JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neurosciences

حمل جزئ لوكس Cre في قشرة الدماغ الماوس عن طريق انهانسر في الرحم

Published: November 17, 2017
doi:
10.3791/56675
, , , ,
1Department of Biology,James Madison University

Summary

مهام خلية مستقلة للجينات في الدماغ يمكن دراستها بالخسارة أو الحصول على وظيفة في السكان متفرق من الخلايا. وهنا يصف لنا في الرحم انهانسر توصيل recombinase لجنة المساواة العرقية إلى السكان متفرق لتطوير الخلايا العصبية القشرية بالجينات فلوكسيد يسبب فقدان وظيفة فيفو.

Abstract

يمكن الكشف عنها بالتسبب في فقدان الوظائف العصبية خلية مستقلة للجينات أو الحصول على وظيفة الجينات في مجموعة سكانية صغيرة ومتفرقة من الخلايا العصبية. للقيام بذلك يتطلب توليد فسيفساء محاطة الخلايا العصبية مع الخسارة أو للحصول على وظيفة الجينات التي الأنسجة دونما قلاقل وراثيا. هنا، نحن ضم نظام جزئ لوكس Cre مع انهانسر في الرحم من أجل توليد أنسجة المخ الفسيفساء التي يمكن استخدامها لدراسة وظيفة الجينات في الخلايا العصبية في خلية مستقلة. يتم إدخال الحمض النووي بنيات (متاح عن طريق مستودعات)، الترميز لتسمية الفلورسنت ولجنة المساواة العرقية recombinase، في تطوير الخلايا العصبية القشرية التي تحتوي على جينات محاط بمواقع لوكسب في أدمغة الأجنة ماوس استخدام الرحم انهانسر. بالإضافة إلى ذلك، يصف لنا مختلف التعديلات إلى الأسلوب انهانسر في الرحم التي تزيد من قابلية وإمكانية تكرار نتائج. ويتضمن هذا الأسلوب أيضا إنشاء عيار لاقترانها بوساطة لجنة المساواة العرقية في عدد سكان متفرق أو كثيفة للخلايا العصبية. لا تتطلب التحضير النسيجي من أنسجة الدماغ المسمى (ولكن يمكن تكييفها ل) إيمونوهيستوتشيميستري. بنيات يستخدم ضمان أن المسمى فلوريسسينتلي تحمل الخلايا العصبية الجينات ل recombinase لجنة المساواة العرقية. التحضير النسيجي يسمح بتحليل الخصائص المورفولوجية للخلايا العصبية من خلال تصوير [كنفوكل] العرش الجذعية ومحواري والعمود الفقري الجذعية. لأن الخسارة أو الربح للدالة يتحقق في الأنسجة فسيفساء متناثرة، يسمح هذا الأسلوب دراسة ضرورة خلية مستقلة والكفاية للجينات المنتجات في فيفو.

Introduction

توليد فسيفساء وراثية نموذج تجريبي كلاسيكية لفهم وظيفة الجينات للفائدة. لتحديد ما إذا كان أحد جينات اللازمة للنمط الظاهري خلوية، أبسط نهج يسبب فقدان وظيفة الجينات في الكائن الحي (مثل خروج المغلوب). لتحديد إذا كان جين مطلوب على وجه التحديد في نوع خلية معينة، خروج المغلوب الجينات في جميع أنحاء الحي غير نهجاً صحيحاً. بدلاً من ذلك، أسلوب المطلوبة التي سوف يؤدي إلى فقدان وظيفة الجينات في خلية معينة بينما محاط بأنسجة wildtype (أي دونما قلاقل وراثيا) – وبعبارة أخرى، إنشاء فسيفساء النسيج. إذا كانت الخلية متحولة يظهر النمط الظاهري المسخ، لكن الخلايا المحيطة wildtype لا، وظائف الجينات بطريقة خلية مستقلة. تحليل الأنسجة الفسيفساء، فيها خلايا متحولة محاطة بأنسجة wildtype، يعتبر مثاليا لفهم وظائف خلية مستقلة للجينات، ولا سيما في الدماغ التي تشكل فيها الخلايا العصبية وإطلاق شبكة مترابطة واسعة من الأنسجة.

