Summary
Licuefacción del semen es necesario para liberarse del gel seminal de los espermatozoides. Este estudio proporciona los procedimientos para la recogida de semen del coito posterior al tracto reproductor femenino y medir el tiempo de licuefacción del semen.
Abstract
En ratones, el eyaculado se deposita en el útero. Después de la eyaculación, el semen cambia de consistencia de gel-como acuosa, un proceso llamado licuefacción. En este estudio, se muestra cómo recoger el post eyaculado en el aparato reproductor femenino en un modelo murino. Ratones hembra en primer lugar, adulto en la etapa de estro se alojaron en la jaula del macho durante la noche. A la mañana siguiente, la cópula fue confirmada por la presencia de copula tapón en la abertura vaginal. Ratones hembra con enchufes copulador fueron sacrificados, y cada tracto reproductivo fue recogido como un todo (vagina, útero, oviductos, ovarios), asegurando un sistema cerrado para contener el semen. El tracto reproductivo fue colocado en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, y la vagina fue cortada para liberar el semen en el tubo. Para asegurar el volumen de semen máximo para el análisis, pinzas sin dientes se utilizan para exprimir los cuernos uterinos del extremo ovárico al extremo vaginal expulsando el semen restante. El tracto reproductivo entero luego fue descartado. El tubo que contiene el semen brevemente fue hecho girar hacia abajo. Una pipeta capilar de 25 μL se colocó en el tubo en un ángulo de 180 º (paralelo a la pared del tubo). Se registró la cantidad de tiempo usada para llenar el tubo capilar hasta la 25 μL. Semen de un criador macho probado generalmente toma aproximadamente 60-180 s para llenar un tubo capilar de 25 μL. Esta técnica de recogida de semen también puede ser utilizada en otras aplicaciones posteriores como el análisis de la proyección de imagen y de la motilidad de esperma.
Introduction
El tracto reproductor femenino se compone de los tractos superiores e inferiores. El tracto reproductivo superior incluye las trompas de Falopio, el útero y el endocervix. El tracto reproductivo inferior incluye el exocérvix y la vagina. En los seres humanos, el eyaculado se deposita en la pared anterior de la vagina, junto al ectocérvix1. En ratones, sin embargo, el semen se barre en el útero dentro de minutos después del acoplamiento2.
Semen contiene gel seminal que se solidifica dentro de segundos de la eyaculación, causando el esperma para ser atrapados e inmovilizados3. Licuefacción libera el esperma inmovilizado cambiando semen de un tipo de gel con una consistencia acuosa. Este proceso es esencial para la motilidad espermática y la reproducción mamífera. Conocimiento de licuefacción del semen se basa sobre todo en vitro estudios donde se convierte en licuado de semen en una placa de cultivo. En los seres humanos, la actividad enzimática del antígeno prostático específico o PSA (peptidasa también conocido como relacionadas con la calicreína 3 o KLK3) es el principal para la licuefacción a través hidrólisis de semenogelins (gelificante proteínas presentes en el semen)4 ,5,6. Degradación de semenogelins libera el esperma del coágulo seminal, aumento de la movilidad del esperma. Liberado el nado de espermatozoides hacia la trompa de Falopio para fertilizar el huevo. Licuefacción (o viscosidad del semen) las pruebas son una de las proyecciones iniciales estándar para el análisis de semen en las clínicas de fertilidad para evaluar la fertilidad masculina7.
Un artículo recientemente publicado muestra que se pueden usar análisis de fluido seminal de la hembra del ratón tracto reproductivo postnupcial para ilustrar una deficiencia en licuefacción que posteriormente puede causar fertilidad defectos8. Licuefacción defectuoso como semen hiperviscosidad contribuye a 11.8 32.3% de los casos estériles en hombres9, sugiriendo que la licuefacción normal es indispensable para la reproducción de mamífero. Sin embargo, estudios y tratamiento de los defectos de licuefacción se han centrado exclusivamente en el hombre7. No se ha explorado la posibilidad de que el tracto reproductor femenino desempeña un papel en la licuefacción del semen. Por lo tanto, los métodos de colección de semen y medir el tiempo de licuefacción proporcionará a los investigadores una nueva herramienta de diagnóstico para determinar si la licuefacción puede ser una de las causas de la infertilidad en el organismo modelo de interés.
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Protocol
Todos los animales y los procedimientos utilizados en este estudio se manejaron según las directrices de la Comisión de uso y cuidado de animales de la Universidad de estado de Washington (WSU) y en cumplimiento de protocolos de animales aprobado WSU #4702 y #4735.
1. ratones
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Uso estándar C57BL/6J ratones machos adultos u otras cepas de interés. Mantener los animales bajo un ambiente controlado de temperatura y humedad, con acceso ad libitum de agua y alimentos.
