Summary
本文阐述了一种从骨髓细胞中提取小鼠原发巨噬蛋白的方法, 并提出了制备 BSA-脂肪酸共轭物的简便方法。然后我们证明饱和脂肪酸能诱导巨噬细胞死亡, 这种细胞死亡与神经酰胺水平的细胞积累呈正相关。
Abstract
巨噬细胞高表达表皮脂肪酸结合蛋白和脂肪脂肪酸结合蛋白。他们积极摄取饱和和不饱和脂肪酸, 这可能在调节其免疫功能方面起到关键作用。许多研究表明, 各种脂肪酸, 饱和或不饱和, 可能对细胞生长和功能有不同的影响。然而, 用于脂肪酸制备的方法各不相同, 这可能导致 non-physiological 的结果。血清白蛋白是哺乳动物外周血中脂肪酸的天然载体, 推荐用脂肪酸钠盐组成共轭络合物, 研究哺乳动物细胞中的脂肪酸功能, 从而最大限度地减少脂肪酸皂的毒性。因此, 本文提出了一种简单、相对快速的加热和 sonicating 方法, 用于 BSA-脂肪酸共轭形成。我们描述了一个协议使用饱和脂肪酸, 特别是硬脂酸, 以诱导在小鼠骨髓衍生巨噬细胞死亡严重。我们进一步证明饱和脂肪酸诱导的细胞死亡与积累的细胞神经酰胺水平呈正相关。这种方法可以扩展到研究脂肪酸对其他哺乳动物细胞的影响。
Introduction
脂肪酸在能量代谢和不同类型细胞的膜磷脂合成中起着至关重要的作用。脂肪酸具有低水溶性。适当制备脂肪酸对研究哺乳动物细胞中脂肪酸的生物学功能具有重要意义。当脂肪酸准备用乙醇, 许多脂肪酸可能显示其有毒肥皂 (洗涤剂) 对细胞膜的影响, 即使在相对较低的浓度1。作为一个天然的, 主要运输者为游离脂肪酸在血清中, 血清白蛋白被认为是一个很好的载体脂肪酸传递在体外的脂肪酸功能检测2,3,4。然而, 尽管许多使用脂肪酸的研究论文已经出版, 但关于脂肪酸和血清白蛋白共轭物的制备的细节通常是不可用的。
巨噬细胞高表达表皮脂肪酸结合蛋白和脂肪脂肪酸结合蛋白5,6,7,8。他们积极摄取饱和和不饱和脂肪酸, 这可能调节他们的免疫功能。为了研究脂肪酸对巨噬细胞和其他组织的影响, 采用了不同的脂肪酸制备方法1,7,9。使用适当制备的脂肪酸/血清白蛋白结合物来研究脂肪酸对巨噬细胞功能的影响, 对于获得具有生物学意义的数据至关重要。研究脂肪酸对巨噬细胞功能的影响, 可为巨噬细胞相关疾病的脂肪酸代谢提供基础知识和潜在的治疗靶点。
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Protocol
该议定书得到了路易斯维尔大学机构动物保育和使用委员会 (IACUC) 的批准.
1. 小鼠骨髓衍生巨噬细胞 (BMDMs)
- 安乐 6-至8周, 健康的野生型鼠标使用 CO 2 。把它钉在泡沫板上, 用70% 乙醇喷洒, 直到它被浸湿。用钳子和剪刀取出胫骨/股骨骨。用5毫升1x 磷酸缓冲盐水 (PBS) 将它们放入培养皿中。在无菌条件下执行所有程序.
- 在无菌组织培养罩中用剪刀切开胫骨/股骨骨的两端。将25克针与 PBS + 2% 胎牛血清 (FBS) 一起冲洗到15毫升管中.
- 在 500 x g、4和 #176 上离心骨髓细胞; C 为5分钟.
- 重1毫升红细胞裂解缓冲液中的细胞团溶解红细胞 (RBC) 少于1分钟, 立即用9毫升 1x PBS 稀释。再离心和在步1.3。醒酒清.
- 重10毫升 1x PBS 中的细胞颗粒, 通过不育的40和 #956 过滤细胞悬浮; #160; 尼龙网进入另一个15毫升管去除细胞碎片/团簇。再离心机作为在1.3。醒酒清.
