MDCK-SIAT1 hücreleri kullanarak antikor yanıt için Microneutralization tarafından insan Sera A(H3N2) virüsleri nötralize grip ölçme deneyi
Summary
Grip nötralize antikorlar grip enfeksiyonlar korunması ile aralarındaki ilişkileri belirlemektir. Microneutralization deneyleri insan sera nötralize antikor ölçmek ve sık sık grip insan seroloji için kullanılır. Biz bir microneutralization tahlil nötralize antikor titreleri çağdaş 3C.2a ve 3C.3a A(H3N2) virüs grip aşısı ya da enfeksiyon takip için ölçmek için MDCK-SIAT1 hücreleri kullanarak açıklar.
Abstract
Karşı hemagglutinin (HA) grip virüsleri nötralize antikor koruma için grip enfeksiyonları ile ilişkili olan ana Bağışıklık mekanizması olarak kabul edilir. Microneutralization (MN) deneyleri kez grip aşısı ya da enfeksiyon sonra insan sera içindeki nötralize antikor yanıtları ölçmek için kullanılır. MN deneyleri için yaygın olarak kullanılan hücre yüzey Madine Darby köpek böbrek (MDCK) hücrelerdir. Ancak, şu anda 3C.2a ve 3C.3a A(H3N2) grip virüsleri elde etmiş dolaşan reseptör bağlama özgüllük değişmiş. MDCK-SIAT1 hücre kültürünü artan α-2,6 sialik galaktoz moieties yüzeyi ile geliştirilmiş infektivite ve daha geleneksel MDCK hücreleri daha sadık çoğaltmalar için çağdaş A(H3N2) virüsler sağlamak için kanıtlamıştır. Burada, bu çağdaş A(H3N2) virüsleri nötralize antikor titreleri ölçmek için en iyi duruma getirilmiş MN tahlil MDCK-SIAT1 hücreleri kullanarak açıklar. Bu protokol için ısı inaktive sera nötralize antikorlar içeren ilk seri olarak, sonra antikor için virüs bağlamak için sera izin vermek için de grip A(H3N2) virüs/100 TCID50ile inkübe seyreltilmiş. MDCK-SIAT1 hücreleri sonra virüs-antikor karışıma eklenir ve 18-20 h 37 ° c, % 5 CO2 A(H3N2) virüs MDCK SIAT1 hücre bulaştırmak için izin vermek için inkübe. Gecede kuluçka sonra plaka sabittir ve virüs her miktar de anti-grip kullanarak bir enzim bağlı immunosorbent assay tarafından (ELISA) sayısal nükleoprotein (NP) monoklonal antikorlar. Antikor titresi nötralize ≥50% virüs infektivite inhibisyonu sağlar yüksek serum seyreltme karşılıklı tanımlanır.
Introduction
Grip virüsleri morbidite ve mortalite insan nüfusunun her yıl neden devam. HA büyük yüzey glikoprotein grip virüsleri olduğunu. Nötralize antikorlar HA hedefleme grip enfeksiyonu1,2korunması ile ilişkili olan ana Bağışıklık mekanizması vardır. Hemaglütinasyon inhibisyon (hı) deneyleri ve MN deneyleri grip enfeksiyonu veya aşı3sonra insan sera içindeki antikor yanıtları ölçmek için yaygın olarak kullanılan iki yöntem vardır. HI tahlil virüs hemaglütinasyon kırmızı kan hücrelerinin antikor inhibisyonu ölçer ve bir vekil tahlil olarak kabul edilir. HI, MN tahlil grip enfeksiyonu hücre kültürlerinde nötralize insan sera antikor düzeyleri doğrudan ölçebilirsiniz. MDCK hücreler kez grip virüsü yalıtım modunda kullanılır ve4MN deneyleri.