وقدمت عدة أشكال من أنسجة المخ فسيفساء نماذج قوية للتحقيق في مهام خلية مستقلة للجينات. دراسات تركز على زرع الخلايا العصبية1من الإناث mosaicism ترتبط X2،3،4، و mosaicism الجسدية الذاتية5،6 وضعت استنتاجاتهم تستند إلى فسيفساء أنسجة المخ. حذف الشرطي الجينات من خلال نظام جزئ لوكس Cre هو طريقة التي تحيط استفادة كاملة من توافر خطوط الماوس المعدلة وراثيا كبيرة. في هذا الأسلوب، يتم عرض موقعين لوكسب على جانبي تسلسل المطلوبة من الجينات (مثل إكسون)، تاركة محاط بمواقع لوكسب أن تواجه معا في نفس الاتجاه (“فلوكسيد”). لجنة المساواة العرقية recombinase excises التسلسل بين مواقع لوكسب7. يمكن اقترانها بوساطة لجنة المساواة العرقية بعبور فلوكسيد الفئران إلى آخر السطر الماوس معربا عن recombinase Cre جنبا إلى جنب مع علامة مضيئة في مجموعة فرعية خلايا (“لجنة المساواة العرقية مراسل الخط”). وهذا قد تجلى في مجموعة متنوعة من الطرق للكشف عن وظائف الجينات في مجموعات فرعية خلايا، مثل الخلايا العصبية ضادات أو أستروسيتيس8. يمكن التعبير عن خطوط مراسل Cre كريرT2 للسماح باقترانها بوساطة لجنة المساواة العرقية أن المخدرات إيندوسيبلي (واحد-العصبية وسم مع إيندوسيبلي بالضربة القاضية بوساطة لجنة المساواة العرقية، أو بقعة)9. في استراتيجية أخرى تسمى التحليل الفسيفساء مع ضعف علامات (مآدم)10،11، يسمح بوساطة لجنة المساواة العرقية جزئ إينتيرتشروموسومال متحولة متماثل المراد إنشاؤها جنبا إلى جنب مع أنسجة متخالف. في هذه النهج، يحتاج خط جديد من الفئران إنتاج كل الوقت لكل مرشح الجينات أو نوع فرعي الخلوية التي يتم اختبارها. بدلاً من ذلك، ريكومبيناسي لجنة المساواة العرقية ويمكن إدخال وأرزان ارتباط المستقبلات عن طريق الرحلان12 ، أو عن طريق النواقل الفيروسية (مثل الفيروسات المرتبطة بالغدة13 أو lentiviruses14 تحمل الخلوية الخاصة بالنوع الفرعي دعاة). هذه الاستراتيجية إنشاء العلامات القوية وبعد الولادة. لاستهداف تنمية الخلايا العصبية القشرية الدماغية قليلة وبريناتالي، استراتيجية مثالية في الرحم انهانسر من ريكومبيناسي لجنة المساواة العرقية مع علامة نيون.

بالإضافة إلى الجمع بين جزئ لوكس Cre خلال انهانسر في الرحم لإنتاج الفسيفساء الأنسجة في الجسم الحي، ونقدم عدة تعديلات على إجراءات من غيرها البروتوكولات المنشورة15،، من16 17،،من1819،،من2021. نحن نقدم المعلومات لتحسين النجاح في تربية الإناث الحوامل في الوقت المناسب. ونحن أيضا الخطوط العريضة لدينا استراتيجيتين لإدخال العلامات متفرق ومشرق للخلايا العصبية في الأنسجة القشرية: استراتيجية واحدة تيتراتي مستويات بناء واحد الترميز ل recombinase لجنة المساواة العرقية، وعلامة نيون22. استراتيجية أخرى لاستخدام نظام “سوبر نوفا”، تستهدف على وجه التحديد مع هذه المعايير في الاعتبار23،24. بالإضافة إلى ذلك، نقدم لإدخال تحسينات على إنتاج الماصات microinjection متسقة والتبسيط لجراحة انهانسر في الرحم . وأخيراً، فإننا مخطط الخطوات الحاسمة في تحضير النسيجي مبسط يسمح تحليل الأشواك الجذعية والجذعيه ومحواري العرش، دون تلطيخ المزيد أو إيمونوهيستوتشيميستري.

Protocol

الأساليب الموصوفة هنا وافق عليها “العناية بالحيوان” واستخدام اللجنة (أكوك) من جامعة جيمس ماديسون، ووفقا والامتثال لجميع المبادئ التوجيهية التنظيمية والمؤسسية ذات الصلة. 1. إعداد الماوس بيت شباب (> P60) الماوس فلوكسيد متماثل الذكور والإناث معا لإعداد من زوج مربي…

Representative Results

الواحد بناء التجارة والنقل. لجنة المساواة العرقية (انظر قائمة المواد) كان اليكتروبوراتيد في E15.5 وتصور في P14. اعتماداً على تركيز بنية وحجم الحقن، نتيجة متفرق أو كثيفة ويمكن الحصول على22،26. على سبيل المثال، حقن ميليلتر 1 2 ملغ/مل التجارة والنقل….

