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Neurosciences

Cre lox 재결합 Electroporation Utero에 통해 마우스 대뇌 피 질에서 유도

Published: November 17, 2017
doi:
10.3791/56675
, , , ,
1Department of Biology,James Madison University

Summary

두뇌에 있는 유전자의 세포 자치 기능 손실을 유도 하 여 공부 될 수 있다 또는 셀의 스파스 인구에 있는 기능을 얻을. 여기, Cre recombinase 함수 비보의 손실에 floxed 유전자와 대뇌 피 질의 뉴런 개발의 부족 인구에 제공 electroporation utero에서 설명 합니다.

Abstract

유전자의 세포 자율 신경 기능 손실이 발생 하 여 계시 될 수 있다 또는 뉴런의 작고 부족 인구에 있는 유전자의 기능을 얻을. 이렇게 하려면 손실 또는 이득 유전자의 기능의 신경 유전자 교란된 조직에 의해 포위 된다 모자이크를 생성 해야 합니다. 여기, 우리가 결합 Cre lox 재결합 시스템 electroporation utero에 모자이크 뇌 조직 신경에 있는 유전자의 세포 자치 기능을 공부 하는 데 사용할 수 있습니다을 생성 하기 위하여. DNA 구조 (저장소를 통해 사용 가능), 형광 라벨 및 Cre recombinase 코딩 유전자에 utero 를 사용 하 여 마우스 태아의 두뇌에 loxP 사이트와 측면을 포함 하는 대뇌 피 질의 뉴런 개발에 도입 electroporation입니다. 또한, 우리는 utero에 electroporation 메서드에 생존 및 재현성을 증가 하는 다양 한 적응을 설명 합니다. 이 방법은 또한 titer Cre 중재 재결합 뉴런의 스파스 또는 조밀한 인구에 대 한 설정 포함. (필요 하지 않습니다 하지만)을 적용할 수 있습니다 레이블이 뇌 조직의 조직학 준비 immunohistochemistry. 사용 하는 구문을 붙일 뉴런 수행 Cre recombinase에 대 한 유전자 표시 보장 합니다. 조직학 준비 수지상 및 axonal 아 버 및 모 수석 등뼈의 confocal 영상 통해 뉴런의 형태소 분석 허용. 있으므로 손실 또는 함수의 이득 스파스 모자이크 조직에서, 세포 자치 필요성의 연구와 유전자 제품에서 vivo에서의 자족이이 방법을 허용 합니다.

Introduction

유전 모자이크를 생성 하는 것은 관심사의 유전자의 기능을 이해 하기 위한 고전적인 실험 패러다임 이다. 프로그램 유전자 세포 표현 형에 필요한 지 확인 하려면 가장 간단한 방법은 유기 체 (예 마네)에 걸쳐 유전자의 기능의 손실을 일으키는 것입니다. 그러나, 확인 하려면 유전자 특정 셀 종류에 특히 필요한 경우, 유기 체 전체 유전자의 녹아웃이 아니다 유효한 접근. 대신, 메서드는 필요한 wildtype (즉 유전자 교란) 조직으로 둘러싸여 동안 주어진된 셀에 유전자의 기능의 손실을 발생 합니다는-즉, 모자이크 조직 만들기. 만약 돌연변이 세포 돌연변이 표현 형을 표시 하지만 주변 wildtype 세포 안, 세포 자치 방법으로 유전자 기능. 돌연변이 세포 wildtype 조직에 의해 포위 된다 모자이크 조직의 분석 유전자, 특히 신경 및 명과 조직의 광대 한 상호 네트워크를 형성 하는 뇌의 세포 자치 기능을 이해 하는 데 이상적입니다.