- 重15毫升罗斯威尔公园纪念研究所中型 (RPMI) 1640 与 5% FBS 和10和 #956 的细胞颗粒; 庆大霉素, 将100毫米的组织培养皿中的细胞放在 37 o C 孵化箱中, 60 分钟. 轻轻地旋转盘子, 取出漂浮单元格, 并对它们进行计数.
- 板 6x10 6 12 毫升巨噬细胞分化培养基的100毫米盘中的细胞 (RPMI 1640 与 5% FBS 和10和 #956; 庆大霉素, 混合 30% L929 条件培养基 10 ) 与 10 ng/毫升重组小鼠巨噬细胞集落刺激因子 (M CSF) 为2天.
- 在37和 #176 中培养了2天后; C 孵化器与 5% CO 2 , 用6毫升新鲜巨噬细胞与 10 ng/毫升 M-CSF 喂养每道菜.
- 在5天, 采取8毫升的旧媒体, 而不干扰细胞和增加10毫升新鲜巨噬细胞分化介质与 10 ng/毫升 M-CSF.
- 在7天, 使用细胞提升器获取骨髓衍生巨噬细胞 (BMDMs).
注: 在 1x pbs 中, 附加的巨噬细胞也可与5毫升1毫米的 EDTA 分离, 5 至10分钟, 去除浮点数和洗涤板两次, 与5毫升 1x pbs。离心机的细胞, 在步骤 1.3., 重他们在新鲜巨噬细胞区分媒体, 并数他们与例。- 确认 BMDMs 和 #39; 表型由流式细胞仪描述为 5 。准备在一定浓度下的衍生小鼠巨噬细胞进行以下研究.
2。脂肪酸共轭制剂
- 在无菌 PBS 中制备2毫米 bsa。例如, 重6.65 克 bsa, 加入30毫升 1x pbs, 以解散, 然后添加更多的 pbs, 直到50毫升, 缩放组件, 使2毫米 bsa 在 1x pbs.
- 在2毫米 BSA 中制备5毫米的脂肪酸单独钠盐。加热到37和 #176; C 或更高, 如有必要, 几种2毫米 BSA 和脂肪酸钠的混合物, 直到得到明确的溶液为止.
注: 与不饱和脂肪酸相比, 饱和脂肪酸需要更高的温度和更超声的溶解时间. - 通过0.22 和 #956 过滤脂肪酸 BSA 溶液, 将其分为1.5 毫升无菌离心管, 并将其存储在4和 #176; c 用于短期或-20 和 #176; c 用于长期存储。4、#176 贮存后不应出现降水.
3。饱和脂肪酸诱导小鼠骨髓源性巨噬细胞死亡的研究
- 在巨噬细胞分化介质中的24个组织培养板中 BMDMs 0.4 x 10 6 /毫升.
- 将 0.4 mM 棕榈酸和硬脂酸的细胞处理为16到24小时, 在37和 #176; C 孵化器与 5% CO 2 。使用 BSA 作为负控制.
- 在治疗后用细胞升降器采集细胞, 并在 500 x g、4和 #176 中旋转细胞; C 为5分钟.
- 在100和 #956 中用蛋白 v-Alexa 488 和 7-aminoactinomycin D (7-反倾销) 对细胞进行染色; 在室温下为15分钟蛋白 v 绑定缓冲区.
- 用200和 #181 稀释样品; 蛋白结合缓冲液, 轻轻搅拌, 在潜伏期后将样品保存在冰上.
- 通过流式细胞仪来尽快分析染色细胞 5 。在 FITC 通道中检测到蛋白 V-Alexa 488, 在 PerCP/PerCP-Cy5.5 通道中检测到 7-反倾销.
4。胞内神经酰胺染色
- 在脂肪酸处理后, 在步骤3.3 中收获细胞。然后将4% 甲醛中的单元格修复为 30 min.
- 用1毫升 1x PBS 清洗样品, 在3.3 中向下旋转一步, 醒酒上清液.
- 在100和 #956 中用 anti-ceramide 原抗体 (1:200 稀释) 将细胞染色; L 1x 性缓冲30分钟
- 在步骤4.2 中再次清洗和旋转单元格.