Discussion

نقدم لك هنا، مزيج انهانسر في الرحم مع recombinase لجنة المساواة العرقية في الفئران فلوكسيد لتوليد أنسجة المخ الفسيفساء. ميزة هذا النهج هو أن خط ماوس جديدة لا تحتاج إلى إنشاء كل مرة يتم فيها استهداف نوع فرعي خلوية مختلفة: يمكن استخدامها في الرحم انهانسر لاستهداف ضادات الخلايا العصبية، …

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

يشكر المؤلفون الدعم السخي “جيمس ماديسون جامعة قسم علم الأحياء”، و “جيمس ماديسون جامعة الخفيفة الميكروسكوب” و “مرفق التصوير”. الدكتور مارك L. جابرييل لمن المفيد تقديم المشورة بشأن إعداد الشباب الأنسجة بعد الولادة، والدكتور جاستن جورج براون وشنها لام كوري للتنسيق سخية من الفضاء والمواد الجراحية. بتمويل هذا البحث في جزء من “منحة بحثية تعاونية” 4-خامسا، شراكة تعاونية للمضي قدما في كومنولث فرجينيا (G.S.V.)، ومن “فيرجينيا أكاديمية للعلوم الصغيرة المشروع منحة بحثية” (G.S.V.). تم دعما سخيا من هبات “بيتي جو المحبة بتلر” 58 لمنحه البحوث الجامعية (ل K.M.B.)، ومنحة أبحاث صيف فاريل (إلى K.M.B.)، وجيمس ماديسون الجامعة الثانية القرن منحة دراسية (ل K.M.B.)، جيمس جامعة ماديسون الذكرى المئوية للمنح الدراسية (ل C.J.H.) وعلى منحة دراسية جامعة جيمس ماديسون لوسي روبنسون بحث 30 تذكارية (إلى Z.L.H.)، وكلية جامعة جيمس ماديسون للعلوم والرياضيات كلية منحة المساعدة (إلى G.S.V.).