- Utilizar mejoradores masculinos desde 8 semanas de edad hasta 10 meses de edad. Utilice sólo los criadores probados en los experimentos.
-
Utilizar ratones adultos femeninos con una canceladura selectiva del tejido del tracto reproductivo estrógeno receptor α (codificada por el gen Esr1 ) en las células epiteliales10 (Wnt7aCre / +; Esr1f/f, llamado agujero ciego o «KO») y hermanos de camada (Esr1f/f, llamado "CTRL") de control en este estudio.
- Uso de 8 semanas de edad las hembras. Las edades de las mujeres variaban según el experimento de interés.
- Determinar las etapas del ciclo estral en la mañana a las 8:00 h. Utilice sólo las hembras en la etapa de estro del ciclo. Métodos detallados de manchar vaginal y análisis citológico, se refieren a los procedimientos previamente publicados en11.
2. acoplamiento y la evaluación de tapones copulatoria
- En el día del estro (16:00 h), casa de la hembra en la jaula del macho.
- La mañana (8:00 h), separar la hembra del ratón macho.
- Utilice una adaptación de un método previamente publicado12 para acceder a la presencia o ausencia de un tapón vaginal o copula como indicación de apareamiento.
- Sostenga el ratón hembra de la base de la cola para levantar brevemente los miembros posteriores.
- Encontrar el enchufe copula por la presencia de un coágulo seminal grisáceo en la apertura vaginal utilizando un palillo de dientes. Si el aparato copulador está presente, el palillo no serán capaces de introducirse en la vagina.
3. preparación antes de la colección de tejidos
- Preparar 10 mL de medios de comunicación de Leibovitz de L-15, suplementado con 1% de suero bovino fetal (llamado L15 media + 1% FBS) en un tubo de 15 mL. Incubar los medios a 37 ° C durante 15 min en un baño de agua.
- Para preservar la viabilidad del tejido y esperma para aplicaciones posteriores, 2 mL alícuota de precalentado media L15 + 1% FBS en una microcentrífuga de 2 mL tubo para recolección de tejido.
- Caliente la etapa de Estereomicroscopio a 37 ° C. Fijar el bloque de calor a 37 º C y colocar un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL vacía en el bloque.
- Si las aplicaciones downstream requieren la proyección de imagen de la motilidad espermática, calentar lo portaobjetos de vidrio a 37 ° C.
4. tejido colección
- Traer medios L15 precalentados + alícuota de 1% FBS a la zona de recogida de tejido.
- Eutanasia a la hembra (~ 08: 30h) utilizando dióxido de carbono asfixia seguida por dislocación cervical.
Nota: Esto es aproximadamente 8 h después de aparearse, suponiendo que el apareamiento lleva a cabo a la medianoche. - Coloque el animal en posición decúbito dorsal para exponer el área abdominal.
- Rocíe alcohol al 70% en el abdomen cerca de extremidades posteriores.
- Utilice las tijeras de disección realice un corte pequeño (~ 1 cm) en la piel del abdomen inferior.
- Utilizar la mano dominante para tirar de la cola (y extremidades traseras si es necesario) mientras que la mano no dominante tira la piel en la dirección opuesta (hacia la cabeza) para exponer el músculo abdominal. Este método se utiliza para minimizar la cantidad de contaminación de pelo a los órganos viscerales.
- Cortar el músculo abdominal en forma de V en la base del abdomen, junto a la vagina, para exponer los órganos viscerales.
- Mover los intestinos y grasa abdominal al lado para exponer el tracto reproductivo.
- Recorte de vejiga y otros tejidos por encima de la zona vaginal.
- Cortan sínfisis púbica para tener acceso al tejido vaginal.
- Levantar el tejido vaginal en la abertura vaginal y usando tijeras para separar la vagina el tejido rectal.
- Recorte cuidadosamente la grasa mesentérica de ambos lados del útero con unas tijeras de muelle.
PRECAUCIÓN: El útero es muy frágil con el semen dentro. Tenga cuidado de no perforar el útero, o bien el semen se perderá. - Levantar el tracto reproductivo inferior y cortar la almohadilla de grasa ovárica en ambos lados.
- Transferir el tracto reproductivo todo el tubo de precalentado Leibovitz L-15 media + 1% FBS.
5. medición de la licuefacción del Semen (viscosidad) de la colección de contenido uterino
- Sobre la platina calefactada de la Estereomicroscopio, transferencia de los tejidos en un plato de cultivo estériles para tejidos de 35 mm llenan de 3.5 mL previamente calentado L-15 media + 1% FBS para limpiar los tejidos de la sangre y otros contaminantes.