- 在100和 #956 中用 anti-mouse IgM 二次抗体 (1:500 稀释) 将细胞染色; L 1x 性缓冲器30分钟
- 在步骤4.2 中再次清洗和旋转单元格。添加250和 #956; 1x PBS 并通过流式细胞仪分析染色细胞 5 .
注: 请参阅设备和试剂表中的详细试剂清单.
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Representative Results
肥胖会增加血清中游离脂肪酸的浓度。作为专业的吞噬, 巨噬细胞积极地服用脂肪酸来维持宿主的稳态。在这些过程中, 超负荷的脂质可能导致巨噬细胞死亡。为此, 我们培养 BMDMs体外与肥胖水平的膳食脂肪酸和测量巨噬细胞死亡使用流细胞染色。与 BSA 控制相比, 饱和脂肪酸, 特别是硬脂酸, 诱导 BMDMs 细胞死亡. 死细胞显示为双阳性种群染色的蛋白 V 和 7-反倾销 (图 1a-b)。注意, 不饱和脂肪酸并没有诱发巨噬细胞死亡5。数据显示, 游离饱和脂肪酸的浓度增加的毒性作用在体内。
同样, 使用一种巨噬细胞系, 其活性易受棕榈酸或硬脂酸的治疗5, 我们发现巨噬细胞对棕榈酸诱导的细胞死亡的敏感性也受到区域性 (图 2a)。简单地说, 在同样的文化条件下, 井中的巨噬细胞越多, 脂肪酸引起的死亡就越少。此外, 棕榈酸诱导的细胞死亡与细胞神经的累积水平 (图 2b) 呈正相关。当巨噬细胞在高密度条件下培养时, 中等营养物质的能量代谢速度更快, 这些细胞相对于低密度条件下培养的巨噬细胞更不易受到棕榈酸诱导的死亡。相反, 当细胞暴露在营养丰富的条件下 (例如, 肥胖), 过量的脂肪酸可以代谢产生有毒的神经, 从而导致脂肪酸诱导的细胞死亡。因此, 细胞培养条件可能会导致饱和脂肪酸诱导的细胞死亡的结果变化。
图 1: 高浓度的脂肪酸, 特别是硬脂酸, 诱导巨噬细胞死亡.BMDMs (天 7) 被镀作为 0.4 x 106/毫升在新鲜巨噬细胞分化介质。在细胞附着 0.5-1 h, BMDMs 被处理以每脂肪酸的指定的集中为 24 h. 单独媒介和 BSA 被使用了作为阴性控制。治疗后, 细胞被解除和收获, 然后在500克旋转下来5分钟在4° c。细胞染色 7-反倾销和蛋白 V Alexa 488 在100μ l 蛋白结合缓冲15分钟。然后在流式细胞仪分析之前, 在每个样本中加入另一个200μ l 蛋白结合缓冲器。(A)演示由脂肪酸诱导的细胞的流式细胞仪数据。(B)脂肪酸引起的细胞死亡的总结。误差线代表样本 SD。与 BSA 控制相比, 棕榈酸 (PA) 和硬脂酸 (SA) 诱导的细胞死亡具有统计学意义。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 媒体营养素的可用性影响巨噬细胞对棕榈酸诱导的细胞死亡的敏感性.(A)细胞营养状况影响其耐受饱和脂肪酸引起的压力。(B)细胞对饱和脂肪酸诱导的细胞死亡的敏感性与神经酰胺的积累细胞水平密切相关。培养基营养梯度通过在1M、2M、4M 和 8M (M=1x106) 中培养的野生型巨噬细胞系, 6 毫升 RPMI 1640, 5% FBS 和10微克/毫升庆大霉素, 用于18小时。当更多的细胞在菜肴中被培养时, 培养基的颜色就更黄了。超过90% 的细胞仍然是高度可行的。所附的可行细胞被移后, 坐在 PBS 5 分钟和 re-cultured 立即在 0.2x106/毫升在新鲜的媒体在 24-井板解除。细胞被立即用0.4 毫米棕榈酸为 18 h 使用 BSA 作为控制为每个来源 (营养素梯度) 细胞。然后, 所有处理过的细胞都被捕获并染色 7-反式细胞死亡或染色的胞内神经酰胺。自发性细胞死亡 (7-反倾销 +) 百分比小于8.6%。治疗特定细胞死亡估计为 7-反倾销 + 之间的% 差异治疗和自己的 BSA 控制(a)。治疗特异性神经酰胺水平估计为平均荧光强度 (多边组织) 之间的区别治疗和它自己的 BSA 控制(b)。实验重复进行, 并给出了有代表性的数据。错误栏代表示例 SD.请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
正确制备脂肪酸溶液对研究脂肪酸的生物学功能具有重要意义。脂肪酸的中和性增加了其在水溶液中的溶解度。然而, 我们观察到, 脂肪酸的钠盐, 特别是饱和脂肪酸, 在水或 PBS 中的溶解度仍然很低。一种方法是使用 95-100% 乙醇来帮助溶解脂肪酸1。使用这种方法, 即使在较低浓度的低毒性不饱和脂肪酸, 对细胞的毒性也会更高。另一种制备脂肪酸溶液的方法是利用甲基β-环糊精作为一个传递系统, 使脂肪酸具有最佳的条件, 在其单体形式的9,11中保留在解决方案中。用这种方法制备的脂肪酸似乎具有正常功能, 但进行这种方法比较复杂。甲基β-环糊精对细胞生长的影响是高浓度可能导致细胞死亡12。对于饱和硬脂酸和棕榈酸, 高温 (60 oC) 用于帮助增溶9。
