浸透圧ストレスの分泌小胞、分泌に及ぼす影響を監視

Summary

浸透圧ストレスは、エキソサイトーシスとこの処理中に解放の神経伝達物質の量に影響します。透過型電子顕微鏡と共に電気化学的方法を組み合わせることを使用エキソサイトーシス活動、小胞素量サイズ、および神経伝達物質解放の量に細胞外の浸透圧の影響を検討することができる方法を紹介します。中に分泌します。

Abstract

分泌細胞は分泌活動と単一の開口放出イベントで小胞から解放の神経伝達物質の量を減らすことによってこの物理的なストレスに応答する高浸透圧刺激を受ける細胞のアンペロメトリー記録。浸透圧ストレス応答の細胞縮小し、仮定した細胞の細胞内分泌小胞を受けません追放の神経伝達物質の減少膜生物物理学的特性の変化のため、それが示唆されています。細胞外浸透圧ストレス。エキソサイトーシスのアンペロメトリー記録は、瞬間、小胞は細胞膜と融合が、小胞の融合が発生する前に小胞のコンテンツに情報を提供しませんが細胞からリリースが何を監視します。したがって、あるアンペロメトリーを組み合わせることで細胞の開口放出を発生する前に、分泌小胞を特徴付けることができる他の補完的な分析方法と記録、どのように分泌小胞を調べるための広範な概要を提供していますと、高浸透圧刺激による開口放出プロセスを受けます。ここで分泌小胞サイズや神経伝達物質の変化を特徴付けるアンペロメトリーを利用した細胞内電気化学フローサイトメトリーと透過電子顕微鏡 (TEM) イメージング記録を補完するを使用する方法について述べるクロム親和性細胞浸透圧ストレスへの暴露の前後分泌活動に関連して。すべての 3 つの分析方法を用いた実験から得られる定量的な情報をリンクすることによって結論は以前に行われたサイズで縮小する小胞素量サイズを減らすことによって分泌小胞が細胞外浸透圧ストレスに応答します。一定の小胞神経伝達物質濃度を維持します。したがって、これはなぜ小胞、浸透圧ストレス応答削減量神経伝達物質分泌のリリース時に発表に関するいくつかの明確化を提供します。アンペロ メトリック録音をここで示すときに置かれた細胞は、等張性の環境に戻されます、高浸透圧刺激神経伝達物質を充てん後、これは可逆過程とその小胞。

Introduction

副腎髄質の細胞は、神経伝達物質分子を血流に放出神経内分泌のセルです。これはドッキングを含む細胞プロセスとエキソサイトーシスと呼ばれるプロセスの細胞外空間に小胞からコンテンツのリリースで、その結果神経伝達物質で満たされた小胞の融合により発生します。クロム親和性細胞内伝達物質 (アドレナリン、ノルアドレナリン)、積極的に大きい密中心の小胞 (LDCVs) に膜タンパク質によって運ばれ、高濃度 (~0.5-1 M)^1,2に格納されます。クロモグラニン蛋白質 (~ 169 mg/mL)^{3,4,5 から成る小の密度の高い核蛋白質のマトリックスへのカテコールアミン分子の親和性、LDCVs の中の神経伝達物質の蓄積は、します。 ,6}、および ATP (125-300 mM)⁷Ca^{2 +}などの小胞にカテコールアミンの読み込みとストレージの主要なコンポーネントを含む小カクテル ソリューション (ソリューション 〜 40 mM で 50-100 μ M が行き、たんぱく)⁸、⁹Mg^{2 +} (5 mM)、アスコルビン酸 (10-30 mM)¹⁰、および ~5.5^11,12の pH。にもかかわらず、ベシクル内理論の溶質濃度を合計 750 mM 以上まで、LDCVs は細胞細胞質 (310 mOsm/kg)¹³iso 浸透圧条件を維持します。小成分の組成はのみ読み込みと、カテコールアミン、溶質の集計ストレージの密度の高い核蛋白質のマトリックスに必要ではありません。これが激減する小胞の浸透圧が大幅に低下し、エキソサイトーシス^5,6時にリリースされる量カテコールアミンに影響を与えることができます。

高細胞外浸透圧分泌活性を阻害してシングルから分泌される神経伝達物質の数が減るに電流記録によるエキソサイトーシス過程に及ぼす細胞外の浸透圧の研究が報告されています。小胞の区画^{4,14,15,16,17,18,19}。これらの観察の説明は、高分子の細胞細胞質阻害小胞融合イベントの数に影響を与える膜生物物理学的特性の変化の可能な強化に推測しています。エキソサイトーシス時解放の神経伝達物質。これらの考えは、高い細胞外浸透圧ストレスがトリガー エキソサイトーシス^14,の前段階で小胞のコンパートメントに格納されている神経伝達物質の分子の数を定義する小胞素量サイズを与えないことと見なされます^{15,17,19,20,21}. 単一細胞における分泌リリースのアンペロ メトリック測定、炭素繊維ディスク電極は実験的にシナプス構成を模倣したセットアップを作成する細胞表面と連絡を密に配置されます場所、アンペロ メトリック電極は、シナプス後の検出器 (図 1)^22,23として機能します。開口放出する細胞を刺激することによって細胞膜と融合し、細胞外スペースに一部またはにおける小胞の内容を解放する神経伝達物質で満たされた小胞を引き起こすことができる 1 つ。酸化還元電位は 700 mV vs 銀/塩化銀参照電極を適用することによって神経伝達物質 (例えばカテコールアミン) ゲルロボット場合電気化学電極の表面でこれらの神経伝達物質の分子を検出できます。.その結果、電流スパイクのシリーズは、個々 のエキソサイトーシス イベントの検出をマークします。アンペロ メトリックの記録で時間トレース対電流から各単一電流スパイクの下の領域はエキソサイトーシス イベントごとに検出した電荷を表し、リリース、ファラデー方程式を用いた神経伝達物質のモルに変換することができます。したがって、アンペロ メトリック録音単一開口放出イベントから追放された量の神経伝達物質の定量的情報を提供、エキソサイトーシス イベントの頻度に関する報告書が分泌小胞に関する定性的情報はありません。小胞の融合および神経伝達物質のリリース前にコンテンツが開始されました。

