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Neurosciences

子宮内エレクトロポレーション マウス大脳皮質における Cre lox 組換えを誘導します。

Published: November 17, 2017
doi:
10.3791/56675
, , , ,
1Department of Biology,James Madison University

Summary

脳における遺伝子の細胞の自律的機能損失を誘導することによって学ぶことができるまたは細胞のまばらな人口の機能を得る。ここでは、関数の vivoの損失を引き起こす floxed の遺伝子を持つ皮質ニューロンの開発のまばらな人口に Cre リコンビナーゼを提供する子宮内エレクトロポレーションについて述べる。

Abstract

遺伝子の細胞自律神経機能の損失を引き起こすことによって明らかになることやニューロンの小さく、まばらな人口の遺伝子の機能を得る。そうニューロンの損失または遺伝子の機能のゲインが遺伝的摂動組織に囲まれているモザイクを生成する必要があります。ここでは、我々 はニューロンの遺伝子の細胞の自律的機能を研究するために使用できるモザイク脳組織を生成するために子宮内でエレクトロポレーションと Cre lox 組換えシステムを組み合わせます。DNA コンストラクト (リポジトリを通じて利用可能)、蛍光ラベルと Cre リコンビナーゼのコーディングが両脇に loxP サイトで子宮を用いたマウス胚の脳における遺伝子を含む皮質ニューロンの開発に導入します。エレクトロポレーション。さらに、子宮内でエレクトロポレーション法の存続性と再現性を向上させる様々 な適応について述べる。このメソッドはまた、ニューロンのスパースまたは密な人口の Cre 介する組み換え価を確立します。ラベル付けされた脳組織の組織学的準備を必要としない (しかしに合わせることができる) の免疫組織化学。使用構造を保証する蛍光ニューロン キャリー Cre リコンビナーゼの遺伝子に分類します。組織学的準備は、アーバーの樹状突起と軸索と樹状突起スパインの共焦点イメージングによるニューロンの形態素解析を許可します。損失または利得関数のスパース モザイク組織で実現するため、このメソッドは、遺伝子製品生体内での細胞の自律的必要性の検討とを許可します。

Introduction

興味の遺伝子の機能を理解するための古典的な実験パラダイムは、遺伝のモザイクを生成します。遺伝子は細胞の表現型に必要なかどうかを決定するには、最も簡単な方法は有機体 (例えばノックアウト) を通して遺伝子の機能の損失を引き起こしています。ただし、遺伝子が特定の細胞型で特に必要なかどうかを決定、生物全体の遺伝子のノックアウトは有効なアプローチではありません。代わりに、メソッドが必要なしの野生型 (すなわち遺伝的摂動) 組織に囲まれている間特定のセルに遺伝子の機能の損失と、-つまり、モザイク組織を作成します。突然変異体の細胞が突然変異体の表現型を示していますが、周囲の野生型細胞は、細胞自律的方法で遺伝子機能。解析モザイク組織、変異細胞が野生型組織に囲まれているは、遺伝子、特にニューロンとグリア細胞が組織の広大な相互接続ネットワークを形成する脳の細胞の自律的機能の理解に最適です。

モザイク脳組織のいくつかのフォームは、遺伝子の細胞の自律的機能を調べるための強力なモデルを提供しています。神経移植1、女性 X-リンクされてモザイク2,3,4に焦点を当てた研究とモザイクに基づいて彼らの結論を描画している内因性の体細胞モザイク5,6脳組織。Cre lox 組換えシステムを介して遺伝子の条件削除は、トランスジェニック マウス線の偉大な可用性を最大限に活用する方法です。このメソッドは、loxP サイト同じ方向 (“floxed”) の両方の顔が並ぶそれを残して (エクソン) など遺伝子の必要なシーケンスのいずれかの側で 2 つの loxP サイトを紹介しています。Cre リコンビナーゼ loxP サイト7間のシーケンスを切り取る。Cre を介する組み換えは、セル (「Cre 記者ライン」) のサブセットに蛍光マーカーと一緒に Cre リコンビナーゼを表現する別のマウス線横断 floxed マウスで実現できます。これは、さまざまな興奮性神経細胞やアストロ サイト8などの細胞のサブセットの遺伝子の機能を明らかにする方法で実証されています。Cre 記者行クレエT2 (単一ニューロン誘導 Cre を介したノックアウトまたは滑らかでラベル付け) という薬物誘導する Cre を介した結合を許可するを表すことができます9。ダブル マーカー (MADM)10,11モザイク解析と呼ばれる別の戦略、Cre を介した染色体間組換えホモ接合体変異ヘテロ接合体組織と一緒に作成することができます。これらのアプローチのマウスの新しい行は各候補遺伝子またはテストされる細胞のサブタイプのたびに生成される必要があります。イオントフォレシス12通したり、ウイルスのベクトル (例えばアデノ随伴ウイルス13またはレンチ14細胞サブタイプに固有を運ぶ Cre リコンビナーゼを後天的導入できる代わりに、発起人)。この戦略は、強いと生後のラベルを作成します。まばらと胎生期大脳皮質ニューロンの開発を対象とするには、理想的な戦略は蛍光マーカーで Cre リコンビナーゼのエレクトロポレーション子宮内です。