Materials

C57BL/6J mice The Jackson Laboratory #000664 See "1. Mouse set-up" (step 1.1, "wildtype mice")
GFP.Cre empty vector AddGene #20781 See "2. DNA set-up" (step 2.1 "single DNA construct that codes for Cre recombinase as well as a fluorescent marker"). GFP.Cre empty vector was a gift from Tyler Jacks.
pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) AddGene #69138 See "2. DNA set-up" (step 2.1 "Supernova" system) and http://snsupport.webcrow.jp/. pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) was a gift from Takuji Iwasato.
pK031.TRE-Cre (Supernova) AddGene #69136 See "2. DNA set-up" (step 2.1 "Supernova" system) and http://snsupport.webcrow.jp/. pK031.TRE-Cre (Supernova) was a gift from Takuji Iwasato.
pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) AddGene #85006 See "2. DNA set-up" (step 2.1 "Supernova" system) and http://snsupport.webcrow.jp/. pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) was a gift from Takuji Iwasato.
EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) Qiagen #12362 See "2. DNA set-up" (step 2.3 "endotoxin-free plasmid purification kit")
Trypan Blue powder, BioReagent grade Sigma T6146-5G See "2. DNA set-up" (step 2.5 "trypan blue")
Sodium Chloride, ACS, 2.5 kg VWR BDH9286-2.5KG See "2. DNA set-up" (step 2.5 "NaCl")
Potassium Chloride, ACS, 500 g VWR #97061-566 See "2. DNA set-up" (step 2.5 "KCl")
Sodium phosphate dibasic, ReagentPlus, 100 g Sigma-Aldrich S0876-100G See "2. DNA set-up" (step 2.5 "Na2HPO4")
Potassium phosphate monobasic, ReagentPlus, 100 g Sigma-Aldrich P5379-100G See "2. DNA set-up" (step 2.5 "KH2PO4")
Hydrochloric acid, ACS reagent, 500 mL Fisher Scientific A144-500 See "2. DNA set-up" (step 2.5 "HCl")
P-97 Micropipette Puller Sutter Instrument P-97 See "3. Pipette set-up" (step 3.1 "glass capillary puller")
3.0 mm wide trough filament Sutter Instrument FT330B See "3. Pipette set-up" (step 3.1 "glass capillary puller")
Thin Wall Glass Capillaries, 4", 1 / 0.75 OD/ID World Precision Instruments TW100-4 See "3. Pipette set-up" (step 3.1.1 "glass capillary")
Single Ply Soft-Tech Wipes, 4.5" Phenix LW-8148 See "3. Pipette set-up" (step 3.2.1 "single-ply task wipe"); other single-ply wipes (e.g. Kimwipes) can be used.
Graefe Forceps, 7 cm, Straight, 0.7 mm 1×2 Teeth World Precision Instruments #14140 See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "Graefe forceps")
Iris Scissors, 11.5 cm, Straight, 12-pack World Precision Instruments #503708-12 See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "iris scissors")
Hartman Mosquito Forceps, 9 cm, Straight, 12-pack World Precision Instruments #503728-12 See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "Hartman mosquito forceps")
General Purpose Non-Woven Sponges, 2" x 2", 4-ply Medrepexpress #2204-c See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "non-woven gauze sponges")
Ring Tipped Forceps, 10 cm, Straight, 2.2mm ID World Precision Instruments #503203 See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "ring-tipped forceps")
Pyrex petri dishes complete, O.D. × H 100 mm × 20 mm Sigma-Aldrich CLS3160102-12EA See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "Petri dishes")
Flat Type Instrument Tray, Stainless Steel, 13-5/8" x 9-3/4" x 5/8" Amazon B007SHGAHA See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "stainless steel tray")
Platinum Tweezertrode, 5 mm BTX #45-0489 See "4. In utero electroporation" (step 4.3 and 4.16 "tweezer-type electrodes")
ECM 830 Foot Pedal BTX #45-0211 See "4. In utero electroporation" (step 4.3 and 4.17 "foot pedal")
ECM 830 Generator BTX #45-0052 See "4. In utero electroporation" (step 4.3 "generator")
Single Animal Isoflurane Anesthesia System with Small Induction Box Harvard Apparatus #72-6468 See "4. In utero electroporation" (step 4.4 and 4.6 "nose cone", step 4.4 "induction chamber")
Ophthalmic ointment Hanna Pharmaceutical Supply Co #0536108691 See "4. In utero electroporation" (step 4.7 "veterinary ophthalmic ointment")
Space Gel (AIMS) VWR #95059-640 See "4. In utero electroporation" (step 4.8 "sealed pouch filled with supersaturated salt solution")
Hair Remover Gel Cream, Sensitive Formula Veet #062200809951 See "4. In utero electroporation" (step 4.9 "depilatory cream")
10ul Low Retention Tip Starter (960 tips/pk) Phenix Research Products TSP-10LKIT See "4. In utero electroporation" (step 4.12 "sterile 10 µL micropipette tip")
Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes Sigma-Aldrich A5177 See "4. In utero electroporation" (step 4.15 "aspirator tube assembly")
Braided Absorbable Suture, 4-0, Needle NFS-2(FS-2), 27" Medrepexpress MV-J397 See "4. In utero electroporation" (step 4.19 "absorbable sutures")
“LiquiVet Rapid” Tissue Adhesive Medrepexpress VG3 See "4. In utero electroporation" (step 4.20 "tissue adhesive")
Hypodermic syringes, polypropylene, Luer lock tip, capacity 1.0 mL Sigma-Aldrich Z551546-100EA See "4. In utero electroporation" (step 4.21 "1 mL syringe")
BD Precisionglide syringe needles gauge 26, L 1/2 in. Sigma-Aldrich Z192392-100EA See "4. In utero electroporation" (step 4.21 "26G, ½” needle")
Nestlets Nesting Material Ancare NES3600 See "4. In utero electroporation" (step 4.24 "nesting materials")
Sunflower Seeds, Black Oil, Sterile Bio-Serv S5137 See "4. In utero electroporation" (step 4.24 "sunflower seeds")
Paraformaldehyde, 97% Alfa Aesar A11313 See "5. Histology" (step 5.1.1 "PFA")
Economy Tweezers #3, 11 cm, 0.2 x 0.4 mm tips World Precision Instruments #501976 See "5. Histology" (step 5.5 "tweezers")
Agar powder Alfa Aesar #10752 See "5. Histology" (step 5.8.1 "agar")
Single-edge razor blades, #9 blade Stanley Tools #11-515 See "5. Histology" (step 5.9 "single-edge razor blade")
Specimen disc S D 50 mm Leica #14046327404 See "5. Histology" (step 5.9 "vibrating microtome specimen disc")
Buffer tray S assembly Leica #1404630132 See "5. Histology" (step 5.10 "buffer tray")
VT1000 S Vibratome Leica #14047235612 See "5. Histology" (step 5.10 "vibrating microtome")
Double Edge Razor Blades Personna BP9020 See "5. Histology" (step 5.10 "blade")
Knife Holder S Leica #14046230131 See "5. Histology" (step 5.10 "knife holder")
Studio Elements Golden Taklon Short Handle Round Brush Set Amazon B0089KU6XE See "5. Histology" (step 5.12.1 "fine tipped paintbrush")
Superfrost Plus Slides Electron Microscopy Services #71869-11 See "5. Histology" (step 5.12.1 "microscope slide")
ProLong Diamond Antifade Mountant, 10 ml Thermofisher P36970 See "5. Histology" (step 5.12.3-5.12.4 "mountant")
Cover Glass, 24 x 50 mm, No. 1 Phenix Research Products MS1415-10 See "5. Histology" (step 5.12.4 "coverslip")
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) Sigma-Aldrich D9542 See "5. Histology" (step 5.13.1 "DAPI")
Fixed Stage Upright Microscope Olympus BX51WI See "5. Histology" (step 5.15 "light microscope")
Laser Scanning Confocal Microscope Nikon TE2000/C2si See "5. Histology" (step 5.15 "confocal microscope")
4x objective, NA = 0.20 Nikon CFI Plan Apo Lambda 4X See "5. Histology" (step 5.15 "low-power objective")
20x objective, NA = 0.75 Nikon CFI Plan Apo Lambda 20X See "5. Histology" (step 5.15 "medium-power objective")
60x objective, NA = 1.40 Nikon CFI Plan Apo VC 60X Oil See "5. Histology" (step 5.15 "high-power objective")
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Southwell, D. G., Froemke, R. C., Alvarez-Buylla, A., Stryker, M. P., Gandhi, S. P. Cortical plasticity induced by inhibitory neuron transplantation. Science. 327 (5969), 1145-1148 (2010).
  2. Hanson, J. E., Madison, D. V. Presynaptic FMR1 genotype influences the degree of synaptic connectivity in a mosaic mouse model of fragile X syndrome. J. Neurosci. 27 (15), 4014-4018 (2007).
  3. Patel, A. B., Hays, S. A., Bureau, I., Huber, K. M., Gibson, J. R. A Target Cell-Specific Role for Presynaptic Fmr1 in Regulating Glutamate Release onto Neocortical Fast-Spiking Inhibitory Neurons. J. Neurosci. 33 (6), 2593-2604 (2013).
  4. Patel, A. B., Loerwald, K. W., Huber, K. M., Gibson, J. R. Postsynaptic FMRP promotes the pruning of cell-to-cell connections among pyramidal neurons in the L5A neocortical network. J. Neurosci. 34 (9), 3413-3418 (2014).
  5. McConnell, M. J., et al. Mosaic Copy Number Variation in Human Neurons. Science. 342 (6158), 632-637 (2013).
  6. McConnell, M. J., et al. Intersection of diverse neuronal genomes and neuropsychiatric disease: The Brain Somatic Mosaicism Network. Science. 356 (6336), eaal1641 (2017).
  7. Gu, H., Marth, J. D., Orban, P. C., Mossmann, H., Rajewsky, K. Deletion of a DNA polymerase beta gene segment in T cells using cell type-specific gene targeting. Science. 265 (5168), 103-106 (1994).
  8. Hodges, J. L., et al. Astrocytic Contributions to Synaptic and Learning Abnormalities in a Mouse Model of Fragile X Syndrome. Biol. Psychiatry. (17), 1-11 (2016).
  9. Young, P., Qiu, L., Wang, D., Zhao, S., Gross, J. Single-neuron labeling with inducible cre-mediated knockout in transgenic mice. Nat. Neurosci. 11 (6), 721-728 (2011).
