de α2 humaine, 6-sialtransferase (SIAT1). Cette lignée cellulaire exprime des quantités accrues de α2, fractions 6-sialique galactose et une diminution de α2, les moitiés acides sialique-3 que le parent de cellules MDCK10. Des cellules de MDCK-SIAT1 ont montré pour améliorer les taux de l’isolement des virus a (H3N2) par rapport à des cellules MDCK11. Récemment, Lin et al. a signalé que pour nouvellement écloses 3C.2a et 3C.3a humaine a (H3N2) virus de l’influenza, les réplications de virus plus fidèles et meilleure infectiosité du virus ont été atteints lorsque les virus ont été cultivées dans des lignées de cellules de MDCK-SIAT1 comparées à celle des cellules MDCK7. Ainsi, les cellules de MDCK-SIAT1 conviennent mieux dans MN essais pour caractériser les réponses anticorps aux clusters récentes du virus a (H3N2).
Nous décrivons ici un essai de MN en utilisant des cellules de MDCK-SIAT1 pour mesurer les réponses immunitaires à 3C.2a contemporaines et le virus a (H3N2) 3C.3a dans le sérum humain. Virus cultivés dans des oeufs ou des cellules peuvent être utilisés dans cet essai. Sérum de chaleur inactivé contenant les anticorps neutralisants est tout d’abord dilués en série, puis incubées avec 100 TCID50/bien des virus de la grippe a (H3N2) pour permettre des anticorps à lier le virus vaccinal. Des cellules de MDCK-SIAT1 sont ensuite ajoutées au mélange des anticorps du virus et incubés pendant 18 à 20 h à 37 ° C, 5 % de CO2 à permettent au virus a (H3N2) infecter des cellules de MDCK-SIAT1 et reproduire. Après une nuit d’incubation, les plaques sont fixées et la quantité de virus dans chaque puits est quantifiée par une technique ELISA utilisant des anticorps monoclonaux contre la grippe A NP. La détection du NP indique la présence d’infection par le virus et l’absence d’anticorps neutralisants. Titre d’anticorps de neutralisation est définie comme l’inverse de la plus forte dilution de sérum qui fournit ≥ 50 % d’inhibition de l’infectiosité du virus.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le dosage de MN est l’un des dosages du principales utilisés pour une sérologie de la grippe pour détecter les réponses en anticorps après infection de la grippe ou la vaccination. Titres générés à partir des essais de MN sont souvent utilisés comme le principal résultat de nombreuses études séroépidémiologie de grippe. Tests de MN sont aussi couramment pour séro-diagnostic et l’évaluation de l’immunogénicité du vaccin. International inter-lab a été étudié afin de comparer les analyses de MN …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le Dr Xiuhua Lu, Dr Feng Liu et Mme Ashley Burroughs de la Division grippe des CDC pour leur examen critique et l’assistance dans la préparation de ce manuscrit. Nous remercions le Dr Adrian Reber de Division de la grippe des CDC pour son aide dans la préparation du graphique de la Figure 3. Enfin, nous remercions le Dr M. Matrosovich, Marburg, Allemagne pour fournir les cellules MDCK-SIAT1.