したがって、セルにどのように分泌小胞のより良い理解を得るため細胞質に応答細胞外浸透圧ストレス、開口放出を受けるセルを発生する前にこの情報を豊かにする他の補完的な手法を使用できます。例えば、化学固定後細胞の小胞の大きさを測定するため、調べるため浸透圧ストレス小胞のボリュームを変更する場合、透過型電子顕微鏡 (TEM) を画像解析を使用できます。浸透圧ストレス小胞素量サイズに影響を与える場合を調べると、細胞の電気化学的フローサイトメトリーと呼ばれる最近開発されたアンペロ メトリック手法を小胞の分泌小胞神経伝達物質コンテンツの定量化のため適用できるのまだ²⁶生きた細胞の細胞質に存在するときの本来の状態。細胞内電気化学フローサイトメトリー法でナノ針状円筒炭素繊維電極優しく 700 mV の電位をこの電極に適用することによってと生きた細胞の細胞質に挿入されます (対銀/塩化銀参照電極)、衝突、吸着、電極表面で破裂その後確率的とに対してその内容を解放単一の小胞からの酸化還元電流スパイクの検出によって小胞のカテコールアミンの量を定量化することができます、電極表面²⁶。したがって、時間トレース対現在の電流に各単一の小胞の連動イベント過渡電流に可能性があり、各電流スパイクの領域を統合することにより小胞素量サイズは Faraday´s 法を使用して計算することができます。

したがって、細胞の電気化学的フローサイトメトリーで記録された小胞素量サイズ分析と共に電子顕微鏡イメージングを用いた小胞サイズ測定から得られる定量的な情報をリンクすることにより小胞神経伝達物質濃度ことも決定されます。これは細胞がさまざまな浸透圧条件にさらされる小胞のキャラクタリゼーションをことができます、どのように小胞の開口放出する前の段階で細胞外の浸透圧ストレス応答可能性がありますに良いビューを提供します。これらの測定値から相対変化に関する定量的な情報を比較することを示す、細胞外の高浸透圧の存在下での小胞が縮小し、素量サイズ調整からこれらの方法を組み合わせて結果を示しています。縮小中、小胞は、その内容と定数神経伝達物質濃度²⁴を維持するためにサイズを調整します。したがって、このような理解、浸透圧ストレスにさらされた細胞の伝達物質の放出は、観測への接続です。これらのプロトコルで細胞外浸透圧に対応するネイティブ環境でどのように分泌小胞のキャラクタリゼーションと分泌に及ぼすこの応答を許可するこれらの 3 つ補完手法の使用について述べるプロセス。エキソサイトーシス²⁴の高浸透圧の影響について私たちの前の観察、に加えて高浸透圧刺激と髄質で複数のバリウム刺激の効果の後細胞回復を記述する追加の実験を提案します。セルです。

Protocol

1. 副腎から酵素消化によって牛クロム親和性細胞の培養

1. 採集されたウシ副腎髄質細胞を分離するには、細胞 70% エタノール溶液を滅菌します。離れて脂肪と結合組織をメスを使用してトリミングします。血液を削除するには、37 ° c. に恒温されているロックのソリューション (塩化ナトリウム 154 mM、KCl 5.6 mM、NaHCO3 3.6 ミリメートル、ヒドロキシエチル piperazineethanesulfonic 酸 (HEPES) ph 7.4 5.6 mM) を使用して副腎静脈をすすいでください。
2. 組織を消化するため暖かい無菌ろ過 0.2% コラゲナーゼ P ソリューション副腎静脈注射器を使用しての約 2.5 mL を注入することにより各腺をふくらませ、37 ° C で 20 分間組織を孵化させなさい髄質の消化プロセスが完了したことを確認するために腺を調べます。組織には、ソフトでない緊張を感じるはずです。
3. 長手方向に腺を離れて切り取ることによる消化の延髄を収集します。メスを使用して髄質のティッシュをミンチします。鋼のふるい上組織懸濁液をフィルター処理し、コラゲナーゼ p. の活動を減らすために容積で約 50 mL にロックのソリューションで希釈
4. 室温で 10 分間遠心分離機で 300 x g で細胞のペレット 50 mL 滅菌試験管に収集しています。20 mL ロックのソリューションで得られたペレットを再停止し、チューブに滅菌 100 μ m ナイロン メッシュ ソリューションをフィルターします。
5. 滅菌 Percoll (1:1) とクロム親和性細胞懸濁液を混合し、室温で 20 分間 18,600 x g で細胞液を遠心分離します。密度勾配の最上層を収集し、ソリューションをチューブに 100 μ m ナイロン メッシュ フィルターします。
6. Percoll を除外すると、再ロックのソリューションにペレットを中断する前にロックのソリューションと 300 x g で室温で 10 分間遠心する細胞懸濁液を希釈します。孤立した細胞懸濁液の推定の細胞密度は約 400 万セル/mL です。
7. 分泌と細胞内フローサイトメトリー測定電流記録、プレート髄質細胞コラーゲン IV の約 17.5 × 10³セル/cm²の密度で 60 mm プラスチック製の食器をコーティングし、5% CO₂の 37 ° C で細胞をインキュベート環境。細胞培養の 1-3 日以内電気化学の実験を実行します。
8. TEM のイメージング実験、プレート 75 cm²細胞培養フラスコ フラスコあたり 700 万セルの密度でのクロム親和性細胞と 1 日 37 ° c 5% CO₂環境で孵化させなさい。