  10. Zong, H., Espinosa, J. S., Su, H. H., Muzumdar, M. D., Luo, L. Mosaic Analysis with Double Markers in Mice. Cell. 121 (3), 479-492 (2005).
  11. Hippenmeyer, S., et al. Genetic mosaic dissection of Lis1 and Ndel1 in neuronal migration. Neuron. 68 (4), 695-709 (2010).
  12. De la Rossa, A., Jabaudon, D. In vivo rapid gene delivery into postmitotic neocortical neurons using iontoporation. Nat. Protoc. 10 (1), 25-32 (2015).
  13. Lu, W., Bushong, E. A., Shih, T. P., Ellisman, M. H., Nicoll, R. A. The cell-autonomous role of excitatory synaptic transmission in the regulation of neuronal structure and function. Neuron. 78 (3), 433-439 (2013).
  14. Duan, Y., et al. Semaphorin 5A inhibits synaptogenesis in early postnatal- and adult-born hippocampal dentate granule cells. eLife. 3, 1-24 (2014).
  15. Dixit, R., et al. Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In utero Electroporation. J. Vis. Exp. (52), e2957 (2011).
  16. Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection. J. Vis. Exp. (54), e3024 (2011).
  17. Briz, C. G., Navarrete, M., Esteban, J. A., Nieto, M. In utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity. J. Vis. Exp. (120), (2017).
  18. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev. Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
  19. Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nature protocols. 1 (3), 1552-1558 (2006).
  20. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neurosciences. 103 (4), 865-872 (2001).
  21. Matsuda, T., Cepko, C. L. Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 10 (3), 1027-1032 (2007).
  22. Pacary, E., et al. Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation. J. Vis. Exp. (65), e4163 (2012).
  23. Mizuno, H., et al. NMDAR-Regulated Dynamics of Layer 4 Neuronal Dendrites during Thalamocortical Reorganization in Neonates. Neuron. 82 (2), 365-379 (2014).
  24. Luo, W., et al. Supernova: A Versatile Vector System for Single-Cell Labeling and Gene Function Studies in vivo. Sci. Rep. 6, 35747 (2016).
  25. Mader, S. L., Libal, N. L., Pritchett-Corning, K., Yang, R., Murphy, S. J. Refining timed pregnancies in two strains of genetically engineered mice. Lab animal. 38 (9), 305-310 (2009).
  26. Vidal, G. S., Djurisic, M., Brown, K., Sapp, R. W., Shatz, C. J. Cell-Autonomous Regulation of Dendritic Spine Density by PirB. eNeuro. 3 (5), 1-15 (2016).
  27. Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. PLoS ONE. 7 (4), 1-5 (2012).
  28. Andreu-Agullo, C., Maurin, T., Thompson, C. B., Lai, E. C. Ars2 maintains neural stem-cell identity through direct transcriptional activation of Sox2. Nature. 481, 195-198 (2011).
  29. Scotto-Lomassese, S., et al. Fragile X mental retardation protein regulates new neuron differentiation in the adult olfactory bulb. J. Neurosci. 31, 2205-2215 (2011).
  30. . . Plasmids 101: A Desktop Resource. , (2017).
  31. . . Pipette Cookbook. , (2015).
  32. Cuddington, B., Verschoor, M., Mossman, K. Handling of the Cotton Rat in Studies for the Pre-clinical Evaluation of Oncolytic Viruses. J. Vis. Exp. (93), e52232 (2014).
  33. Leary, S., et al. . AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition. , (2013).
  34. Anderson, S. A., Eisenstat, D. D., Shi, L., Rubenstein, J. L. R. Interneuron Migration from Basal Forebrain to Neocortex: Dependence on Dlx Genes. Science. 28 (5337), 474-476 (1997).
  35. Parker, J. M., Austin, J., Wilkerson, J., Carbone, L. Effects of Multimodal Analgesia on the Success of Mouse Embryo Transfer Surgery. J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 50 (4), 466-470 (2011).
  36. Kim, J. -. Y., et al. Viral transduction of the neonatal brain delivers controllable genetic mosaicism for visualising and manipulating neuronal circuits in vivo. Eur. J. Neurosci. 37 (8), 1203-1220 (2013).
  37. Pierfelice, T. J., Gaiano, N. Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5. J. Vis. Exp. (45), e2047 (2010).

Tags

Cre-lox RecombinationMouse Cerebral CortexIn Utero ElectroporationGenetic MosaicNeurobiologyLayer 2-3 Cortical NeuronsPipette PreparationEmbryonic Day 15.5AnesthesiaMouse Surgery

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Bland, K. M., Casey, Z. O., Handwerk, C. J., Holley, Z. L., Vidal, G. S. Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation. J. Vis. Exp. (129), e56675, doi:10.3791/56675 (2017).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image