体内組織モザイク エレクトロポレーション子宮内で生成する Cre lox 再結合を結合することに加えて、その他公開プロトコルから15,16、手順にいくつかの適応を紹介 17,18,19,20,21。繁殖タイミング妊娠した女性の成功を改善するために情報を提供いたします。我々 はまた、大脳皮質組織の神経細胞の疎と明るいラベリングを導入する我々 の 2 つの戦略を概説: Cre リコンビナーゼの蛍光マーカー22single コンストラクト コーディングのレベルを滴定する戦略の 1 つです。別の戦略は、心23,24でこれらのパラメーターを具体的に設計された「超新星」システムを使用することです。さらに、一貫性のあるマイクロインジェクション ピペットと子宮の穿孔手術を簡素化の生産の改善を提供しています。最後に、我々 はさらに汚れるか、または免疫組織化学を樹状突起スパインの樹状突起と軸索のアーバー、分析できる簡易組織の準備で重要な手順を概説します。

Protocol

ここで説明する方法は、やすべての関連する規制・制度のガイドラインの遵守動物ケアおよび使用委員会 (ACUC) のジェームズ ・ マディソン大学によって承認されています。 1. マウスのセットアップ 若者の家 (> P60) ブリーダー ペア25を設定する一緒に男性と女性のホモ floxed マウス。注: 良いネガティブ コントロールする Cre リコンビナーゼ式…

Representative Results

シングルは、GFP を構築します。Cre は E15.5 で electroporated をされ、P14 の可視化 (材料の一覧を参照してください)。コンストラクトの濃度や注入量、に応じてスパースまたは高密度の結果22,26を取得できます。たとえば、2 mg/mL GFP の 1 μ l 注入。明るい (図 1 a)、および、ローカライズされた層 II/III (<strong…

Discussion

モザイク脳組織を生成する floxed マウスにおける Cre リコンビナーゼとエレクトロポレーションの子宮内の組み合わせを紹介します。このアプローチの利点は、新しいマウス行が異なる細胞サブタイプが対象とするたびに生成する必要はありません: 興奮性ニューロン、抑制ニューロンまたは時間によってグリア細胞を対象に子宮内でエレクトロポレーションを使用できますエレ?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者らは、ジェームズ ・ マディソン大学生物教室・ ジェームズ ・ マディソン大学光顕微鏡イメージング施設の寛大なサポートをありがとうございます。夫妻ジャスティン ・ w ・ ブラウンとコーリー ・ l ・ クレランド手術材料と空間の寛大な調整のために博士マーク ・ l ・ ガブリエレ若い生後ティッシュの準備、に関する有益な助言を。この研究はだった 4-バージニア州、連邦のバージニア州 (G.S.V.) を推進するための共同パートナーシップとによってバージニア州アカデミーの科学小プロジェクト研究助成金 (G.S.V.) 共同研究助成金によって一部で賄われて。学部研究生奨学金 (K.M.B.) に、ファレル夏研究奨学金 (K.M.B.) をジェームズ ・ マディソン大学第 2 世紀への奨学金 (K.M.B.)、寛大サポート ベティ Jo 愛するバトラー 58年基金によって提供されているジェームズマディソン大学百周年記念奨学金 (C.J.H.) に、ジェームズ ・ マディスン大学ルーシー ロビンソン検索 30年記念奨学金 (Z.L.H.) に、科学と数学教員援助交付金 (G.S.V.) にジェームズ ・ マディソン大学。