2. 単一のセル エキソサイトーシス アンペロメトリー実験²⁴

1. これらの実験のための炭素繊維電極を作製するには、これらの実験で使用される頭の段階で電極ホルダーに適した外径のキャピラリーのガラスを取る。1.2 mm の外径と内径 0.69 mm のホウケイ酸ガラス管を使用します。
   1. 水吸引チューブ毛細血管の先の 1 つに接続します。ホワイト ペーパー、可視化を強化する部分など、何かに 5 μ m 径のカーボン繊維を配置します。
   2. 単一炭素繊維を識別し、毛細血管のオープン エンドの位置づけが炭素繊維の自由な端への近さの場所に炭素繊維を維持する指の 1 つの端の繊維を押しします。炭素繊維は、毛細血管の両端を通って突き出るようにそっとガラス管に炭素繊維を吸引します。吸引力を離れて移動します。
2. マイクロ ピペットの引き手に炭素繊維と毛細血管を配置、2 つの独立したガラスのピペット チップにガラスの毛管を引き出します。2 枚のガラスのチップ間接続されている炭素繊維を切断するには、炭素繊維をカットして、2 つの炭素繊維電極はさみのペアを使用します。
3. 顕微鏡で繊維はメスを使用してガラス毛細管塗布から拡張してどこの端カーボン繊維の手動切断ができる厚い顕微鏡スライド上に炭素繊維を配置します。
4. ガラス コーティング炭素繊維先端を残して、炭素繊維を切断した後 10 分間エポキシをプルアップし、炭素繊維と周囲のガラスの間の任意の可能なオープン スペースをシールするエポキシ ソリューションに電極先端部の数 mm を挿入します。電極の先端に形成からかさばるの接着剤の低下を防ぐためにエポキシ ソリューションからゆっくりと電極を持ち上げます。
5. 電極をアタッチできる両面粘着耐熱テープでホルダー (例えば、フラット棒) 電極を配置します。100 ° C のオーブンで一晩処理エポキシ電極を焼くヒント簡単に中断する場合は、サーフェスと接触する電極は電極をように常に安全に保存されて電極は固定されています、ヒントでは触れられることはリスクはホルダーを使用して。
6. 平らなディスク電極表面を得るためには、microgrinder のホルダーに電極を配置および 45 ° の天使に各炭素繊維電極をベベルします。べべリ ン グ後、永久的なマーカーを使用して、後で開口放出測定用細胞の近くに電極を配置するときに 45 ° の角度でディスク電極表面を見つける方法を知っているその表面毛細血管をマークします。
   注: この手順はこれらの実験のように重要な楕円形ディスク電極はフラット ペトリ皿の表面に平行な表面のセルの上に配置する必要があります。また、面取り電極は、新鮮できれいな電極表面をことを確認するための実験と同じ日に行われます。
7. 使用前に循環ボルタンメトリーを用いる現在の定常状態を監視する (例えば、PBS バッファー (pH 7.4) の 0.1 mM ドーパミン) テスト ソリューションの各炭素繊維電極を配置します。サイクリックボルタンメトリー スキャン適用三角形の潜在的な波形-0.2 0.8 V に V から取得する良い反応速度データを確保するため 100 mV/秒で銀/塩化銀参照電極対が 5 μ m 径ディスクの理論的に計算される値と一致して炭素繊維電極²⁵。
8. エキソサイトーシスのアンペロメトリー記録、倒立顕微鏡上にクロム親和性細胞をシャーレに配置します。録音、測定されている非常に小さな電流で誘導される電流中に電子ノイズを除去するためにファラデーケージとセットアップ顕微鏡をシールドすることが重要です。細胞実験中に 37 ° C の温度を維持するためにステージを加熱顕微鏡を使用します。
9. 低騒音パッチ クランプ計測器を使用して 700 の潜在的な定数を適用する作用電極からシャーレにも配置されている銀/塩化銀参照電極に対して作用電極で mV。記録クロム親和性細胞の開口放出、10 kHz の信号をデジタル化し、内部ローパス 2 kHz の記録された信号をフィルターでベッセル フィルターを適用します。
10. アンペロ メトリック単一細胞記録を実行するには、電気化学測定装置で使用されるヘッド ステージの電極ホルダーに新鮮な面取り及びテスト炭素繊維ディスク電極をマウントします。
    1. 優しく、フラット楕円形ディスク形状電極表面の方を向いて、細胞の頂端表面に電極を配置し、マニュピュレーターを使用して細胞膜と接触する電極を配置します。
    2. 細胞膜上に配置する際に電極による細胞変形を監視することにより電極からセルまでの距離を調整し、セルが元のセル形状に近い形状を取り戻す距離に電極を慎重に撤回し.速度論的および定量的な記録に最適、シナプスの化学物質放出後シナプスの検出のための同じような条件である別の電極とセルの表面に 100 ナノメートルの薄い液膜を作成します。
11. 先端サイズ 2-3 μ m の直径、任意のソリューションに影響を与えるピペット チップからの漏れを防ぐために、セルから少なくとも 20 μ m の距離で 5 mM BaCl₂液でいっぱいのガラス マイクロ ピペットの位置、開口放出する細胞を刺激する、実験し、5 mM 開口放出する細胞を刺激するために細胞表面の BaCl₂ソリューションの 5 秒噴射パルスを適用します。
12. エキソサイトーシス過程における浸透圧のリバーシブルの影響を研究する 310 mOsm/kg iso 浸透圧と調整することで高張バッファー等張緩衝液 (150 mM NaCl、KCl、1.2 mM MgCl2、5 mM グルコース 10 mM HEPES、5 ミリメートル pH 7.4) の準備、730 mOsm/kg に対応する、浸透圧と等張緩衝液の NaCl 濃度。
13. 張バッファー内セルを置き、約 3 分間開始エキソサイトーシス活動中に電流の過渡電流を記録しながらバリウム注入パルス印加による開口放出する細胞を刺激します。
    1. 高張状態に等張状態で分泌応答を比較するには、高張緩衝液で 10 分間細胞をインキュベートし、その後バリウム注入パルス分泌を刺激し、電流記録の 3 分を実行するを適用します。
    2. 細胞の可逆的反応、等張緩衝液で 10 分間再度セルを孵化させなさい、5 s を適用することで細胞を刺激するため、バリウム注入パルスし、細胞から開口放出の応答を記録する 3 分を実行します。
14. 同じ BaCl₂刺激細胞に置かれた張バッファーの複数のバリウム刺激によって分泌活性に及ぼす影響を決定するための制御実験を実行から 3 回連続してエキソサイトーシス リリースのアンペロ メトリック記録と同じ時間プロトコルを使用して、異なる浸透圧で連続細胞培養実験のため。