PRECAUCIÓN: Mientras lava, agarrar los tejidos por la grasa, no el útero. En este punto, se espera que el semen intacto dentro del útero. - Secar los tejidos del exceso de medio uso toallitas de laboratorio.
- Mantener el tejido en el extremo vaginal colocando los extremos ováricos en el tubo de microcentrífuga precalentado. Sujetando el extremo vaginal, cortar los cuernos uterinos en la base del útero, permitiendo que los cuernos uterinos caer en el tubo de microcentrífuga.
- Dejar que el semen flujo fuera de los cuernos uterinos en el tubo. Utilizar pinzas sin dientes para apretar suavemente los cuernos uterinos del extremo ovárico al extremo vaginal, expulsión de semen sobrante.
- Deseche los tejidos en bolsa de biohazard y queme.
- Girar brevemente por el semen en un minicentrifuge (~ 1-2 s).
- Colocar el tubo, paralelo a la etapa caliente - semen no se derrama hacia fuera.
- Tiene el temporizador listo y a 'cuenta en adelante'.
- Inserte un tubo capilar de 25 μl de la muestra de semen en un ángulo de 180 º (paralelo a la pared del tubo). Esto es para minimizar la variabilidad entre cada investigador de sujetando el tubo capilar en diferentes ángulos.
- Pulsa el cronómetro tan pronto como el tubo capilar hace contacto con el semen.
- Registrar el tiempo (s) que tarda el semen llegar a la línea de 25 μl.
- Una vez terminada la medición, coloque inmediatamente el tubo que contiene el semen en el bloque de calor seco para su posterior análisis funcional, como imágenes de video de la motilidad espermática.
- Desinfectar el tubo capilar que contiene semen sumergiendo el tubo en la solución de cloro 10% por 20 min y descartar el tubo capilar en el contenedor de objetos punzantes.
6. video proyección de imagen de la motilidad espermática
- Encienda el microscopio y software de proyección de imagen de vídeo.
- Pipetear 20 μl de semen restante sobre el portaobjetos de cristal previamente calentados, mientras que el portaobjeto se coloca sobre la platina calefactada.
- Cubrir con un cubreobjetos de vidrio.
- Deposite al lado del cubreobjetos portaobjetos en el microscopio.
- Utilice 20 X objetivo para encontrar el área de interés.
- Cambiar a lente de objetivo de 100 X para imágenes de video.
- Grabar el video en 12 cuadros/s (fps) de 30 s.
- Al azar, grabar los videos en al menos 3 diferentes áreas por animal.
- Realizar la proyección de imagen rápida y minimizar la exposición a la luz a la diapositiva para preservar la motilidad espermática y la viabilidad.
Nota: Este procedimiento imagenológico debe realizarse dentro de 2-3 minutos. - Realizar el análisis de datos utilizando el software ImageJ como se describió previamente8.
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Representative Results
Semen se recolectó de CTRL y KO hembras aproximadamente 8 h después de aparearse con los machos fértiles de CTRL. Licuefacción (o viscosidad del semen) se cuantifica por el tiempo necesario para llenar el tubo capilar de 25 μL de semen. Asumió el esperma recogido de úteros CTRL 2.06 min ±0.12 (mean±S.E.M, n = 5) para llenar el tubo capilar (figura 1). Sin embargo, el esperma recogido de úteros KO tomó más de 60 min (60,0 ±0.0, mean±S.E.M, n = 5) de tiempo experimental. Estos datos sugieren que el semen es significativamente más líquido o menos viscoso en el CTRL comparado con úteros de KO.
Para ilustrar una de las aplicaciones posteriores de la recogida de semen en el tracto reproductivo femenino, la motilidad espermática se evaluó mediante imágenes de video. El semen recogido de los úteros CTRL mostraron espermatozoides nadar libremente dentro del campo microscópico, en la instantánea en la figura 2A. El semen recogido de los úteros de KO demostró que la mayoría de los espermatozoides fueron agrupada junto con mínima movilidad (figura 2B). Estos resultados indican que el semen recolectado de la zona reproductiva femenina 8 h después de apareamiento puede ser utilizado para otro análisis de esperma.