Materials

C57BL/6J mice The Jackson Laboratory #000664 See "1. Mouse set-up" (step 1.1, "wildtype mice")
GFP.Cre empty vector AddGene #20781 See "2. DNA set-up" (step 2.1 "single DNA construct that codes for Cre recombinase as well as a fluorescent marker"). GFP.Cre empty vector was a gift from Tyler Jacks.
pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) AddGene #69138 See "2. DNA set-up" (step 2.1 "Supernova" system) and http://snsupport.webcrow.jp/. pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) was a gift from Takuji Iwasato.
pK031.TRE-Cre (Supernova) AddGene #69136 See "2. DNA set-up" (step 2.1 "Supernova" system) and http://snsupport.webcrow.jp/. pK031.TRE-Cre (Supernova) was a gift from Takuji Iwasato.
pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) AddGene #85006 See "2. DNA set-up" (step 2.1 "Supernova" system) and http://snsupport.webcrow.jp/. pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) was a gift from Takuji Iwasato.
EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) Qiagen #12362 See "2. DNA set-up" (step 2.3 "endotoxin-free plasmid purification kit")
Trypan Blue powder, BioReagent grade Sigma T6146-5G See "2. DNA set-up" (step 2.5 "trypan blue")
Sodium Chloride, ACS, 2.5 kg VWR BDH9286-2.5KG See "2. DNA set-up" (step 2.5 "NaCl")
Potassium Chloride, ACS, 500 g VWR #97061-566 See "2. DNA set-up" (step 2.5 "KCl")
Sodium phosphate dibasic, ReagentPlus, 100 g Sigma-Aldrich S0876-100G See "2. DNA set-up" (step 2.5 "Na2HPO4")
Potassium phosphate monobasic, ReagentPlus, 100 g Sigma-Aldrich P5379-100G See "2. DNA set-up" (step 2.5 "KH2PO4")
Hydrochloric acid, ACS reagent, 500 mL Fisher Scientific A144-500 See "2. DNA set-up" (step 2.5 "HCl")
P-97 Micropipette Puller Sutter Instrument P-97 See "3. Pipette set-up" (step 3.1 "glass capillary puller")
3.0 mm wide trough filament Sutter Instrument FT330B See "3. Pipette set-up" (step 3.1 "glass capillary puller")
Thin Wall Glass Capillaries, 4", 1 / 0.75 OD/ID World Precision Instruments TW100-4 See "3. Pipette set-up" (step 3.1.1 "glass capillary")
Single Ply Soft-Tech Wipes, 4.5" Phenix LW-8148 See "3. Pipette set-up" (step 3.2.1 "single-ply task wipe"); other single-ply wipes (e.g. Kimwipes) can be used.
Graefe Forceps, 7 cm, Straight, 0.7 mm 1×2 Teeth World Precision Instruments #14140 See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "Graefe forceps")
Iris Scissors, 11.5 cm, Straight, 12-pack World Precision Instruments #503708-12 See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "iris scissors")
Hartman Mosquito Forceps, 9 cm, Straight, 12-pack World Precision Instruments #503728-12 See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "Hartman mosquito forceps")
General Purpose Non-Woven Sponges, 2" x 2", 4-ply Medrepexpress #2204-c See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "non-woven gauze sponges")
Ring Tipped Forceps, 10 cm, Straight, 2.2mm ID World Precision Instruments #503203 See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "ring-tipped forceps")
Pyrex petri dishes complete, O.D. × H 100 mm × 20 mm Sigma-Aldrich CLS3160102-12EA See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "Petri dishes")
Flat Type Instrument Tray, Stainless Steel, 13-5/8" x 9-3/4" x 5/8" Amazon B007SHGAHA See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "stainless steel tray")
Platinum Tweezertrode, 5 mm BTX #45-0489 See "4. In utero electroporation" (step 4.3 and 4.16 "tweezer-type electrodes")
ECM 830 Foot Pedal BTX #45-0211 See "4. In utero electroporation" (step 4.3 and 4.17 "foot pedal")
ECM 830 Generator BTX #45-0052 See "4. In utero electroporation" (step 4.3 "generator")
Single Animal Isoflurane Anesthesia System with Small Induction Box Harvard Apparatus #72-6468 See "4. In utero electroporation" (step 4.4 and 4.6 "nose cone", step 4.4 "induction chamber")
Ophthalmic ointment Hanna Pharmaceutical Supply Co #0536108691 See "4. In utero electroporation" (step 4.7 "veterinary ophthalmic ointment")