3. 細胞内電気化学 Cytometry^24,26

1. 小胞素量サイズ計測用電極を作製するには、のと同じ素材を使用し、セクション 2.1 と 2.2 アンペロ メトリック エキソサイトーシスの電極作製の説明によると炭素繊維電極を直径 5 μ m を準備を開始測定。
2. 顕微鏡で 30 から 100 μ m まで長さの炭素繊維はガラス先端から突き出してするのでガラスの先端から炭素繊維拡張カットにメスを使用します。
3. 炭素繊維電極の炎エッチング先端を準備、ブタン炎を使用します。均等にエッチングを達成するために円筒形電極チップ、それを回転させながら円筒形炭素繊維電極を保持して、炭素繊維から延びるガラス ブタン炎の青の端にカーボンの先端開発赤まで配置色。これがかかる未満 2 s。正常終了した場合は、(そのような先端の SEM のイメージは図 5Bに示すように) 直径 50 ~ 100 nm のエッチング電極先端サイズでこの結果します。炎は、エッチング、電極先端部を評価する顕微鏡下で電極を配置します。
4. 3 分、15 秒浸漬電極先端部のアセトン溶液に続いてエポキシ ソリューションに円筒形のナノ針状電極を挿入します。これにより中アセトン クリア エッチング炭素繊維電極表面をエポキシ樹脂炭素繊維と絶縁ガラス毛管壁の間の潜在的なギャップ空間を密封するエポキシです。エポキシを治すためには、100 ° C で一晩オーブンで電極を焼く
5. 2.7 のセクションで説明したように、各炭素繊維電極の定常電流のテストを使用する前に循環ボルタンメトリーを用いるします。実験、高原の周り現在の表示電極のみ使用 1.5 2.5 nA²⁷。
6. 細胞間電流測定、2.8 で説明されているように、顕微鏡でセルを配置し、ポテンシオスタット 2.9 で説明したようの同じ実験的設定を使用します。
7. 細胞内電流測定を実行し、セルに重要な物理的な損傷を防ぐために、ナノチップ円筒電極をセルに追加することによって挿入します. 穏やかな機械力、細胞プラズマ電極をプッシュするのに十分で、膜とマニュピュレーターを使用してセルの細胞質に。
8. 挿入後との円筒電極封入細胞膜は、生細胞でその場でアンペロ メトリック録音を開始します。酸化電位電極に適用されている、小胞が電極表面に吸着し、確率的破裂します。 したがって、このプロセスを開始する刺激のあらゆる種類の必要はありません。
9. 浸透圧に及ぼす影響小胞素量サイズを判断するには、等張および高張バッファーのセクション 2.13 で前述の実験条件を使用してに培養されている細胞のグループから細胞のフローサイトメトリー測定を収集します。

4 アンペロメトリー録音のデータの分析

1. 分泌と細胞内小胞素量サイズ分析から記録された電流データを解析する、その動力学的時間トレース対記録電流の過渡電流の解析を可能にするソフトウェア プログラムを使用して、ピークのパラメーターと個々 の電流ピークの統合された合計の料金を確認できます。データ分析のためイゴール²⁸データ解析プログラムの書き込まれた Sulzer ラボで開発されたソフトウェアを使いました。
2. スパイク、アンペロ メトリックを分析するときは、3 回根意味正方形 (RMS) 標準偏差の各録音のノイズのピークのしきい値の制限を選択します。
3. ガウス形状に従う、差し込みエキソサイトーシス イベントの結果、3 回のしきい値を持つガウス形スパイクを受け入れることができるスパイクをダブルクリックしないでください偽のスパイクを防ぐために手動でそれぞれの細胞の記録から電流スパイクを収集します。RMS ノイズよりも高い。
4. 単一電流あたりの合計料金でデータのピークし、ファラデー法を使用して収集 (N = QnF) エキソサイトーシスまたは N はモルの単一細胞内の小胞破裂イベントごとに検出したカテコールアミン神経伝達物質のモルの量を計算するにはQ 電極表面でのレドックスの反作用を通過して神経伝達物質各スパイク、n 中に検出された合計の料金を = = 電子酸化還元反応で転送の数 (n = カテコールアミンの 2) と Faraday´s の定数 F = 96485 C/mol。
5. 最初にセルごとにイベントごとに検出した平均の料金を計算することによって収集されたデータの統計分析を実行します。[セル間の差異、セル間の平均料金の計算し、分散が等しくないと仮定するとセル間スチューデントの t 検定を使用します。この調査は、統計分析のための MATLAB プログラムを使用しました。