由于血清白蛋白是一种主要的脂肪酸结合蛋白在细胞外液中, 它有助于在淋巴和血管系统中输送脂肪酸, 因而被认为是脂肪酸功能研究的天然载体。为了避免脂肪酸盐在水溶液中的低溶解度, 超声将大大促进脂肪酸与 BSA 的结合, 从而帮助脂肪酸的增溶。溶解饱和脂肪酸要比不饱和脂肪酸 (30 分钟) 的体积和浓度要长得多 (小时)。虽然加热和超声是关键的 bsa-脂肪酸共轭, 一个高温 (少于 50 oC) 建议获得明确的 bsa-PA, bsa-SA 共轭溶液, 和低温强烈建议为磷不饱和脂肪酸, 因为它们在高温下易氧化。5:2 摩尔比的脂肪酸, BSA 被认为是好与3:1 或6:1 的摩尔比, 被发布的7。这可以确保在溶液中不含完全游离脂肪酸, 以避免脂肪酸皂的毒性。BSA-脂肪酸制备这种方式似乎是稳定的解决方案 (没有沉淀, 至少) 在4° c 至少3月, 如显示在其功能的巨噬细胞死亡。密封的管的上限, 如果准备脂肪酸是不被使用了很长一段时间。
当获得 PBS 中 BSA-脂肪酸的清晰溶液时, 脂肪酸处理的一致结果更有可能得到保证。然而, 饥饿和营养充足的巨噬细胞对脂肪酸处理的反应非常不同, 尤其是饱和脂肪酸。过量的巨噬细胞比饥饿或挨饿的人更容易受到饱和脂肪酸诱导的细胞死亡, 因为渴望的新陈代谢能因其生存和生长要求而对饱和脂肪酸进行解毒。这种细胞死亡与积累的细胞神经酰胺水平密切相关。注意, 神经酰胺的毒性仅发生在细胞内神经酰胺水平达到一定的阈值。为了确保从脂肪酸治疗的巨噬细胞或任何其他类型的电池的一致结果, 细胞应培养与新鲜的媒体与丰富的养分。任何次优细胞培养条件都可能导致次优数据。
总的来说, 这些协议提供了许多必要的细节, 研究脂肪酸对巨噬细胞的影响, 其他实验室。与其他方法相比, 这种直接方法产生 BSA-脂肪酸共轭物, 而不需要使用乙醇等额外溶剂。最具挑战性的步骤是制备准确的, 稳定的 BSA-脂肪酸溶液, 因为超声产生热量, 很难控制温度。幸运的是, 不饱和脂肪酸是很容易准备在短时间内保持稳定, 而饱和脂肪酸似乎站在相对较高的温度, 因为它们是饱和和抗氧化在这种情况下。到目前为止, 我们还没有发现任何问题或限制与 BSA-脂肪酸共轭物制备这种方式。如果需要进行更敏感的实验, 就必须修改我们的协议。
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Disclosures
作者声明没有利益的财政冲突。
Acknowledgments
这项工作由路易斯维尔大学启动基金和国立癌症研究所 (R01CA177679, R01CA180986) 资助。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
CPX Ultrasonic Bath | Bransonic | Model 2800 | |
Sodium palmitate (PA) | Nu-Chek Prep, Inc. | S-1109 | M.W. 278 |
Sodium stearate (SA) | Nu-Chek Prep, Inc. | S-1111 | M.W. 306 |
Bovine serum albumin (BSA), fatty acid-free | Fisher Scientific | 9048-46-8 | |
Mouse macrophage colony stimulating factor (mM-CSF) | Cell Signaling Technology, Inc. | 5228 | |
RPMI 1640 | VWR International | 71002-878 | |
Annexin V, Alexa Fluor 488 conjugate | Fisher Scientific | A13201 | |
7-AAD | BD Biosciences | 559925 | |
Monoclonal anti-ceramide antibody (mouse IgM) | Sigma | C8104-50TST | Clone: MID 15B4 |
Goat Anti-Mouse IgM Antibody, µ chain, FITC conjugate | Sigma | AP128F | |
Fixation buffer | Biolegend | 420801 | |
Permeabilization buffer | Ebioscience | 4307693 | |
Red Blood Cell Lysis Buffer | Sigma | 11814389001 | |
Annexin V Binding Buffer | BD Biosciences | 556454 | |
L929 cells | ATCC | CCL-1 | |
Corning Cell Lifter | Fisher Scientific | 07-200-364 | |