여러 형태의 모자이크 뇌 조직의 강력한 모델 조사 유전자의 세포 자치 기능을 제공 합니다. 연구 신경 이식1, 여성 X 연결 mosaicism2,3,4에 집중 하 고 내 생 신체적인 mosaicism5,6 그린 모자이크에 따라 그들의 결론 뇌 조직입니다. 조건부 삭제 Cre lox 재결합 시스템을 통해 유전자의 유전자 변형 마우스 라인의 좋은 가용성을 최대한 활용 하는 방법입니다. 이 방법에서는, 2 개의 loxP 사이트 loxP 사이트 같은 방향으로 (“floxed”)에서 두 얼굴을 있는 그것을 떠나 (예:는 exon), 유전자의 필요한 시퀀스의 양쪽에 소개 된다. Cre recombinase loxP 사이트7사이 시퀀스 excises. Cre 중재 재결합 Cre recombinase 셀 (“Cre 기자 선”)의 하위 집합에서 형광 표식 함께 표현 하는 또 다른 마우스 라인을 건너 floxed 마우스에 의해 얻을 수 있습니다. 이 다양 한 방법으로 흥분 성의 뉴런 등 이다8셀의 하위 집합에서 유전자의 기능을 밝히기 위해 입증 되었습니다. Cre 기자 라인 Cre 중재 재결합 마약을 유도할 수 있는 (단일 신경 라벨 유도할 수 있는 Cre 중재 녹아웃 또는 매끄러운) 될 수 있도록 있다T2 를 표현할 수 있습니다9. 다른 전략 이라는 이중 표식 (MADM)10,11모자이크 분석, Cre 중재 interchromosomal 재결합 homozygous 돌연변이 heterozygous 조직 함께 만들 수 있습니다. 이러한 방식에서 쥐의 새로운 라인 각 후보 유전자 또는 세포 하위 테스트에 대 한 각 시간 제작 될 필요가 있다. 또는, Cre recombinase 소개 될 수 있다 postnatally 또는 바이러스 성 벡터 (예를들면 adeno 관련 바이러스13 또는 lentiviruses14 셀룰러 하위 형식 관련 운반 iontophoresis12 통해 발기인)입니다. 이 전략 강력 하 고 산 후 라벨을 만듭니다. 대뇌 피 질 뉴런을 띄엄띄엄 prenatally 개발 대상으로 이상적인 전략의 형광 표시와 함께 Cre recombinase electroporation utero에 입니다.

Cre lox 재결합 electroporation utero에서 생성을 통해 결합 뿐만 아니라 vivo에서조직 모자이크, 다른 게시 프로토콜15,,16에서 프로시저에 여러 각 색 한 소개 17,,1819,,2021. 우리는 사육 타임-임신 여성에서 성공을 개선 하는 정보를 제공 합니다. 우리 또한 우리의 두 전략 스파스 하 고 밝은 대뇌 피 질의 조직에서 뉴런의 라벨을 소개 하는 개요: 하나의 전략 Cre recombinase 및 형광 마커22단일 구문을 코딩의 수준을 적정 하는 것입니다. 또 다른 전략 마음23,24에 이러한 매개 변수를 특별히 설계 된 “초신성” 시스템을 사용 하는 것입니다. 또한, 생산 하는 일관 된 microinjection 펫 및 단순화에 utero electroporation 수술에 개선을 제공 합니다. 마지막으로, 우리는 더 얼룩 또는 immunohistochemistry 없이 모 수석 등뼈와 수지상 및 axonal 아 버의 분석을 허용 하는 간단한 조직학 준비에서 중요 한 단계를 개요.

Protocol

여기에 설명 된 방법 동물 관리 및 사용 위원회 (ACUC), 제임스 매디슨 대학에 의해 승인 되며 모든 관련 규제 기관 지침 준수에 따라. 1. 마우스 설정 젊은 집 (> P60) 남성과 여성의 homozygous floxed 마우스 개종 쌍25를 설정 하는 함께.참고: 좋은 부정적인 제어는 Cre에서 recombinase 식 모자이크26발생 하지 것입니다 wildtype 마우스의 추가 종…

Representative Results

단일 GFP를 구성 합니다. Cre는 E15.5에서 electroporated 이었고 P14에서 시각 (재료의 목록 참조). 구성의 농도 주입의 볼륨에 따라 스파스 또는 밀도 결과22,26얻어질 수 있다. 예를 들어, 2 mg/mL GFP의 1 µ L의 주입. 레이블이 지정 된 셀, 일부는 밝은 (그림 1A), 그리고에서 지역화 레이어 II/III (그림 1B</…

Discussion

여기, electroporation utero에 모자이크 뇌 조직의 생성을 floxed 마우스에 Cre recombinase와의 조합을 소개 합니다. 이 방법의 장점은 새로운 마우스 선 다른 셀룰러 하위는 타겟이 될 때마다 생성 될 필요는 없습니다: electroporation utero에서 흥분 성의 뉴런, 신경 억제, 또는 시간에 따라 명과 대상으로 사용할 수 있습니다 그리고 electroporation15,,16</s…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

저자는 제임스 매디슨 대학 생물학 부와 제임스 매디슨 대학교 빛 현미경 이미징 시설의 관대 한 지원을 감사합니다. 닥터 마크 L. 가브리엘 젊은 출생 후 조직 준비, 에 관한 유용한 조언 및 박사 저스틴 W. 브라운 코리 L. Cleland 수술 재료와 공간의 관대 한 조정에 대 한. 이 연구 4-VA, 전진 하는 연방의 버지니아 (G.S.V.)에 대 한 공동 제휴 및에 의해 버지니아 아카데미의 과학 작은 프로젝트 연구 부여 (G.S.V.) 공동 연구 교부 금에 의해 부분적으로 투자 되었다. 지원이 아낌없이 제공 되었습니다 베티 조 사랑 버틀러 ‘ 58 기부금으로 학부 연구 장학금 (K.M.B.), 파렐 여름 연구 장학금 (K.M.B.)을, (에 K.M.B.), 제임스 매디슨 대학 두 번째 세기 장학금에 대 한 한 제임스 매디슨 대학 센테니얼 장학금 (C.J.H.), 제임스 매디슨 대학 루시 로빈슨 검색 ‘ 30 기념 장학금 (Z.L.H.)을 및 과학 및 수학 교수 지원 그랜트 (G.S.V.)에 제임스 매디슨 대학 대학.