5. TEM 画像小胞サイズ分析

1. 異なる浸透圧条件下での細胞の電子顕微鏡イメージングを実行するには、セルの化学固定の前に 5% CO₂環境で 37 ° C で 10 分間のアイソトニックまたは高張バッファー内セル孵化させなさい最初。
2. Karnovsky 固定法²⁹を使用してセル固定を実行します。このメソッドを使用して、0.01% アジ化ナトリウム、1% ホルムアルデヒドおよび 4 ° C でサンプルを格納できる 1.25% グルタルアルデヒド溶液とセルを孵化させなさい
3. 固定後、0.15 M ナトリウム cacodylate バッファーを持つセルを洗浄します。
4. 細胞を染色するには、サンプルは固定の記事し、透過電子顕微鏡イメージング用の準備、4 ° c、暗闇の中で常温 0.5% ウラニル酢酸溶液で 1 h 2 h 1% オスミウム四酸化ソリューションで細胞をインキュベートします。
5. 最終的な固定の手順でまず 100% エタノールでセルを洗浄によって細胞を脱水してアセトンでセルをすすいでください。
6. エポキシ樹脂の細胞サンプルを埋め込むとその後 30-40 分間 4,000 x g で遠心分離を行うし、60 ° C で 48 時間培養 15 h の 40 ° C で重合するセルのサンプルを許可します。
7. イメージングの準備で、セルのサンプルのセクションに埋め込まれた寒天 100 樹脂スライスに、厚みは 60 nm、ウルトラミクロトームを使用します。
8. 20 続いて 4 分 4% ウラニル acetate/25% エタノール溶液セルを対象水で洗浄の s。レイノルズ鉛クエン酸 3 分、20 の順でセルを洗浄して水で洗浄の s。
9. 細胞試料の透過電子顕微鏡イメージングを実行します。実験では、120 で運行されており透過型電子顕微鏡を用いて kV。
10. 細胞の細胞内小胞の人口を表示するセル超微細構造を示すセル セクションの各記録された画像から最初各 TEM 像で記録されたスケール バーに関してピクセルで画像のピクセル サイズを調整します。アイソトニックまたは高張の条件にさらされる細胞の各画像で小胞のサイズを決定するのにには、イメージング ソフトウェアを使用します。実験の結果, 画像解析ソフトウェア ImageJ を使用しました。それは、細胞の電子顕微鏡画像からの細胞の微細構造の画像解析、細胞の断面の厚さに基づいてこれらの測定のサイズ調整する必要がありますとみなされ、以前 Almers´s ラボ³⁰によって記述されている注目に値するです。

Representative Results

我々 はここに一緒に 2 つの電気化学的方法、炭素繊維アンペロメトリーと細胞内電気化学フローサイトメトリー電子顕微鏡イメージングを組み合わせることの効果をほのめかしているより広範なビューを得る情報を提供方法のプロトコルを記述します。分泌小胞のエキソサイトーシス過程の細胞外浸透圧。分泌活動の大幅な削減実験 (図 1に示すように) 設定を使用して単一のクロム親和性細胞の開口放出リリースの代表的なアンペロ メトリック録音を比較すると、細胞が浸透圧にさらされたときに表示されました。(図 2 a)²⁴アイソトニック状態の細胞と比較して強調します。合計の料金は、スパイクだった異なる細胞に単一の小胞のエキソサイトーシス イベントから追放された分子の数を計算するために使用を現在それぞれの個々 の電流によって検出されたこれらの録音から Faraday´s 法を使用して、浸透圧条件。比較では、現在平均電流の小さい面積で図 2 bに表示されるスパイクによって検出された高張液で細胞が少ない神経伝達物質分子が細胞浸透圧ストレス^{24 をセンシングによって各小胞から解放されました。}.

アンペロ メトリック エキソサイトーシス高張環境にさらされた細胞で、その後、細胞を等張に配置した後での録音を行ったリリース神経伝達物質の分子の数のこの低下の可逆性を調べるには、環境。これらの実験でクロム親和性細胞が刺激された BaCl₂ソリューションを 3 回連続して: 最初張バッファー内に続いて 2 番目の刺激による細胞培養の高張液と最終的に、3 分の 1 10 分後等張性の条件で 10 分細胞培養後刺激。結果図 3 aに表示される提示細胞を等張状態で最初の Ba^{2 +}刺激に比べて高張状態にさらされたとき、解放の神経伝達物質の量は ~ 50% 減少しました。その後、細胞が等張性環境に戻さし、3 番目の Ba^{2 +}刺激を受ける、エキソサイトーシス イベントごとリリース量の神経伝達物質が最初の刺激で記録された元の金額に戻って逆転したが以前観察¹⁴を確認しました。アイソトニック状態でセルの 3 つの連続した Ba^{2 +}刺激制御実験 (図 3B参照) 等張状態で複数のシーケンシャル Ba^{2 +}刺激した量の神経伝達物質に変更しないことを示すエキソサイトーシス時リリースします。これは素量サイズを小胞は細胞外浸透圧に調整迅速かつ可逆的にことを示唆しています。