Grip virüsleri sürekli antijenik drift ve kaydırma mutasyonlar reseptör bağlama özgüllük virüslerin değiştirebilirsiniz HA proteinler olarak alınıyor, tabi. 2014 beri A(H3N2) virüslerin yeni kümeler ortaya çıktı ve sezon kadar dolaşmaya devam etti. Çoğunluk bu virüslerin genetik grup 3C.2a ve HA proteinlerin Filogenetik analizi dayalı 3C.3a ait. Dolaşımdaki 3C.2a virüsler kırmızı kan hücreleri hemagglutinate yeteneği azaltılmış vardı ve bu nedenle HI deneyleri5tarafından karakterize olamaz. Nötralizasyon deneyleri6hemagglutinate değil bu virüslere antikor yanıtlarını ölçmek için kullanılması gerekir. Ayrıca, çalışmalar bu çağdaş A(H3N2) virüsler önceki A(H3N2) virüsler ile karşılaştırıldığında reseptör bağlama özellikleri değiştirmiş ve adapte Kültür mutasyonlar ve in vitro hücre pasajlı zaman çok biçimlilik birikir eğilimindedir göstermiştir kültürler7,8,9. Geleneksel MDCK hücreleri ile karşılaştırıldığında, MDCK-SIAT1 Matrosovich vd tarafından geliştirilen bir hücre çizgidir MDCK hücreleri cDNA insan α2, 6-sialtransferase (SIAT1) ile istikrarlı transfection. Bu hücre kültürünü artan miktarda α2, 6 sialik galaktoz moieties ve azalmış miktarda α2, ailenin MDCK hücreleri10daha 3 sialik asit moieties ifade eder. MDCK-SIAT1 hücreleri A(H3N2) virüs MDCK hücreleri11‘ e göre yalıtım oranlarını artırmak için gösterilmiştir. Son zamanlarda, Lin vd. virüs MDCK SIAT1 hücre hatlarında MDCK hücreleri7ile karşılaştırıldığında kültürlü yaşındayken yeni ortaya 3C.2a ve 3C.3a insan A(H3N2) grip virüsleri için daha sadık virüs çoğaltmalar ve daha iyi virüs infektivite elde edildi bildirdi. Böylece, MDCK-SIAT1 hücreleri daha iyi MN deneyleri antikor yanıt A(H3N2) virüs son kümeleri için karakterize etmek için uygundur.
Burada bir MN tahlil antikor yanıt çağdaş 3C.2a ve 3C.3a A(H3N2) virüs insan sera içinde ölçmek için MDCK-SIAT1 hücreleri kullanarak açıklar. Yumurta veya hücreler virüs bu tahlil kullanılabilir. İnaktive ısı sera nötralize antikorlar içeren ilk seri olarak, sonra antikor virüse bağlamak için sera izin vermek için de grip A(H3N2) virüs/100 TCID50ile inkübe seyreltilmiş. MDCK-SIAT1 hücreleri sonra virüs-antikor karışıma eklenir ve 18-20 h 37 ° c, % 5 CO2 -MDCK-SIAT1 hücreleri enfekte ve çoğaltmak A(H3N2) virüs izin vermek için inkübe. Gecede kuluçka sonra plakaları sabittir ve her iyi virüs miktarı bir ELISA anti-grip A NP monoklonal antikorları kullanarak tarafından sayılabilir. NP tespiti antikorları nötralize yokluğu ve virüs enfeksiyonu varlığı gösterir. Antikor titresi nötralize ≥ % 50 inhibisyonu virüs infektivite sağlar yüksek serum seyreltme karşılıklı tanımlanır.
Protocol
Representative Results
Discussion
MN tahlil için grip seroloji grip enfeksiyonu veya aşı aşağıdaki antikor yanıt algılamak için kullanılan ana deneyleri biridir. MN deneyleri oluşturulan titreleri genellikle birçok grip seroepidemiology çalışma sonucunu birincil kullanılır. MN deneyleri sero-tanı ve aşı immünojenisite değerlendirilmesi için de yaygın olarak kullanılmaktadır. Uluslararası arası laboratuvar çalışmalar birden fazla laboratuvarları14‘ te gerçekleştirilen MN deneyleri karşılaştırma…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu yazının hazırlanmasında Dr. Xiuhua Lu, Dr Feng Liu ve Bayan Ashley Burroughs grip bölümü CDC onların eleştiri ve yardım için teşekkür ederiz. Biz Dr Adrian Reber grip bölümü CDC şekil 3grafik hazırlama konusunda onun yardım için teşekkür ederim. Son olarak, Dr. M. Matrosovich, Marburg, Almanya MDCK-SIAT1 hücreleri sağlamak için teşekkür ederiz.