Space Gel (AIMS) VWR #95059-640 See "4. In utero electroporation" (step 4.8 "sealed pouch filled with supersaturated salt solution")
Hair Remover Gel Cream, Sensitive Formula Veet #062200809951 See "4. In utero electroporation" (step 4.9 "depilatory cream")
10ul Low Retention Tip Starter (960 tips/pk) Phenix Research Products TSP-10LKIT See "4. In utero electroporation" (step 4.12 "sterile 10 µL micropipette tip")
Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes Sigma-Aldrich A5177 See "4. In utero electroporation" (step 4.15 "aspirator tube assembly")
Braided Absorbable Suture, 4-0, Needle NFS-2(FS-2), 27" Medrepexpress MV-J397 See "4. In utero electroporation" (step 4.19 "absorbable sutures")
“LiquiVet Rapid” Tissue Adhesive Medrepexpress VG3 See "4. In utero electroporation" (step 4.20 "tissue adhesive")
Hypodermic syringes, polypropylene, Luer lock tip, capacity 1.0 mL Sigma-Aldrich Z551546-100EA See "4. In utero electroporation" (step 4.21 "1 mL syringe")
BD Precisionglide syringe needles gauge 26, L 1/2 in. Sigma-Aldrich Z192392-100EA See "4. In utero electroporation" (step 4.21 "26G, ½” needle")
Nestlets Nesting Material Ancare NES3600 See "4. In utero electroporation" (step 4.24 "nesting materials")
Sunflower Seeds, Black Oil, Sterile Bio-Serv S5137 See "4. In utero electroporation" (step 4.24 "sunflower seeds")
Paraformaldehyde, 97% Alfa Aesar A11313 See "5. Histology" (step 5.1.1 "PFA")
Economy Tweezers #3, 11 cm, 0.2 x 0.4 mm tips World Precision Instruments #501976 See "5. Histology" (step 5.5 "tweezers")
Agar powder Alfa Aesar #10752 See "5. Histology" (step 5.8.1 "agar")
Single-edge razor blades, #9 blade Stanley Tools #11-515 See "5. Histology" (step 5.9 "single-edge razor blade")
Specimen disc S D 50 mm Leica #14046327404 See "5. Histology" (step 5.9 "vibrating microtome specimen disc")
Buffer tray S assembly Leica #1404630132 See "5. Histology" (step 5.10 "buffer tray")
VT1000 S Vibratome Leica #14047235612 See "5. Histology" (step 5.10 "vibrating microtome")
Double Edge Razor Blades Personna BP9020 See "5. Histology" (step 5.10 "blade")
Knife Holder S Leica #14046230131 See "5. Histology" (step 5.10 "knife holder")
Studio Elements Golden Taklon Short Handle Round Brush Set Amazon B0089KU6XE See "5. Histology" (step 5.12.1 "fine tipped paintbrush")
Superfrost Plus Slides Electron Microscopy Services #71869-11 See "5. Histology" (step 5.12.1 "microscope slide")
ProLong Diamond Antifade Mountant, 10 ml Thermofisher P36970 See "5. Histology" (step 5.12.3-5.12.4 "mountant")
Cover Glass, 24 x 50 mm, No. 1 Phenix Research Products MS1415-10 See "5. Histology" (step 5.12.4 "coverslip")
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) Sigma-Aldrich D9542 See "5. Histology" (step 5.13.1 "DAPI")
Fixed Stage Upright Microscope Olympus BX51WI See "5. Histology" (step 5.15 "light microscope")
Laser Scanning Confocal Microscope Nikon TE2000/C2si See "5. Histology" (step 5.15 "confocal microscope")
4x objective, NA = 0.20 Nikon CFI Plan Apo Lambda 4X See "5. Histology" (step 5.15 "low-power objective")
20x objective, NA = 0.75 Nikon CFI Plan Apo Lambda 20X See "5. Histology" (step 5.15 "medium-power objective")
60x objective, NA = 1.40 Nikon CFI Plan Apo VC 60X Oil See "5. Histology" (step 5.15 "high-power objective")
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References

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Cre-lox RecombinationMouse Cerebral CortexIn Utero ElectroporationGenetic MosaicNeurobiologyLayer 2-3 Cortical NeuronsPipette PreparationEmbryonic Day 15.5AnesthesiaMouse Surgery

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Bland, K. M., Casey, Z. O., Handwerk, C. J., Holley, Z. L., Vidal, G. S. Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation. J. Vis. Exp. (129), e56675, doi:10.3791/56675 (2017).
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