ただし、開口分泌活動の面でこれらの実験から電流トレースを分析する場合は、ことが明らか、なった細胞を高張ストレスにさらされたとき図 4 aに表示される、その分泌活動を著しく妨害します。浸透圧ストレスの間に開口放出イベントは等張状態で細胞活動の 12% に減少しました。その後、高浸透圧刺激とセルは、isosmotic 環境に置かれた後、細胞は元分泌活動の 41% を回復しました。興味深いことに、制御実験は等張性の条件を示し、図 4 bに表示される、3 つの連続した BaCl2 刺激を実行した後エキソサイトーシス イベントの頻度 % に減少した 53 第 2 刺激後に実行さらに 3 番目の刺激による 26% 最初の刺激と比較します。したがって、明確な連続 Ba^{2 +}刺激、エキソサイトーシスがトリガーされますが、大幅小胞リリース プロセスの効率に影響を与えているときにそれぞれの小胞から解放の神経伝達物質の数に影響していないようです。

どのように分泌小胞を調査する彼らのネイティブ環境を小胞ボリュームの面で細胞外の浸透圧ストレス受けますまたは素量サイズ、小胞サイズ分析電子顕微鏡イメージングを用いた細胞で細胞内電気化学フローサイトメトリーと組み合わせて等張および高張状態にさらされます。等張および高張のソリューションに配置する (、図 5に示すように)。 ライブのクロム親和性細胞の細胞質に挿入された炭素繊維ナノ針状電極電気化学的細胞のフローサイトメトリー実験で結果として得られる電流電流スパイクは衝突、吸着、確率的破裂と²⁶を破裂時に電流電極の表面で小胞の内容を解放細胞の細胞内各小胞の監視だった。統合の総充満時間トレース電流のピークの検出は、Faraday´s 法による記録の各セルの平均小胞素量サイズを計算する使用されました。これらの細胞内電気化学フローサイトメトリー測定では、図 6に示すと図 7 b、浸透圧ストレスにさらされた細胞小胞素量サイズを大幅に削減されたことを示したアイソトニック状態の細胞に比べてください。細胞外浸透圧ストレスが発生して細胞にエキソサイトーシス時リリース神経伝達物質の量の小数の減少に、細胞内の電気化学的フローサイトメトリーによって測定された小胞素量サイズの変化の大きさの比較、アイソトニック状態 (図 7)²⁴の細胞と比べて 60% 素量サイズでリリース量の神経伝達物質の相対的な減少を示した。等張および高張細胞の小胞のサイズを決定する小胞素量サイズで調整を浸透圧が発生して細胞の小胞神経伝達物質濃度の潜在的な変化に関連するには、電子顕微鏡画像の解析を行った条件。さらに、暗い球膜小胞と TEM 画像で視覚化である密度の高い核タンパク質マトリックス、LDCVs 中の暗い染色は、これらの小胞の密度の高い核マトリックスの体積を測定していました。図 8に示されるように、小胞サイズはアイソトニック状態の細胞と比較して細胞外浸透圧ストレスにさらされた細胞で 60% に減少しました。LDCV と密度の高いコアの計測された直径の計算された容積、周囲のハロー ソリューションのボリューム表示されるから TEM 画像で LDCVs 内の明確な解決策を求めたもよう。TEM 画像解析から集計結果を示した、図 8に表示されるそれは主に細胞外の高浸透圧刺激の中には、LDCVs の 『 halo 』 ソリューションのボリューム減少²⁴。