Materials
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) with high Glucose | Life Science | 11965 | A critical component of Sterile Cell Culture, Virus Propagation and Virus Diluent Media |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30070.03 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) Fraction V, Protase Free | Sigma-Aldrich | 3117332001 | |
| L-Glutamine | Life Science | 25030-081 | |
| Sodium pyruvate | Life Science | 11360-070 | |
| Geneticin G-418 disulfate salt | Sigma-Aldrich | A1720-5G | |
| HEPES | Life Science | 15630-080 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Science | 15140-122 | |
| Acetone | VWR | 67-64-1 | Used at an 80% concentration |
| Phosphate-Citrate Buffer with Sodium Perborate | Sigma-Aldrich | SLBF2806V | |
| O-Phenylenediamine Dihydrochloride tablet | Sigma-Aldrich | SLBQ1086V | 1 tablet per 100ml of cell culture grade water |
| Sulfuric Acid | Fisher Scientific | A510-P500 | Used 0.5M final concentration |
| Ethanol, Denatured, 4L | VWR | EM-AX0422-3 | Used at an 70% concentration |
| Trypsin-EDTA | Life Science | 1748048 | |
| RDE II "Seiken" | Denka Seiken | 370013 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379-500ml | |
| Anti-NP mouse monoclonal Ab | Millipore pool | MAB 8257 MAB 8258 | |
| Anti-mouse IgG HRP | KPL | 074-1802 | |
| 96-well flat-bottom plates | Thermo Scientific | 3455 | |
| Plate reader | Molecular Device | Spectromax 384 plus | |
| Cell Culture Flask 162 cm2/Vent Cap | Corning/VWR | 3151 |
References
- Reber, A., Katz, J. Immunological assessment of influenza vaccines and immune correlates of protection. Expert Rev of Vaccines. 12, 519-536 (2013).
- Li, C. K., Rappuoli, R., Xu, X. N. Correlates of protection against influenza infection in humans–on the path to a universal vaccine?. Curr Opin in Immunol. 25, 470-476 (2013).
- WHO Global Influenza Surveillance Network. . Manual for the labratory diagnosis and virological surveillence of influenza. , (2011).
- Govorkova, E. A., Kodihalli, S., Alymova, I. V., Fanget, B., Webster, R. G. Growth and immunogenicity of influenza viruses cultivated in Vero or MDCK cells and in embryonated chicken eggs. Dev Biological Stand. 98, 39-51 (1999).
- Levine, M. Z., et al. Neutralizing Antibody Responses to Antigenically Drifted Influenza A(H3N2) Viruses among Children and Adolescents following 2014-2015 Inactivated and Live Attenuated Influenza Vaccination. Clin Vaccine Immunol : CVI. 23, 831-839 (2016).
- Lin, Y., et al. The characteristics and antigenic properties of recently emerged subclade 3C.3a and 3C.2a human influenza A(H3N2) viruses passaged in MDCK cells. Influenza Other Respir Viruses. , (2017).
- Lin, Y. P., et al. Neuraminidase receptor binding variants of human influenza A(H3N2) viruses resulting from substitution of aspartic acid 151 in the catalytic site: a role in virus attachment?. J of Virol. 84, 6769-6781 (2010).
- Skowronski, D. M., et al. Mutations acquired during cell culture isolation may affect antigenic characterisation of influenza A(H3N2) clade 3C.2a viruses. Euro Surveillance. 21, 30112 (2016).
- Matrosovich, M., Matrosovich, T., Carr, J., Roberts, N. A., Klenk, H. D. Overexpression of the alpha-2,6-sialyltransferase in MDCK cells increases influenza virus sensitivity to neuraminidase inhibitors. J of Virol. 77, 8418-8425 (2003).
- Oh, D. Y., Barr, I. G., Mosse, J. A., Laurie, K. L. MDCK-SIAT1 cells show improved isolation rates for recent human influenza viruses compared to conventional MDCK cells. J Clin Microbiol. 46, 2189-2194 (2008).
- US Department of Health and Human Services. . Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , (2009).
- Reed, H. M. A simple method of estimating fifty percent endpoints. The American Journal of Hygiene. 27, (1938).
- Laurie, K. L., et al. International Laboratory Comparison of Influenza Microneutralization Assays for A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and A(H5N1) Influenza Viruses by CONSISE. Clinical Vaccine Immunol : CVI. 22, 957-964 (2015).
- Lin, Y., Gu, Y., McCauley, J. W. Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay. J Vis Exp : JoVE. , (2016).
- van Baalen, C. A., et al. ViroSpot microneutralization assay for antigenic characterization of human influenza viruses. Vaccine. 35, 46-52 (2017).