Materials
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) with high Glucose | Life Science | 11965 | A critical component of Sterile Cell Culture, Virus Propagation and Virus Diluent Media |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30070.03 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) Fraction V, Protase Free | Sigma-Aldrich | 3117332001 | |
| L-Glutamine | Life Science | 25030-081 | |
| Sodium pyruvate | Life Science | 11360-070 | |
| Geneticin G-418 disulfate salt | Sigma-Aldrich | A1720-5G | |
| HEPES | Life Science | 15630-080 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Science | 15140-122 | |
| Acetone | VWR | 67-64-1 | Used at an 80% concentration |
| Phosphate-Citrate Buffer with Sodium Perborate | Sigma-Aldrich | SLBF2806V | |
| O-Phenylenediamine Dihydrochloride tablet | Sigma-Aldrich | SLBQ1086V | 1 tablet per 100ml of cell culture grade water |
| Sulfuric Acid | Fisher Scientific | A510-P500 | Used 0.5M final concentration |
| Ethanol, Denatured, 4L | VWR | EM-AX0422-3 | Used at an 70% concentration |
| Trypsin-EDTA | Life Science | 1748048 | |
| RDE II "Seiken" | Denka Seiken | 370013 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379-500ml | |
| Anti-NP mouse monoclonal Ab | Millipore pool | MAB 8257 MAB 8258 | |
| Anti-mouse IgG HRP | KPL | 074-1802 | |
| 96-well flat-bottom plates | Thermo Scientific | 3455 | |
| Plate reader | Molecular Device | Spectromax 384 plus | |
| Cell Culture Flask 162 cm2/Vent Cap | Corning/VWR | 3151 |
References
- Reber, A., Katz, J. Immunological assessment of influenza vaccines and immune correlates of protection. Expert Rev of Vaccines. 12, 519-536 (2013).
- Li, C. K., Rappuoli, R., Xu, X. N. Correlates of protection against influenza infection in humans–on the path to a universal vaccine?. Curr Opin in Immunol. 25, 470-476 (2013).
- WHO Global Influenza Surveillance Network. . Manual for the labratory diagnosis and virological surveillence of influenza. , (2011).
- Govorkova, E. A., Kodihalli, S., Alymova, I. V., Fanget, B., Webster, R. G. Growth and immunogenicity of influenza viruses cultivated in Vero or MDCK cells and in embryonated chicken eggs. Dev Biological Stand. 98, 39-51 (1999).
- Levine, M. Z., et al. Neutralizing Antibody Responses to Antigenically Drifted Influenza A(H3N2) Viruses among Children and Adolescents following 2014-2015 Inactivated and Live Attenuated Influenza Vaccination. Clin Vaccine Immunol : CVI. 23, 831-839 (2016).
- Lin, Y., et al. The characteristics and antigenic properties of recently emerged subclade 3C.3a and 3C.2a human influenza A(H3N2) viruses passaged in MDCK cells. Influenza Other Respir Viruses. , (2017).
- Lin, Y. P., et al. Neuraminidase receptor binding variants of human influenza A(H3N2) viruses resulting from substitution of aspartic acid 151 in the catalytic site: a role in virus attachment?. J of Virol. 84, 6769-6781 (2010).
- Skowronski, D. M., et al. Mutations acquired during cell culture isolation may affect antigenic characterisation of influenza A(H3N2) clade 3C.2a viruses. Euro Surveillance. 21, 30112 (2016).
- Matrosovich, M., Matrosovich, T., Carr, J., Roberts, N. A., Klenk, H. D. Overexpression of the alpha-2,6-sialyltransferase in MDCK cells increases influenza virus sensitivity to neuraminidase inhibitors. J of Virol. 77, 8418-8425 (2003).
- Oh, D. Y., Barr, I. G., Mosse, J. A., Laurie, K. L. MDCK-SIAT1 cells show improved isolation rates for recent human influenza viruses compared to conventional MDCK cells. J Clin Microbiol. 46, 2189-2194 (2008).
- US Department of Health and Human Services. . Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , (2009).
- Reed, H. M. A simple method of estimating fifty percent endpoints. The American Journal of Hygiene. 27, (1938).
- Laurie, K. L., et al. International Laboratory Comparison of Influenza Microneutralization Assays for A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and A(H5N1) Influenza Viruses by CONSISE. Clinical Vaccine Immunol : CVI. 22, 957-964 (2015).
- Lin, Y., Gu, Y., McCauley, J. W. Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay. J Vis Exp : JoVE. , (2016).
- van Baalen, C. A., et al. ViroSpot microneutralization assay for antigenic characterization of human influenza viruses. Vaccine. 35, 46-52 (2017).