図 1: 単一のセル エキソサイトーシス アンペロメトリー 。シングル髄質で開口放出のアンペロ メトリック測定の実験的設定の概略図の²⁴セルします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 2: 開口放出の測定値から電流をトレースします。クロム親和性細胞や高張 (赤い色) 細胞環境等張性 (ブラック カラー) で開口放出( A) 代表的な電流記録。(B)等張性 (黒) のクロム親和性細胞の開口放出測定から平均電流スパイクの拡大と高張 (赤) の細胞外の環境の²⁴。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 3: カテコールアミン エキソサイトーシスで高浸透圧刺激後にリリース数の可逆性。(A)クロム親和性細胞から開口放出中にリリースの分子数 (n = 4) 等張の最初の刺激、高張の 2 番目と 3 連続 Ba^{2 +}刺激と等張バッファーで 3 番目。対になっていない t 検定の統計の結果が表示されます。最初 Ba^{2 +}刺激 (Ba^{2 +}スティミュラス 1) 張バッファーの 2 番目 Ba^{2 +}刺激 (Ba^{2 +}スティミュラス 2) 高張バッファー内の比較のp値はp= 0.1088 とp-値3 Ba^{2 +}刺激で (Ba^{2 +}スティミュラス 3) 張バッファー内で高張液の Ba^{2 +}刺激の 2 番目の比較は p = 0.059。3 連続 Ba^{2 +}クロム親和性細胞の刺激で神経伝達物質分子の量を示す(B)制御実験 (n = 4) 張バッファー内。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 4: 分泌活動に及ぼす浸透圧。(A)分泌活動に及ぼす細胞外浸透圧はクロム親和性顆粒放出イベントの頻度として提示細胞 (n = 4) に等張液、高張、バリウム溶液で刺激が、最終的に等張状態で。値は、各セルからスパイクの数の平均値として表されます、すべてのセルの平均値 (平均 (SEM) の標準誤差) をサンプリングします。対データの t 検定を使用して変化の統計的有意性を提示 (等張 Ba^{2 +}刺激 1 と高張 Ba^{2 +}刺激 2 のp値はp= 0.0126 p-値の比較のため高張 Ba^{2 +}刺激 2 とアイソトニック Ba^{2 +}刺激 3 はp= 0.037)。クロム親和性細胞に 3 つの連続したバリウム刺激後エキソサイトーシス イベントの頻度を提示(B)制御実験 (n = 4) 等張状態で。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 5: 小胞素量サイズの変更を監視する細胞内の小胞電気化学フローサイトメトリー。(A)細胞内電気化学フローサイトメトリー用セットアップ実験の模式図。(B)典型的なタングステンナノ円錐形の炭素繊維電極²⁴の走査型電子顕微鏡画像。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 6:細胞内電気化学フローサイトメトリー測定表示等張 (黒) のクロム親和性細胞で細胞内電流フローサイトメトリー録音の(A)代表的なトレースおよび高張 (赤) の細胞外の環境。(B)等張性 (黒) のクロム親和性細胞で細胞のフローサイトメトリー測定から平均電流スパイクの拡大と高張 (赤) の細胞外の環境の²⁴。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 7: カテコールアミン開口放出、小胞素量サイズの決定リリース数の定量化します。(A)分子の等張性のクロム親和性細胞で分泌録音中にリリースの平均数 (n = 22) および高張 (n = 20) 環境。値は、各セルから開口放出イベントごとリリース、サンプリングされたセル (± SEM) の平均分子の数の平均値として表されます。変化の統計的有意性は、対データの t 検定を使用して表示されます (p値 = 0.0003) (B)小胞アイソトニック (n のクロム親和性細胞で細胞内電気化学フローサイトメトリーによって検出されたあたりの分子数の平均19 =) および高張 (n = 16) の条件。値は、各セルから検出、平均スパイクあたりの分子数として示すし、(± SEM) サンプリングされたすべてのセルの平均します。対データの t 検定を使用して変化の統計的有意性を提示 (p値 = 0.0108)²⁴。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 8: 大きい密中心の小胞サイズに及ぼす浸透圧です。等張性のクロム親和性細胞の TEM 像の画像解析から attolitres (aL) で、LDCVs、密度の高いコア蛋白、高密度コア蛋白質のマトリックスを取り巻くハロー ソリューションの計算された容積を求めた (n = 12) および高張 (n = 9) バッファー。結果は、セルあたり 311 小胞の平均と単一細胞 (± SEM) から平均から収集されました。P-値が対になっていない t 検定等張および高張バッファーの比較から報告されます。P-値は 0.0385 (*) 小胞ボリューム、0.0047 (*) ハロー ボリューム²⁴芯ボリュームの 0.3967 の。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Discussion

我々 はここで、プロトコルと分泌小胞や浸透圧などの物理的な力に分泌小胞の影響のより良い理解を得るために開口放出のプロセスを分析する 3 つの補完的な分析手法を組み合わせることの利点を提示します。分泌細胞の開口放出プロセス。これらのメソッドは、エキソサイトーシス活動、彼らのネイティブ環境で小胞の素量サイズを決定するため使用すると、細胞内の電気化学的フローサイトメトリーを記録するための確立された方法である炭素繊維電極電流と透過電子顕微鏡画像解析分泌小胞のボリュームを監視します。この作品は、クロム親和性細胞を等張および高張細胞外の環境にさらされている単一の小胞のエキソサイトーシス イベントのアンペロメトリー録音から定量的なデータを収集することにより確認したその浸透衝撃を大幅に削減、量の神経伝達物質をエキソサイトーシス時リリースし、これらの細胞が可逆的に回復、場合に元の数量をリリース等張の環境 (図 3) に戻されます。

アンペロ メトリック録音は対時間エキソサイトーシス イベントの頻度の情報を提供し、したがって、細胞浸透圧の異なる環境で開口放出行為への変更を監視するも使用できます。このデータは解釈され、即座に、または時間の関数として、活動の変化が発生するかどうかを識別するために使用することができます。私達を示した前作、浸透圧ストレスは、分泌活動を妨げられているものの、容易に脱着可能な小胞²⁴プールの融合を妨げるそれは思えなかった。エキソサイトーシス アクティビティ データは、録音時間の期間中に合計の分泌活動を分析する使用できます。2 つの異なる浸透圧条件にさらされたクロム親和性細胞の開口放出の 3 分の記録から開口放出イベントの累積数をご紹介します。これらのデータは、浸透圧ストレスと細胞が細胞外の等張性環境に戻る後、このアクティビティの部分的な回復が得られることを経験している細胞の分泌活性の抑制を表示します。しかし、非常に重要なことは、制御実験は、これらの実験で使用されるタイム フレーム内で複数の Ba^{2 +}刺激により、大幅な削減が分泌活動のセルは分泌する刺激されるたびにによって引き起こされることを示した。第 3 連続した Ba^{2 +}刺激、分泌活動の 3 分の 1 が維持されていたし、明らかにバリウム、そしておそらくまたこれらの実験で刺激のタイミングは小胞サイクルに影響します。これはなぜ分泌活動は等張液の浸透衝撃後細胞回復し、これらの細胞が 3 後等張状態で細胞活性に同様の相対的な削減を表示する理由を説明するために関連する可能性があります。シーケンシャル Ba^{2 +}刺激。したがって、エキソサイトーシスのアンペロメトリー記録は分泌小胞融合細孔を介して神経伝達物質を解放する血しょう膜と融合する小胞がトリガーされた瞬間からの情報を提供します。単一の小胞神経伝達物質に関する定量的なデータを解放し、エキソサイトーシス活動の情報を収集することができます。