Figura 1 : Tiempo de licuefacción (viscosidad del semen) del semen recogido de úteros ratón. Representación gráfica de la época de la licuefacción (min) de semen había recogido de úteros CTRL y KO aproximadamente 8 h después de aparearse. Los datos representan mean±S.E.M., n = 5 hembras/genotipo. p < 0.001, desapareado prueba t -Student. Adaptado de resultados previamente publicados8 con permiso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Imágenes representativas de los espermatozoides en el semen recolectaron de úteros ratón. Fotos representativas de las imágenes de video tomadas en 1000 X aumento de espermatozoides en el semen recogieron de úteros KO CTRL (A) y (B) . Adaptado de resultados previamente publicados8 con permiso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Recogida de semen de úteros de ratón puede proporcionar ventajas sobre el análisis de semen en vitro como la anterior puede ilustrar las interacciones fisiológicas entre el semen y las secreciones del tracto reproductivo femenino. Las técnicas presentadas en este estudio permiten a los investigadores a determinar la calidad del semen así como viabilidad espermática y la motilidad en condiciones fisiológicas ideales. Además, hay varios análisis posteriores que se pueden realizar utilizando el esperma recogido de los úteros de, por ejemplo, los espermatozoides pueden ser contados determinar el número real de espermatozoides en el útero y los espermatozoides también puede ser reflejado por los ensayos de motilidad. El momento ideal para recoger el semen para la capacidad de fertilización debe ser dentro de 1 a 2 h después de acoplamiento1.
Además de los usos aguas abajo mencionados anteriormente, los investigadores también pueden evaluar los efectos de los inhibidores/compuestos de interés en el transporte espermático procesos, tales como la licuefacción del semen (o viscosidad del semen), número de espermatozoides en el tracto, esperma motilidad, o la migración de espermatozoides a diferentes áreas de la zona reproductiva femenina. Los compuestos se pueden aplicar en la zona reproductiva femenina antes del apareamiento8. Entonces, se puede evaluar el impacto de los inhibidores/compuestos de la muestra de semen postnupcial. Estos métodos pueden ser útiles para probar la viabilidad de fármacos anticonceptivos que inhiben el transporte espermático.
Puntos cruciales de la consideración de medidas de colección y licuefacción/viscosidad del semen son la sensibilidad de la esperma y el ángulo del tubo capilar. Espermatozoides son sensibles a cambios de temperatura. Si análisis aguas abajo de la función de esperma y motilidad es esencial para los resultados experimentales, el tejido y semen deben mantenerse a 37 º C en todo momento, con la mínima exposición a la luz. Si hay varias muestras que recopile de varias hembras, eutanasia a los animales uno a la vez para minimizar la espera. Para la medición de la licuefacción, diferentes ángulos del tubo capilar generan inconsistencias en el tiempo de licuefacción. Por lo tanto, los investigadores tienen que sostenga el tubo capilar paralelo a la pared del tubo (en un ángulo de 180°) para minimizar la variabilidad creada por cada investigador. Muestra de semen no debe ser recogida después de las 9:00 h, esto es debido a la reabsorción de líquido en el útero. El investigador no puede obtener suficiente material líquido para la medición de la licuefacción.
Se establece que la licuefacción del semen está mediada principalmente por la actividad enzimática de PSA secretada desde la glándula de la próstata13. Sin embargo, hay pocos estudios para determinar las funciones del aparato reproductor femenino durante en vivo licuefacción proceso8. Por lo tanto, colección de semen en el tracto reproductivo femenino ofrece una ventaja crucial para el estudio de la licuefacción de los procesos en vivo, después de que el semen ha sido expuesto a secreciones del tracto reproductor femenino14. En conclusión, post eyaculado licuefacción/viscosidad medida permite a los investigadores a descifrar la interacción entre el semen y el aparato reproductor femenino.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo es apoyado por el fondo de puesta en marcha de Universidad de medicina veterinaria (WSU) a WW. Los autores agradecen Sierra Olsen (WSU) la lectura crítica de este manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Toothpick | Diamond | 750-Flat | Autoclaved sterile, use blunted toothpick. Do not use point-ended |
| Dissecting scissors | Fisher | 08-940 | |
| Spring scissors | Roboz | RS-5600 | |
| Fine forceps | Roboz | RS-5045 | |
| 25-μL glass capillary tube | VWR | 53432-761 | |
| Leibovitz’s L-15 media | Life Technologies | 11415064 | Supplement with 1% FBS |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| 1.5-mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| 2-mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-200-A | |
| Digital dry block heater | VWR | 13259-052 | For warming the microcentrifuge tube prior to semen collection |
| Minicentrifuge | Corning | LSE 6765 | |
| 35-mm culture dish | VWR | 10861-656 | |
| 15-mL polypropylene centrifuge tube | VWR | 10025-686 | |
| Waterbath | Precision | TSGP05 | |
| Heated stage stereomicroscope | Leica Microsystems | MZ10F | To keep the tissue warm prior to semen collection |
| Brightfield microscope | Leica Microsystems | DMi8 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Camera | Leica Microsystems | DMC2900 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Glass slides | Fisher | 12-552-3 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Coverslip | VWR | 48393-059 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Bleach | Dilute in dH2O to 10% concentration |
References
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