Materials

C57BL/6J mice The Jackson Laboratory #000664 See "1. Mouse set-up" (step 1.1, "wildtype mice")
GFP.Cre empty vector AddGene #20781 See "2. DNA set-up" (step 2.1 "single DNA construct that codes for Cre recombinase as well as a fluorescent marker"). GFP.Cre empty vector was a gift from Tyler Jacks.
pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) AddGene #69138 See "2. DNA set-up" (step 2.1 "Supernova" system) and http://snsupport.webcrow.jp/. pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) was a gift from Takuji Iwasato.
pK031.TRE-Cre (Supernova) AddGene #69136 See "2. DNA set-up" (step 2.1 "Supernova" system) and http://snsupport.webcrow.jp/. pK031.TRE-Cre (Supernova) was a gift from Takuji Iwasato.
pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) AddGene #85006 See "2. DNA set-up" (step 2.1 "Supernova" system) and http://snsupport.webcrow.jp/. pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) was a gift from Takuji Iwasato.
EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) Qiagen #12362 See "2. DNA set-up" (step 2.3 "endotoxin-free plasmid purification kit")
Trypan Blue powder, BioReagent grade Sigma T6146-5G See "2. DNA set-up" (step 2.5 "trypan blue")
Sodium Chloride, ACS, 2.5 kg VWR BDH9286-2.5KG See "2. DNA set-up" (step 2.5 "NaCl")
Potassium Chloride, ACS, 500 g VWR #97061-566 See "2. DNA set-up" (step 2.5 "KCl")
Sodium phosphate dibasic, ReagentPlus, 100 g Sigma-Aldrich S0876-100G See "2. DNA set-up" (step 2.5 "Na2HPO4")
Potassium phosphate monobasic, ReagentPlus, 100 g Sigma-Aldrich P5379-100G See "2. DNA set-up" (step 2.5 "KH2PO4")
Hydrochloric acid, ACS reagent, 500 mL Fisher Scientific A144-500 See "2. DNA set-up" (step 2.5 "HCl")
P-97 Micropipette Puller Sutter Instrument P-97 See "3. Pipette set-up" (step 3.1 "glass capillary puller")
3.0 mm wide trough filament Sutter Instrument FT330B See "3. Pipette set-up" (step 3.1 "glass capillary puller")
Thin Wall Glass Capillaries, 4", 1 / 0.75 OD/ID World Precision Instruments TW100-4 See "3. Pipette set-up" (step 3.1.1 "glass capillary")
Single Ply Soft-Tech Wipes, 4.5" Phenix LW-8148 See "3. Pipette set-up" (step 3.2.1 "single-ply task wipe"); other single-ply wipes (e.g. Kimwipes) can be used.
Graefe Forceps, 7 cm, Straight, 0.7 mm 1×2 Teeth World Precision Instruments #14140 See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "Graefe forceps")
Iris Scissors, 11.5 cm, Straight, 12-pack World Precision Instruments #503708-12 See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "iris scissors")
Hartman Mosquito Forceps, 9 cm, Straight, 12-pack World Precision Instruments #503728-12 See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "Hartman mosquito forceps")
General Purpose Non-Woven Sponges, 2" x 2", 4-ply Medrepexpress #2204-c See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "non-woven gauze sponges")
Ring Tipped Forceps, 10 cm, Straight, 2.2mm ID World Precision Instruments #503203 See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "ring-tipped forceps")
Pyrex petri dishes complete, O.D. × H 100 mm × 20 mm Sigma-Aldrich CLS3160102-12EA See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "Petri dishes")
Flat Type Instrument Tray, Stainless Steel, 13-5/8" x 9-3/4" x 5/8" Amazon B007SHGAHA See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "stainless steel tray")
Platinum Tweezertrode, 5 mm BTX #45-0489 See "4. In utero electroporation" (step 4.3 and 4.16 "tweezer-type electrodes")
ECM 830 Foot Pedal BTX #45-0211 See "4. In utero electroporation" (step 4.3 and 4.17 "foot pedal")
ECM 830 Generator BTX #45-0052 See "4. In utero electroporation" (step 4.3 "generator")
Single Animal Isoflurane Anesthesia System with Small Induction Box Harvard Apparatus #72-6468 See "4. In utero electroporation" (step 4.4 and 4.6 "nose cone", step 4.4 "induction chamber")
Ophthalmic ointment Hanna Pharmaceutical Supply Co #0536108691 See "4. In utero electroporation" (step 4.7 "veterinary ophthalmic ointment")