における小胞のコンテンツまたはコンテンツの一部が解放されるトリガーはエキソサイトーシスのモードで解放の神経伝達物質の量を調節できます。エキソサイトーシス リリース炭素繊維アンペロメトリー小胞から追放されるもののみを検出を使用して勉強だけで神経伝達物質解放の検出量の変化のトリガー モードで変更に関連している場合を区別することは困難です。開口放出、小胞コンテンツ リリースに影響を与える細胞生物物理プロパティまたは小胞素量サイズの変化に変更。したがって、細胞の電気化学的フローサイトメトリーを用いた測定とエキソサイトーシスのアンペロ メトリック記録を補完する、ことにより生きているセルで小胞素量サイズの場測定特徴できそれ故に比較するために使用、エキソサイトーシス²⁶中に小胞から小胞コンテンツ リリースの割合です。

この作品では小胞素量サイズは浸透圧ストレスによって影響を受ける場合を調査する定量化と等張および高張の条件にさらされる細胞小胞素量サイズの評価のためのこの手法を適用しました。生細胞の細胞質にナノ針状電極の挿入ではなく侵襲的と考えられている、これらの実験は細胞各 1 回実施しただけとない同じセルで繰り返されました。したがって、これらの実験は、等張および高張細胞外の環境にさらされているランダムに選択されたセルのグループから個々 の測定として優先的に実行されます。エキソサイトーシスのリリース量の神経伝達物質の変化を細胞内電気化学フローサイトメトリーによって測定された小胞素量サイズの変化を比較するための細胞内記録の実験条件に一致する 1 つを考慮し、また別のランダムなセルをエキソサイトーシスのアンペロメトリー記録を実行します。これらの実験のプロトコルも連続 BaCl₂刺激の影響を検討し、細胞のフローサイトメトリー用実験条件と一致で重要です、同じ単一セルの研究を行う場合測定。また正確な位置と電極セルに挿入するときの深さを制御することは困難であるそれは注目に値するです。したがって、各セルは、小胞素量サイズ分析のランダムなサンプルを提供します。さらに、このメソッドを使用して小胞素量サイズをプロービングなど小胞成熟度の違いを区別せず、したがって可能性がありますに追加も変動測定。細胞実験は、細胞外浸透圧にさらされた細胞小胞素量サイズに短縮されたことを示した。このメソッドによって検出された素量サイズの相対的低下は、伝達物質の放出の相対的な変化の観察エキソサイトーシス時に比べていた。この研究は素量サイズの相対的な低下が浸透圧ストレスを感知する細胞に神経伝達物質のリリースでドロップと同じ順序にあったことわかりました。

浸透圧ストレスは小胞神経伝達物質の濃度を変更するかどうかは、確認するには、小胞ボリュームをイメージング等張および高張の条件にさらされていた化学的固定のクロム親和性細胞分析 TEM を使用して行った。TEM 画像解析は、細胞が高浸透圧刺激にさらされる小胞が縮小する、²⁴定数神経伝達物質濃度を維持するために小胞素量サイズとサイズの相対的な減少が調整されていることを示した。ナノメートル画像の解像度は 2 つを区別することを提供する TEM 画像解析フェーズ、高密度コア蛋白質のマトリックスと LDCVs、内側周囲のハロー ソリューションとこうして可能密度の高い核たんぱくの量を決定するため、ハロー溶液の量を計算します。この分析から小胞容積の減少は、主に周囲の密度の高い核タンパク質マトリックス²⁴ハロー ソリューションから縮小に関連すると判断されました。

要約すると、この研究では、どのように 3 つの分析方法を示すプロトコルは、組み合わせることででき、前に神経伝達物質分泌小胞のキャラクタリゼーション リリースと何から解放されるこれらの小胞細胞がトリガーされるとどのように分泌小胞のより良い理解を得るため、細胞外ストレスによって分泌が影響を受けるような機能細胞の開口放出。このプロトコルは、どのように神経伝達物質をエキソサイトーシスでリリースの質問に答えるのために使用する可能性があり、物理的な環境の他の変化、分泌細胞に影響を与えるかもしれない潜在的な薬剤で、小胞素量サイズが影響を受けます。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaCl	Sigma Aldrich	S7653
KCl	Sigma Aldrich	P9333
NaHCO3	Sigma Aldrich	S5761
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
MgCl2	Sigma Aldrich	M-2670
Glucose	Sigma Aldrich	G8270
Collagenase P	Roche, Sweden	11 213 857 001
100-µM Nylon mesh	Fisher Sientific	08-771-19
Percoll	Sigma Aldrich	P1677
Collagen IV coated 60 mm plastic dish	VWR	354416
Centrifuge	Avanti J-20XP
Borosilicate glass capillary	Sutter instrument Co., Novato, CA
Micropipette puller	Narishing Inc., Japan	PE-21
Epoxy solutions (A and B)	Epoxy technology, Billerica, MA
Beveller	Narishing Inc.	EG-400
Inverted Microscope	Olympus	IX81
Patch clamp Instrument	Molecular Devices, Sunnyvale, CA	Axopatch 200B
Micromanipulator	Burleigh Instrument Inc., USA	PCS-5000
Butane Flame	Multiflame AB, Hässelholm, Sweden
Transmission electron microscopy	Omega	Leo 912 AB