Note: M.W. is for molecular weight. |
References
- Martins de Lima, T., Cury-Boaventura, M. F., Giannocco, G., Nunes, M. T., Curi, R. Comparative toxicity of fatty acids on a macrophage cell line (J774). Clin Sci (Lond). 111 (5), 307-317 (2006).
- Simard, J. R., Zunszain, P. A., Hamilton, J. A., Curry, S. Location of high and low affinity fatty acid binding sites on human serum albumin revealed by NMR drug-competition analysis. J Mol Biol. 361 (2), 336-351 (2006).
- Penn, A. H., Dubick, M. A., Torres Filho, I. P. Fatty Acid Saturation of Albumin Used in Resuscitation Fluids Modulates Cell Damage in Shock: In Vitro Results Using a Novel Technique to Measure Fatty Acid Binding Capacity. Shock. , (2017).
- Vusse, G. J.
Albumin as fatty acid transporter. Drug Metab Pharmacokinet. 24 (4), 300-307 (2009). - Zhang, Y., et al. Adipose Fatty Acid Binding Protein Promotes Saturated Fatty Acid-Induced Macrophage Cell Death through Enhancing Ceramide Production. J Immunol. 198 (2), 798-807 (2017).
- Zhang, Y., et al. Epidermal Fatty Acid binding protein promotes skin inflammation induced by high-fat diet. Immunity. 42 (5), 953-964 (2015).
- Wen, H., et al. Fatty acid-induced NLRP3-ASC inflammasome activation interferes with insulin signaling. Nat Immunol. 12 (5), 408-415 (2011).
- Zhang, Y., et al. Fatty acid-binding protein E-FABP restricts tumor growth by promoting IFN-beta responses in tumor-associated macrophages. Cancer Res. 74 (11), 2986-2998 (2014).
- Ulloth, J. E., Casiano, C. A., De Leon, M. Palmitic and stearic fatty acids induce caspase-dependent and -independent cell death in nerve growth factor differentiated PC12 cells. J Neurochem. 84 (4), 655-668 (2003).
- Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. CSH Protoc. , (2008).
- Dansen, T. B., et al. High-affinity binding of very-long-chain fatty acyl-CoA esters to the peroxisomal non-specific lipid-transfer protein (sterol carrier protein-2). Biochem J. 339 (Pt 1), 193-199 (1999).
- Ulloth, J. E., et al. Characterization of methyl-beta-cyclodextrin toxicity in NGF-differentiated PC12 cell death. Neurotoxicology. 28 (3), 613-621 (2007).