Space Gel (AIMS) VWR #95059-640 See "4. In utero electroporation" (step 4.8 "sealed pouch filled with supersaturated salt solution")
Hair Remover Gel Cream, Sensitive Formula Veet #062200809951 See "4. In utero electroporation" (step 4.9 "depilatory cream")
10ul Low Retention Tip Starter (960 tips/pk) Phenix Research Products TSP-10LKIT See "4. In utero electroporation" (step 4.12 "sterile 10 µL micropipette tip")
Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes Sigma-Aldrich A5177 See "4. In utero electroporation" (step 4.15 "aspirator tube assembly")
Braided Absorbable Suture, 4-0, Needle NFS-2(FS-2), 27" Medrepexpress MV-J397 See "4. In utero electroporation" (step 4.19 "absorbable sutures")
“LiquiVet Rapid” Tissue Adhesive Medrepexpress VG3 See "4. In utero electroporation" (step 4.20 "tissue adhesive")
Hypodermic syringes, polypropylene, Luer lock tip, capacity 1.0 mL Sigma-Aldrich Z551546-100EA See "4. In utero electroporation" (step 4.21 "1 mL syringe")
BD Precisionglide syringe needles gauge 26, L 1/2 in. Sigma-Aldrich Z192392-100EA See "4. In utero electroporation" (step 4.21 "26G, ½” needle")
Nestlets Nesting Material Ancare NES3600 See "4. In utero electroporation" (step 4.24 "nesting materials")
Sunflower Seeds, Black Oil, Sterile Bio-Serv S5137 See "4. In utero electroporation" (step 4.24 "sunflower seeds")
Paraformaldehyde, 97% Alfa Aesar A11313 See "5. Histology" (step 5.1.1 "PFA")
Economy Tweezers #3, 11 cm, 0.2 x 0.4 mm tips World Precision Instruments #501976 See "5. Histology" (step 5.5 "tweezers")
Agar powder Alfa Aesar #10752 See "5. Histology" (step 5.8.1 "agar")
Single-edge razor blades, #9 blade Stanley Tools #11-515 See "5. Histology" (step 5.9 "single-edge razor blade")
Specimen disc S D 50 mm Leica #14046327404 See "5. Histology" (step 5.9 "vibrating microtome specimen disc")
Buffer tray S assembly Leica #1404630132 See "5. Histology" (step 5.10 "buffer tray")
VT1000 S Vibratome Leica #14047235612 See "5. Histology" (step 5.10 "vibrating microtome")
Double Edge Razor Blades Personna BP9020 See "5. Histology" (step 5.10 "blade")
Knife Holder S Leica #14046230131 See "5. Histology" (step 5.10 "knife holder")
Studio Elements Golden Taklon Short Handle Round Brush Set Amazon B0089KU6XE See "5. Histology" (step 5.12.1 "fine tipped paintbrush")
Superfrost Plus Slides Electron Microscopy Services #71869-11 See "5. Histology" (step 5.12.1 "microscope slide")
ProLong Diamond Antifade Mountant, 10 ml Thermofisher P36970 See "5. Histology" (step 5.12.3-5.12.4 "mountant")
Cover Glass, 24 x 50 mm, No. 1 Phenix Research Products MS1415-10 See "5. Histology" (step 5.12.4 "coverslip")
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) Sigma-Aldrich D9542 See "5. Histology" (step 5.13.1 "DAPI")
Fixed Stage Upright Microscope Olympus BX51WI See "5. Histology" (step 5.15 "light microscope")
Laser Scanning Confocal Microscope Nikon TE2000/C2si See "5. Histology" (step 5.15 "confocal microscope")
4x objective, NA = 0.20 Nikon CFI Plan Apo Lambda 4X See "5. Histology" (step 5.15 "low-power objective")
20x objective, NA = 0.75 Nikon CFI Plan Apo Lambda 20X See "5. Histology" (step 5.15 "medium-power objective")
60x objective, NA = 1.40 Nikon CFI Plan Apo VC 60X Oil See "5. Histology" (step 5.15 "high-power objective")
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References

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Cre-lox RecombinationMouse Cerebral CortexIn Utero ElectroporationGenetic MosaicNeurobiologyLayer 2-3 Cortical NeuronsPipette PreparationEmbryonic Day 15.5AnesthesiaMouse Surgery

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Bland, K. M., Casey, Z. O., Handwerk, C. J., Holley, Z. L., Vidal, G. S. Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation. J. Vis. Exp. (129), e56675, doi:10.3791/56675 (2017).
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